人主动脉周围血管脂肪前体细胞的分化潜能

摘要

本实验方案的目的是检测来源于人血管周围脂肪组织的前体细胞向多个细胞谱系分化的能力。将这种分化能力与来源于人骨髓的间充质干细胞进行比较，后者已知可分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞谱系。

摘要

脂肪组织是具有多向分化潜能的间充质干细胞（MSC）的丰富来源，这类细胞能够分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞谱系。前体细胞的脂肪生成分化是肥胖状态下脂肪组织扩张及功能障碍的主要机制之一。因此，了解血管周围脂肪组织（PVAT）的变化在代谢性疾病中具有重要的临床意义。然而，以往的研究主要在小鼠及其他动物模型中进行。本实验方案采用接受冠状动脉旁路移植术的患者所获取的人胸主动脉PVAT样本。采集升主动脉周围的脂肪组织，并用于分离基质血管组分。我们此前已证实，在人PVAT中存在具有分化为含脂滴脂肪细胞能力的脂肪前体细胞。在本研究中，我们进一步分析了来自基质血管组分的细胞的分化潜能，这些细胞可能包含多能性前体细胞。我们将PVAT来源的细胞与人骨髓MSC在向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞谱系分化方面的能力进行了比较。在诱导分化14天后，采用特异性染色方法检测脂肪细胞中的脂质积聚（油红O染色）、成骨细胞中的钙化沉积（茜素红染色）或软骨细胞中的糖胺聚糖和胶原（Masson三色染色）。结果显示，骨髓MSC可高效分化为上述三种谱系，而PVAT来源的细胞虽具备脂肪生成和软骨生成潜能，但缺乏显著的成骨分化能力。

引言

脂肪组织是多能间充质干细胞（MSC）的丰富来源，这类细胞能够分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞谱系¹。该组织通过成熟脂肪细胞的肥大以及组织驻留MSC向脂肪细胞的新生分化而扩张。血管周围脂肪组织（PVAT）包绕血管，调节血管功能^2,3。肥胖引起的PVAT扩张会加剧心血管疾病病理进程。尽管来源于人体皮下脂肪库的MSC多向分化潜能已被广泛研究^4,5，但尚无研究对人PVAT来源的前体细胞进行分离并评估其分化能力，这可能是因为获取此类组织具有侵入性。因此，本研究旨在建立一种方法，用于从患有心血管疾病的患者主动脉PVAT中分离和扩增前体细胞，并检测其向成骨、软骨和脂肪谱系分化的潜能。我们的PVAT来源为肥胖患者接受冠状动脉旁路移植术时，升主动脉旁路移植物吻合部位的组织。新鲜分离的PVAT通过酶消化法解离，分离出基质血管组分并在体外进行扩增，从而首次实现对人PVAT来源前体细胞分化能力的检测。

利用原代培养的人类血管周围脂肪组织（PVAT）基质血管组分，我们测试了三种诱导干细胞/前体细胞向脂肪细胞系、成骨细胞系或软骨细胞系分化的实验方法。我们先前的研究鉴定出一群CD73+、CD105+和PDGFRa+（CD14....

方案

本研究中使用的人体组织已通过缅因州医疗中心机构审查委员会的评估和批准，所有人员在实验前均接受了适当的培训。

1. 准备工作

1. 通过将50 mg无动物源性胶原酶/分散酶混合物I溶解于1 mL纳米纯H₂O中配制消化缓冲液。将复溶后的胶原酶/分散酶溶液加入含1% w/v BSA的49 mL高糖DMEM中，制备成1 mg/mL的工作液。分装为5 mL每份，于-20 °C保存；使用前在水浴中预热至37 °C。
2. 将1 mL 100倍浓度抗生素/抗真菌素溶液（终浓度为200单位/mL青霉素、200单位/mL链霉素和0.5 µg/mL两性霉素B）加入49 mL HBSS中配制抗生素溶液，并置于冰上保存。
3. 通过将200 mg牛皮来源的明胶溶解于100 mL纳米纯H₂O中配制0.2% w/v明胶溶液。121°C高压灭菌20分钟，4 °C保存。
4. 配制500 mL PVAT生长培养基：高糖DMEM/F12，添加谷氨酰胺补充剂、丙酮酸钠和碳酸氢钠，并补充10%胎牛血清（FBS）和100 µg/mL抗菌剂（参见材料表）。
5. 配制50 mL成脂诱导培养基：40.8 mL高糖DMEM，补充7.5 mL PVAT生长培养基、500 µL 100倍浓度抗生素/抗真菌素溶液（终浓度为100单位/mL青霉素、100单位/mL链霉素和0.25....

结果

从人PVAT中分离基质血管组分

图1A 显示了获取覆盖升主动脉的血管周围脂肪组织（PVAT）的解剖区域示意图。我们此前已描述过接受冠状动脉旁路移植术的患者群体，这些样本即来源于此⁶. 图1B 显示了手术后获得的人体PVAT示例。 图1C 显示了用Masson三色染色法染色的代表性PVAT组织切片。 图1D 是一张相衬显微照片，显示分化前扩增阶段的PVAT来源基质细胞群体。这些细胞可进行扩增并冻存以供后续使用。细胞通常以2.5 x 10⁶ cells/mL的密度冻存。⁵ 细胞/mL，置于由70% FBS、20%基础（.......

讨论

不同来源的脂肪祖细胞在表型和分化潜能方面存在显著差异⁹。将来自同一患者供体的血管周围脂肪组织（PVAT）来源祖细胞同时诱导向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞三个不同谱系分化，可对这群新型祖细胞的多能性进行严格对照的研究。本报告中描述的方法可用于检测人PVAT来源祖细胞的分化能力，并有助于理解其在调控PVAT病理变化及血管张力中的功能。该技术的优势在于操作简便，并利用冠状动脉旁路移植术患者的原代人体组织，从而能够研究严重心血管疾病患者PVAT祖细胞的功能。然而，从500 mg组织样本中获得的外植块通常仅能收获<1000个贴壁细胞，因此需要经过5–7次传代才能获得足够数量的细胞，这是该方法的一个重要局限性。三谱系分化实验成功的关键在于初始细胞外植块的质量。在酶解消化前，必须将组织充分剪碎至细小颗粒。此外，与其他外植块培养方案不同的是，我们发现，在接种前使用红细胞裂解液会导致细胞数量、存活率及整体质量显著下降。因此，强烈建议将整个基质血管组分（包括红细胞）直接接种。24小时后，贴壁细胞已附着，未裂解的红细胞可通过反复用HBSS洗涤去除。PVAT来源基质细胞的传代比例不应超过1:2。当传代比例.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无动物源性胶原酶/分散酶混合液 I	Millipore-Sigma	SCR139	50mg
阿新蓝	NewComerSupply	1003A	1% 水溶液，pH 2.5
茜素红	Amresco	9436-25G
α-MEM	ThermoFisher	12561056
苯胺蓝	NewComerSupply	10073C
抗生素/抗真菌剂	ThermoFisher	15240062
比布里希猩红酸性品红	Millipore-Sigma	A3908-25G
β-甘油磷酸钠	Millipore-Sigma	G9422-10G
比布里希猩红	EKI	2248-25G
生物素	Millipore-Sigma	B4501-100MG
布因氏固定液	NewComerSupply	1020A
牛血清白蛋白	Calbiochem	12659	4 °C 保存
细胞解离液	Accutase	AT104
贝尔式滤筛（70 mm）	Corning	352350
地塞米松	Millipore-Sigma	D4902-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	含 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠
DMEM/F12 培养基	ThermoFisher	10565-042	高糖，含 GlutaMAX 和碳酸氢钠
DMSO	Millipore-Sigma	D2650
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11550
FGF2	Peprotech	100-18B
福尔马林	NewComerSupply	1090
明胶（牛皮来源）	Millipore-Sigma	G9391-500G
GlutaMAX	ThermoFisher	35050061	谷氨酰胺补充剂
HBSS	Lonza	10-547F
IBMX	Millipore-Sigma	I5879-250MG
胰岛素溶液	Millipore-Sigma	I9278-5ML
油红 O	Millipore-Sigma	O0625-100G
泛酸	Millipore-Sigma	P5155-100G
青霉素-链霉素溶液	ThermoFisher	15240062	100ml
Permount	Fisher	SP15-500
磷钨酸/磷钼酸溶液	Millipore-Sigma	P4006-100G/221856-100G
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	用于培养基的抗菌试剂。
罗格列酮	Millipore-Sigma	R2408-10MG
TGFb1	Peprotech	100-21
魏格特氏苏木精	EKI	4880-100G