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人主动脉周围血管脂肪前体细胞的分化潜能

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DOI：

10.3791/59337

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2019年3月5日

 ,  ,  ,  , 
1Maine Medical Center Research Institute

本文内容

摘要

本实验方案的目的是检测来源于人血管周围脂肪组织的前体细胞向多个细胞谱系分化的能力。将这种分化能力与来源于人骨髓的间充质干细胞进行比较，后者已知可分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞谱系。

摘要

脂肪组织是具有多向分化潜能的间充质干细胞（MSC）的丰富来源，这类细胞能够分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞谱系。前体细胞的脂肪生成分化是肥胖状态下脂肪组织扩张及功能障碍的主要机制之一。因此，了解血管周围脂肪组织（PVAT）的变化在代谢性疾病中具有重要的临床意义。然而，以往的研究主要在小鼠及其他动物模型中进行。本实验方案采用接受冠状动脉旁路移植术的患者所获取的人胸主动脉PVAT样本。采集升主动脉周围的脂肪组织，并用于分离基质血管组分。我们此前已证实，在人PVAT中存在具有分化为含脂滴脂肪细胞能力的脂肪前体细胞。在本研究中，我们进一步分析了来自基质血管组分的细胞的分化潜能，这些细胞可能包含多能性前体细胞。我们将PVAT来源的细胞与人骨髓MSC在向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞谱系分化方面的能力进行了比较。在诱导分化14天后，采用特异性染色方法检测脂肪细胞中的脂质积聚（油红O染色）、成骨细胞中的钙化沉积（茜素红染色）或软骨细胞中的糖胺聚糖和胶原（Masson三色染色）。结果显示，骨髓MSC可高效分化为上述三种谱系，而PVAT来源的细胞虽具备脂肪生成和软骨生成潜能，但缺乏显著的成骨分化能力。

引言

脂肪组织是多能间充质干细胞（MSC）的丰富来源，这类细胞能够分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞谱系1。该组织通过成熟脂肪细胞的肥大以及组织驻留MSC向脂肪细胞的新生分化而扩张。血管周围脂肪组织（PVAT）包绕血管，调节血管功能2,3。肥胖引起的PVAT扩张会加剧心血管疾病病理进程。尽管来源于人体皮下脂肪库的MSC多向分化潜能已被广泛研究4,5，但尚无研究对人PVAT来源的前体细胞进行分离并评估其分化能力，这可能是因为获取此类组织具有侵入性。因此，本研究旨在建立一种方法，用于从患有心血管疾病的患者主动脉PVAT中分离和扩增前体细胞，并检测其向成骨、软骨和脂肪谱系分化的潜能。我们的PVAT来源为肥胖患者接受冠状动脉旁路移植术时，升主动脉旁路移植物吻合部位的组织。新鲜分离的PVAT通过酶消化法解离，分离出基质血管组分并在体外进行扩增，从而首次实现对人PVAT来源前体细胞分化能力的检测。

利用原代培养的人类血管周围脂肪组织（PVAT）基质血管组分，我们测试了三种诱导干细胞/前体细胞向脂肪细胞系、成骨细胞系或软骨细胞系分化的实验方法。我们先前的研究鉴定出一群CD73+、CD105+和PDGFRa+（CD140a）细胞，这类细胞能够高效分化为脂肪细胞6，但其多向分化潜能尚未被检测。PVAT可直接调控血管张力和炎症反应7。测试这一新型细胞群体分化潜能的目的是初步揭示PVAT对血管功能的特异性影响，以及肥胖过程中PVAT扩张的机制。本方法有助于加深对脂肪组织来源前体细胞功能的理解，并使我们能够识别和比较来自不同组织来源前体细胞之间的相似性与差异性。我们在已建立并经过验证的间充质干细胞分离与多向分化技术基础上，优化实验流程，以最大限度地提高人源PVAT来源前体细胞的存活率。这些技术在干细胞与前体细胞研究以及脂肪组织发育领域具有广泛的应用价值。

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方案

本研究中使用的人体组织已通过缅因州医疗中心机构审查委员会的评估和批准，所有人员在实验前均接受了适当的培训。

1. 准备工作

  1. 通过将50 mg无动物源性胶原酶/分散酶混合物I溶解于1 mL纳米纯H2O中配制消化缓冲液。将复溶后的胶原酶/分散酶溶液加入含1% w/v BSA的49 mL高糖DMEM中，制备成1 mg/mL的工作液。分装为5 mL每份，于-20 °C保存；使用前在水浴中预热至37 °C。
  2. 将1 mL 100倍浓度抗生素/抗真菌素溶液（终浓度为200单位/mL青霉素、200单位/mL链霉素和0.5 µg/mL两性霉素B）加入49 mL HBSS中配制抗生素溶液，并置于冰上保存。
  3. 通过将200 mg牛皮来源的明胶溶解于100 mL纳米纯H2O中配制0.2% w/v明胶溶液。121°C高压灭菌20分钟，4 °C保存。
  4. 配制500 mL PVAT生长培养基：高糖DMEM/F12，添加谷氨酰胺补充剂、丙酮酸钠和碳酸氢钠，并补充10%胎牛血清（FBS）和100 µg/mL抗菌剂（参见材料表）。
  5. 配制50 mL成脂诱导培养基：40.8 mL高糖DMEM，补充7.5 mL PVAT生长培养基、500 µL 100倍浓度抗生素/抗真菌素溶液（终浓度为100单位/mL青霉素、100单位/mL链霉素和0.25 µg/mL两性霉素B）、0.5 mM IBMX（0.1 M NaOH中500 mM母液）、1 µM地塞米松（乙醇中1 mM母液）、5 µM罗格列酮（DMSO中5 mM母液）、33 µM生物素（DMSO中66 mM母液）、100 nM胰岛素（0.1%乙酸中200 µM母液）和20 µM泛酸（H2O中100 mM母液）。
  6. 为成脂谱系配制50 mL对照诱导培养基：40.8 mL高糖DMEM，补充7.5 mL PVAT生长培养基和500 µL青霉素-链霉素溶液（100倍浓度母液）。
  7. 配制50 mL成脂维持培养基：41.5 mL高糖DMEM，补充7.5 mL第1.3步制备的PVAT生长培养基、500 µL青霉素-链霉素溶液（100倍浓度母液）、1 µM地塞米松（乙醇中1 mM母液）、33 µM生物素（DMSO中66 mM母液）、100 nM胰岛素（0.1%乙酸中200 µM母液）和20 µM泛酸（H2O中100 mM母液）。
  8. 配制500 mL成骨和成软骨谱系的生长培养基：高糖αMEM，补充10% FBS、1倍浓度谷氨酰胺补充剂（参见材料表）和5 mL青霉素-链霉素溶液（100倍浓度母液）。
  9. 配制50 mL成骨诱导培养基：50 mL骨髓间充质干细胞（MSC）生长培养基，补充10 nM地塞米松和10 mM β-甘油磷酸钠。
  10. 配制50 mL成软骨诱导培养基：50 mL骨髓间充质干细胞（MSC）生长培养基，补充100 nM地塞米松、50 µg/mL抗坏血酸-2-磷酸钠和10 ng/mL TGFβ1。对于成骨和成软骨条件，基础骨髓MSC生长培养基将作为非诱导对照培养基。

2. 方案1：从基质血管组分培养人PVAT细胞

注意：在全身麻醉下接受冠状动脉旁路移植术的患者中，血管周围脂肪组织（PVAT）从升主动脉吻合部位切除。切除的主动脉 PVAT 置于含有 10 mL 冰冷高糖 DMEM F12 培养基的 15 mL 锥形管中，并在切除后 2 小时内从手术室转移至实验室。主动脉 PVAT 为手术过程中废弃的组织，已被缅因医学中心机构审查委员会认定不属于人类受试者研究范畴。

  1. 本方案适用于约 500 mg 的人源 PVAT 组织（尺寸约为 3 × 1 × 0.5 cm3）。将新鲜的人源 PVAT 从 DMEM 转移至含有 25 mL 抗生素溶液的 50 mL 锥形管中，在 4 °C 条件下轻轻摇动孵育 20 分钟。在 PVAT 孵育于抗生素溶液期间，将一份解离缓冲液在 37 °C 下解冻。
  2. 向 5 mL 解离缓冲液中加入 50 µL 的 100 倍浓缩抗生素/抗真菌溶液，并使用 0.22 µm 注射器滤器进行灭菌。向 24 孔板的一个孔中加入 1 mL 明胶溶液。在超净工作台中，使用无菌镊子和剪刀将 PVAT 从抗生素溶液转移至无菌培养皿中。向组织中加入 1 mL 预热的解离缓冲液，使用无菌镊子和解剖剪将整个组织精细剪碎成浆状（无大于约 2 × 2 mm2 的组织块）。
  3. 将 1 mL 浆状物转移至 4 mL 解离缓冲液中，将管子水平放置于预热至 37 °C、转速为 200 rpm 的轨道摇床上孵育 1 小时。1 小时后，应无可见组织块，溶液呈现浑浊的细胞悬液状态。
  4. 将溶液通过置于 50 mL 锥形管上方的 70 µm 细胞滤筛进行过滤。用额外的 10 mL 抗生素溶液冲洗滤筛，以尽可能回收细胞。切勿挤压滤筛。
  5. 在摆桶式离心机中以 300 × g 离心 12 分钟，使细胞沉淀。
    注意：离心后，管内液体将分为上层脂肪层（脂肪细胞）、中间界面层和沉淀层。沉淀层即为基质血管组分（SVF），包含内皮细胞、免疫细胞、血细胞及前体细胞。
  6. 用 10 mL HBSS 重悬沉淀，并以 300 × g 离心 5 分钟。重复此步骤，共在 HBSS 中洗涤两次。最后一次洗涤后，不要裂解红细胞。多次尝试使用多种市售裂解缓冲液及不同孵育时间，均导致前体细胞的贴壁能力与存活率显著下降。
  7. 吸除 24 孔板中的明胶溶液。用 HBSS 轻柔洗涤孔壁一次，以去除未结合的明胶。
  8. 将含有完整红细胞的基质血管组分沉淀用 1 mL 生长培养基重悬，并接种至包被明胶的孔中。向培养基中加入人源 FGF2（用含 0.01% BSA w/v 的 PBS 重悬），使其终浓度为 25 ng/mL。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时。
  9. 次日，吸除生长培养基，并用 HBSS 洗涤孔壁 5 次，以去除红细胞和死细胞。向孔中加入 1 mL 新鲜生长培养基，补充 25 ng/mL FGF2。
  10. 每 48 小时更换一次培养基，每次均需补充新鲜 FGF2 至终浓度 25 ng/mL。
  11. 细胞通常在组织块贴壁后 7–10 天达到 100% 汇合；此时进行传代：
    1. 吸除生长培养基，用 1 mL HBSS 洗涤单层细胞两次。吸净孔中所有 HBSS，加入数滴细胞解离溶液。
    2. 轻轻敲击并旋转培养板数次，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5–7 分钟，使细胞脱落。向脱落的细胞中加入约 1 mL 新鲜培养基，将 500 µL 分装至 24 孔板的两个孔中，每孔预先含有 500 µL 生长培养基和 25 ng FGF2。
  12. 继续按照上述步骤扩增人源 PVAT 来源细胞。每次传代扩增比例不得超过 1:2。在用于分化实验前，细胞应传代 5–7 次。

3. 方案2：培养人骨髓间充质干细胞克隆集落

注意： 人骨髓间充质干细胞的分离方法如前所述8 以约100,000个细胞/mL的密度，将细胞悬浮于冻存液（70% FBS、20%基础DMEM和10% DMSO）中，作为早期传代冻存株保存于液氮中2.

  1. 迅速从液氮中解冻一管骨髓间充质干细胞（MSC）2 在37 °C水浴中解冻后，接种至含3 mL MSC生长培养基的6孔培养板中的一个孔，于37°C和5% CO₂条件下过夜培养2.
  2. 第二天，吸除间充质干细胞培养基，用 2 mL HBSS 洗涤细胞 3 次。当细胞融合度达到 100% 时，吸除生长培养基，用 2 mL HBSS 洗涤细胞 3 次。每孔加入 500 µL 细胞解离溶液，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 孵育5分钟。轻敲培养板以确保所有细胞脱落，并将内容物均匀分配至含2 mL MSC生长培养基的6孔板中的2个孔。
  3. 平行扩增人骨髓和PVAT来源的MSC，约传代5–7次，或直至获得足够的检测用量。

4. 方案3：成脂、成骨和成软骨细胞系的铺板与诱导

  1. 在12孔板的每个孔中接种适量数量的骨髓和PVAT来源细胞，并为每种实验条件设置适当的重复。对于成脂和成骨条件，每孔需要约200,000–225,000个细胞；对于成软骨条件，每孔需要150,000–175,000个细胞。
    注意：对于每种实验谱系的对照和诱导条件，我们至少进行了N = 3个重复孔，共进行2次独立实验（总计N = 6个重复）。
  2. 使用细胞解离溶液，在37 °C和5% CO2条件下孵育5分钟，将人PVAT前体细胞群体和人骨髓间充质干细胞（MSC）群体从培养皿中解离。将细胞分别收集至两个15 mL锥形离心管中。在500 × g条件下离心7分钟以沉淀细胞。用1 mL PBS重悬细胞，并使用血细胞计数板估算细胞数量。
  3. 按照步骤4.1所述，将细胞接种至12孔板中。为诱导和非诱导的成脂、成骨及成软骨条件分别提供独立的培养孔，以便在较早时间点固定非诱导组样本，而不干扰诱导组的持续培养。
  4. 向诱导组各孔中加入1.5 mL成脂和成骨诱导培养基。向非诱导组各孔中加入1.5 mL成脂和成骨非诱导培养基。将成脂和成骨诱导组及非诱导组细胞置于37 °C、5% CO2条件下开始孵育。
  5. 将剩余的人PVAT前体细胞和人骨髓MSC在500 × g条件下离心7分钟，沉淀细胞。
  6. 计算所需体积，将剩余的骨髓和PVAT来源的细胞沉淀重悬至密度为100,000个细胞/10 µL（即106个细胞/mL）。用计算好的体积的MSC生长培养基重悬细胞沉淀，用于成软骨谱系诱导。使用移液器轻轻吹打细胞悬液，确保细胞分布均匀。
  7. 吸取10 µL浓缩细胞悬液，滴加至每个孔的中央，形成含100,000个细胞的微团（micromass）。在相邻孔中加入1 mL无菌H2O以防止蒸发。将微团培养物在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时，使细胞聚集形成微团结构。
  8. 2小时后，小心地向各诱导组孔中加入含有10 ng/mL人TGFβ1的成软骨分化培养基。小心地向非诱导组孔中加入1.5 mL非诱导培养基（骨髓MSC生长培养基）。诱导组和非诱导组应使用不同的12孔板，以便可在较早时间点固定非诱导组样本。

5. 方案4：脂肪生成、成骨和软骨生成谱系培养14天

  1. 将三种谱系的诱导和非诱导条件在 37 °C 和 5% CO2 环境下培养 4 天，每 2 天更换一次培养基。第 4 天时，将诱导脂肪生成谱系的条件从诱导培养基更换为维持培养基，并在后续实验过程中持续使用。
  2. 用 10% 甲醛固定所有非诱导条件 12 小时。弃去甲醛，并用 PBS 洗涤所有固定孔 2 次，以彻底去除残留甲醛。将培养板置于 PBS 中，于 4 °C 保存，直至后续处理。
  3. 将诱导条件继续培养至第 14 天，每 2 天更换一次培养基。每次更换软骨诱导培养基时，加入新鲜 TGFβ1 至终浓度为 10 ng/mL。脂肪生成谱系继续使用脂肪生成维持培养基，成骨谱系继续使用成骨诱导培养基，均每 2 天更换一次。第 14 天时，用 10% 甲醛对所有诱导条件固定 12 小时，用于染色。
  4. 将诱导软骨生成条件中的微团培养物刮下或倾倒至包埋盒中，用于包埋。将微团依次浸入浓度递增的酒精溶液中进行脱水，每次 5 分钟，顺序为 70%、80%、95% 两次、无水酒精两次。将包埋盒置于脱酒精试剂中处理后，最终包埋于石蜡中，用于切片和染色。

6. 方案5：使用油红O染色脂肪生成条件

  1. 配制油红O储备液：将350 mg油红O溶解于100 mL 100%异丙醇中，使用磁力搅拌器搅拌2 h，然后经0.2 µm滤膜抽滤。储备液可避光室温保存1年。
  2. 将3份储备液与2份二水合油红O工作液混合，配制油红O工作液20（例如，60 mL 储备液加 40 mL 去离子水）20）。工作液中油红O的最终浓度为2.1 mg/mL。
  3. 从各孔中移除所有液体。用60%异丙醇洗涤每孔2次，确保完全去除孔壁上的水分。吸去60%异丙醇后，迅速加入Oil Red O工作液，覆盖孔底，避免接触孔壁。此步骤必须迅速完成，以防孔干燥。
  4. 加入油红O后，在室温下轻轻摇动孵育10分钟。
  5. 除去所有油红O，立即加入蒸馏水2O. 用蒸馏水洗涤 H2O 孵育 10 分钟，以开始去除未结合的 Oil Red O。10 分钟后，吸除 Oil Red O 并重复洗涤步骤 3 次。
  6. 洗涤完成后，加入 PBS 并对细胞进行成像。将染色后的细胞置于 PBS 中，4 °C 保存。

7. 方案6：茜素红染色成骨条件

  1. 吸去每个孔中的全部液体。向每孔加入适量的2%茜素红染色液（对于12孔板，每孔加入1.5 mL），轻轻左右倾斜培养板，直至溶液完全覆盖孔底。
  2. 室温孵育15分钟。吸去孔内的茜素红染色液。用蒸馏H2O轻轻冲洗每孔4次，注意避免钙结晶脱落。静置晾干。

8. 方案7：使用马松三色染色法对软骨生成条件进行染色

  1. 将载玻片置于60 °C的干燥烘箱中烘烤30分钟。脱蜡并使切片经梯度乙醇水化至蒸馏水。
    1. 水化步骤：将载玻片依次浸入三种去酒精试剂中，每种孵育5分钟；随后按以下递减的乙醇浓度梯度进行5分钟孵育：100%乙醇（两次）、95%乙醇（两次）、80%乙醇（两次）、70%乙醇（两次），最后在蒸馏H2O中孵育两次。在配制Bouin固定液期间，载玻片可暂时保存于H2O中。
  2. 取40 mL Bouin固定液置于塑料微波炉适用的考林瓶（不加盖）中，高火微波加热至温度达到55 °C。将载玻片放入加热后的溶液中孵育20分钟，随后盖上盖子在室温下静置。用流动自来水冲洗10分钟，或直至黄色完全消失。
  3. 用Weigert苏木精染液染色切片10分钟。用流动自来水冲洗10分钟。
  4. 用Beibrich猩红酸性品红溶液染色切片10分钟。用自来水冲洗3次，每次10分钟。将载玻片在磷钨酸/磷钼酸溶液中媒染10分钟。此步不冲洗。
  5. 将载玻片直接转入苯胺蓝溶液中染色10分钟。用自来水快速浸洗两次。
  6. 将载玻片置于1%醋酸溶液中处理3至5分钟。用自来水冲洗1分钟。转入95%乙醇中1分钟。按步骤5.4所述进行脱水，并用合成树脂封片。

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结果

从人内脏脂肪组织中分离基质血管组分

图1A 显示了获取覆盖升主动脉的血管周围脂肪组织（PVAT）的解剖区域示意图。我们此前已描述过这些样本来源的接受冠状动脉旁路移植术的患者群体6. 图1B 显示了手术后获得的人体PVAT示例。 图1C 显示了用Masson三色染色法染色的代表性PVAT组织切片。 图1D 是一张相衬显微照片，显示分化前扩增阶段的PVAT来源基质细胞群体。细胞可进行扩增并冻存以供后续使用。细胞通常以2.5 x 10⁶个/mL的密度冻存。5 细胞/mL，置于由70% FBS、20%基础（无抗生素）DME...

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讨论

不同来源的脂肪祖细胞在表型和分化潜能方面存在显著差异9。将来自同一患者供体的血管周围脂肪组织（PVAT）来源祖细胞同时诱导向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞三个不同谱系分化，可对这群新型祖细胞的多能性进行严格对照的研究。本报告中描述的方法可用于检测人PVAT来源祖细胞的分化能力，并有助于理解其在调控PVAT病理变化及血管张力中的功能。该技术的优势在于操作简便，并利用冠状动脉旁路移植术患者的原代人体组织，从而能够研究严重心血管疾病患者PVAT祖细胞的功能。然而，从500 mg组织样本中获得的外植块通常仅能收获<1000个贴壁细胞，因此需要经过5–7次传代才能获得足够数量的细胞，这是该方法的一个重要局限性。三谱系分化实验成功的关键在于初始细胞外植块的质量。在酶解消化前，必须将组织充分剪碎至细小颗粒。此外，与其他外植块培养方案不同的是，我们发现，在接种前使用红细胞裂解液会导致细胞数量、存活率及整体质量显著下降。因此，强烈建议将整个基质血管组分（包括红细胞）直接接种。24小时后，贴壁细胞已附着，未裂解的红细胞可通过反复用HBSS洗涤去除。PVAT来源基质细胞的传代比例不应超过1:2。当传代比例...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢缅因州医疗中心研究导航部门在获取临床组织方面的协助，以及缅因州医疗中心研究所组织病理学与组织形态计量学核心实验室（由1P20GM121301基金支持，L. Liaw 为项目负责人）在切片与染色方面的技术支持。本研究工作由美国国立卫生研究院资助项目R01 HL141149（L. Liaw）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无动物源性胶原酶/分散酶混合液 I  Millipore-SigmaSCR13950mg
阿新蓝NewComerSupply1003A1% 水溶液，pH 2.5
茜素红Amresco9436-25G
α-MEMThermoFisher12561056
苯胺蓝NewComerSupply10073C
抗生素/抗真菌剂ThermoFisher15240062
比布里希猩红酸性品红Millipore-SigmaA3908-25G
β-甘油磷酸钠Millipore-SigmaG9422-10G
比布里希猩红EKI2248-25G
生物素Millipore-SigmaB4501-100MG
布因氏固定液NewComerSupply1020A
牛血清白蛋白Calbiochem126594 °C 保存
细胞解离液AccutaseAT104
贝尔式滤筛（70 mm）Corning352350
地塞米松Millipore-SigmaD4902-100MG
DMEMCorning10-013-CV含 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠
DMEM/F12 培养基ThermoFisher10565-042高糖，含 GlutaMAX 和碳酸氢钠
DMSOMillipore-SigmaD2650
胎牛血清Atlanta Biologicals S11550
FGF2Peprotech100-18B
福尔马林NewComerSupply1090
明胶（牛皮来源）Millipore-SigmaG9391-500G
GlutaMAXThermoFisher35050061谷氨酰胺补充剂
HBSSLonza10-547F
IBMXMillipore-SigmaI5879-250MG
胰岛素溶液Millipore-SigmaI9278-5ML
油红 OMillipore-SigmaO0625-100G
泛酸Millipore-SigmaP5155-100G
青霉素-链霉素溶液ThermoFisher15240062100ml
PermountFisherSP15-500
磷钨酸/磷钼酸溶液Millipore-SigmaP4006-100G/221856-100G
PrimocinInvivogenant-pm-1用于培养基的抗菌试剂。
罗格列酮Millipore-SigmaR2408-10MG
TGFb1Peprotech100-21
魏格特氏苏木精EKI4880-100G

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