使用微球菌核酸酶在哺乳动物细胞中进行染色质免疫沉淀实验

摘要

染色质免疫沉淀（ChIP）是研究基因调控分子机制的有力工具。然而，该方法在通过机械剪切获得可重复的染色质片段化方面存在困难。在此，我们提供一种利用酶解消化的ChIP检测的改进方案。

摘要

为了在生物体中表达细胞表型，活细胞会相应地执行基因表达，而转录程序在基因表达中起着核心作用。细胞的转录机制及其染色质修饰蛋白协同调控转录过程。为了在分子水平上分析转录调控，已有多种实验方法可供使用，例如电泳迁移率变动实验、瞬时报告基因实验以及染色质免疫沉淀（ChIP）实验。本文详细描述了一种经过改进的ChIP实验方法，因其在直接展示组蛋白修饰以及细胞内蛋白质与DNA相互作用方面具有优势。成功进行ChIP实验的关键步骤之一是染色质剪切。尽管超声处理常用于染色质剪切，但难以确定可重复的实验条件。我们采用微球菌核酸酶（MNase）进行酶解消化，而非超声剪切，以获得更可重复的结果。本文提供了一种使用MNase的简便ChIP实验方案。

引言

哺乳动物细胞中的基因表达受到严密且动态的调控，其中转录是关键步骤之一。基因转录主要由转录因子和组蛋白进行调控。转录因子是一类能够结合特定DNA序列并控制基因转录的蛋白质，它们通过促进或抑制RNA聚合酶II（PolII）的招募，从而启动以基因组DNA为模板的mRNA合成¹。组蛋白尾部残基的乙酰化和甲基化等组蛋白修饰，可通过改变染色质结构对基因转录产生正向或负向影响²。由于基因表达的改变会影响细胞状态，因此研究转录调控的分子机制至关重要。

迄今为止，已有多种方法可用于研究基因转录的调控机制。电泳迁移率变动分析（EMSA），也称为凝胶迁移分析，用于分析蛋白质与DNA之间的相互作用³。将目标细胞的核提取物与放射性同位素（例如³²P）标记的DNA探针孵育后，在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。其自显影图像显示，DNA-蛋白质复合物在凝胶中的迁移速度比游离探针更慢。当存在针对该蛋白质的抗体时，DNA-蛋白质-抗体三元复合物在凝胶中的迁移速度比DNA-蛋白质复合物更慢。这种发生“上移”的条带可揭示DNA与蛋白质之间的特异性结合。然而，EMSA仅能检测无细胞体系中的特定DNA-蛋白质相互作用，因此尚不清楚该相互作用是否在活细胞中调控转录过程。为研究细胞内基因表达的调控，发展了瞬时报告基因检测法，通常称为荧光素酶报告基因检测。通常将目的基因上游的基因组区域插入报告基因质粒中，瞬时转染细胞后检测报告基因的活性。通过构建多种缺失突变体，可鉴定出参与基因调控的关键区域。尽管报告基因检测是识别调控转录的转录因子及其结合DNA序列的有效工具，但该方法存在一个主要缺陷：报告基因质粒不含染色质结构，无法真实反映体内的转录机制。此外，该系统也无法检测组蛋白修饰的变化。

染色质免疫沉淀（ChIP）方法的建立基于Jackson和Chalkley的报道，即使用甲醛进行“全细胞”固定可保持染色质结构^4,5。此后，许多相关技术相继被开发并不断改进⁶。在ChIP实验中，细胞经甲醛固定以交联DNA与蛋白质，随后对染色质进行片段化，并利用特异性抗体进行免疫沉淀。免疫复合物经洗涤后，纯化其中的DNA。通过针对基因组特定区域设计的引物进行PCR扩增，可揭示目标蛋白在基因组中的结合情况。

尽管染色质免疫沉淀（ChIP）是一种用于鉴定蛋白质（如转录因子和修饰组蛋白）与DNA相互作用的强大工具，但在实际操作中该方法存在一些困难，例如染色质片段化步骤。超声处理（Sonication）已被广泛用于染色质剪切；然而，要确定可重复的实验条件较为繁琐。微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease, MNase）处理是染色质剪切的另一种替代方法。MNase是一种内切-外切核酸酶，能够消化双链、单链、环状和线性DNA及RNA。相对而言，确定最佳染色质片段化的实验条件较为简便，包括染色质和酶的用量、温度以及孵育时间等参数。我们对现有方案进行了改进和简化，建立了一种直接且可重复的方法。本文提供了在哺乳动物细胞中使用MNase进行ChIP检测的实验方案。

方案

1. 试剂的准备

1. 配制18.5%的多聚甲醛（PFA）溶液。在50 mL锥形塑料管中加入0.925 g PFA、4.8 mL水（整个实验过程中均使用超纯水）和35 µL 1 M KOH。盖紧管盖，将管子置于盛有约200 mL水的400–600 mL玻璃烧杯中，用微波炉加热。在水沸腾前取出管子，涡旋振荡以溶解PFA。待PFA冷却至室温后，置于冰上保存。
   注意：重复加热和混匀步骤，直至PFA完全溶解。在交联反应前（步骤2.1.3）立即配制PFA溶液。
2. 配制1.25 M甘氨酸溶液。将14.07 g甘氨酸溶于150 mL水中，经0.22 µm孔径滤膜过滤，4 °C保存。
3. 配制ChIP细胞裂解缓冲液。将378 mg PIPES、10.6 mL 2 M KCl和1.25 g支链辛基苯氧基聚（乙二醇）乙醇溶解于水中，在4 °C条件下用1 M KOH调节pH至8.0，并定容至250 mL。经0.22 µm孔径滤膜过滤后，4 °C保存。
4. 配制微球菌核酸酶（MNase）消化缓冲液。每1 mL溶液包含：0.1 mL 10× MNase消化缓冲液、10 µL 100× BSA溶液、10 µL 0.1 M二硫苏糖醇和0.88 mL水。
5. 配制1 M NaHCO₃溶液。将4.2 g NaHCO₃溶于50 mL水中，经0.22 µm孔径滤膜过滤，室温保存。
6. 配制10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。将5 g SDS溶于50 mL水中，室温保存。
7. 配制洗脱缓冲液。将15 µL 1 M NaHCO₃、15 µL 10% SDS和120 µL水混合，得到一份样品所需的150 µL洗脱缓冲液。
   注意：根据样品数量按比例增加各组分体积。
8. 配制3 M乙酸钠溶液（pH 5.2）。将24.6 g无水乙酸钠溶于水中，用乙酸调节pH至5.2，并定容至100 mL。经0.22 µm孔径滤膜过滤后，室温保存。

2. 确定MNase消化条件

注意：在方案的第2步中，以VCaP人前列腺癌细胞为例进行说明。可使用任何哺乳动物细胞系；详见各步骤中的注释。

1. 交联染色质的制备
   1. 将 VCaP 细胞维持在含 10% 胎牛血清（FBS）的高糖 DMEM 培养基中，于 37 °C 的二氧化碳培养箱中培养。在六个 6 cm 培养皿中，每皿加入 4 mL 培养基并接种 4 × 10⁶ 个细胞，培养 3 天。
      注意：应根据每种细胞系使用适当的培养基。每个 6 cm 或 10 cm 培养皿最多可接种 10 × 10⁶ 个细胞。对于悬浮细胞，应接种于 T25 培养瓶中。所需培养皿或培养瓶的数量取决于 MNase 消化实验中测试的剂量数量。若测试 4 个剂量，则准备 6 个培养皿或培养瓶。另见步骤 2.2。
   2. 使用胰蛋白酶从一个培养皿中解离 VCaP 细胞并计数细胞，计算单个培养皿中的细胞数量。对于悬浮细胞，从一个培养瓶中取出少量细胞悬液进行计数。
   3. 向含 4 mL 培养基的 6 cm 培养皿中加入 0.229 mL 的 18.5% 多聚甲醛（PFA），使终浓度为 1%。轻轻但充分地旋转培养皿或培养瓶，使 PFA 均匀分布。在室温下精确孵育 10 分钟。
      注意：此步骤中染色质与蛋白质发生交联。由于 PFA 具有毒性，操作应在化学通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。
   4. 10 分钟后，加入 0.47 mL 的 1.25 M 甘氨酸溶液，使终浓度为 125 mM。室温孵育 5 分钟。
      注意：甘氨酸可中和过量的 PFA，从而终止进一步交联。
   5. 吸除甲醛/甘氨酸/培养基。用 4 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。对于悬浮细胞，将细胞悬液转移至 15 mL 圆底离心管中，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，加入一个培养基体积的 PBS 并充分重悬。重复此步骤一次。由于废液中含有甲醛，应妥善处理。
   6. 通过向 PBS 中加入 1/100 体积的 100× 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（PIC），配制含 PIC 的 PBS。吸除培养皿中的 PBS，每皿加入 1 mL 含 PIC 的 PBS。刮取细胞并将细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。对于悬浮细胞，直接将悬液转移至 1.5 mL 离心管中即可。
   7. 在室温下以 3,000 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。用移液器彻底去除 PBS。记录每管细胞数量，并将细胞沉淀保存于 -80 °C。
2. 细胞裂解与 MNase 消化
   注意：以下步骤中的试剂用量基于每管含有 6 × 10⁶ 个细胞。根据细胞数量按比例调整试剂用量；当每管含有 2 × 10⁶ 个细胞时，使用 100 µL ChIP 细胞裂解缓冲液（步骤 2.2.1）、MNase 消化缓冲液（步骤 2.2.3）和 ChIP 稀释缓冲液（步骤 2.2.5），以及 10 µL 的 0.5 M EDTA（pH 8.0）（步骤 2.2.4）。
   1. 将步骤 2.1.7 制备的冻存细胞沉淀（VCaP 细胞，每管含 6 × 10⁶ 个细胞）置于冰上解冻。通过向 ChIP 细胞裂解缓冲液中加入 1/100 体积的 100× PIC，配制含 PIC 的缓冲液。加入 300 µL 含 PIC 的 ChIP 细胞裂解缓冲液，充分重悬沉淀。涡旋振荡 15 秒，冰上孵育 10 分钟。
   2. 在 4 °C 下以 9,000 × g 离心 3 分钟，彻底吸除上清液。将沉淀重悬于 300 µL MNase 消化缓冲液中。
   3. 用 MNase 消化缓冲液将 MNase（2,000 凝胶单位/µL）稀释至 50 凝胶单位/µL。向悬液中分别加入 0、0.5、1、2、4 µL 的 50 凝胶单位/µL MNase，在 37 °C 下精确孵育 10 分钟，每 2.5 分钟轻轻颠倒混匀一次。
      注意：表 1 显示了多种细胞系中 MNase 的最佳用量。
   4. 加入 30 µL 的 0.5 M EDTA（pH 8.0）以终止 MNase 消化，短暂涡旋。冰上孵育 5 分钟。在 4 °C 下以 9,000 × g 离心 5 分钟，彻底吸除上清液。
   5. 通过向 ChIP 稀释缓冲液中加入 1/100 体积的 100× PIC，配制含 PIC 的 ChIP 稀释缓冲液。将沉淀重悬于 300 µL 含 PIC 的 ChIP 稀释缓冲液中。
   6. 使用配备微探头的超声仪在冰上对悬液进行超声处理。超声条件如下：振幅 2，处理时间 15 秒，脉冲开启 5 秒，脉冲关闭 30 秒。取 1 µL 悬液点样于载玻片，显微镜下观察。确保细胞结构几乎完全破碎。
      注意：图 1A 展示了 VCaP 细胞悬液在超声处理前后的代表性显微照片。此步骤旨在通过破坏核膜将消化后的染色质释放至上清液中。功率设置应低于最大功率的 5%，可尝试以 30 秒以上间隔重复超声 5 秒共三次。若设备支持瓦特控制，建议将功率设为 5 W，总处理时间为 15 秒（如上所述），总能量达 70–75 J。检查细胞结构是否如上述被破坏。若未充分破碎，可再重复一次。上述条件已实际适用于所有测试的细胞系。
   7. 在 4 °C 下以 9,000 × g 离心 10 分钟，将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，保留 20 µL 消化后的染色质用于步骤 2.3。其余样品保存于 -80 °C。
3. 逆转交联、DNA 纯化及消化染色质分析
   1. 向一个 1.5 mL 螺口管中加入 75 µL 水、4 µL 的 5 M NaCl 和 1 µL 蛋白酶 K。将步骤 2.2.7 中不同 MNase 消化条件下获得的 20 µL 消化染色质分别加入含有水、NaCl 和蛋白酶 K 的各管中。盖紧管盖，充分混匀，于 65 °C 过夜孵育。
      注意：此步骤用于去除蛋白质与 DNA 之间的交联。
   2. 每种条件准备两个 1.5 mL 微量离心管。向其中一个 1.5 mL 管中加入 100 µL 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）（PCI）。向另一管中加入 10 µL 的 3 M 醋酸钠（pH 5.2）和 2 µL 糖原。
      注意：无需使用氯仿:异戊醇⁷。增加体积可能导致乙醇沉淀后 DNA 回收率降低⁸。
   3. 短暂离心步骤 2.3.1 中含有消化染色质的管，加入 100 µL PCI。盖紧管盖，剧烈涡旋形成乳状液。在室温下以最高速度（例如 20,000 × g）离心 30 秒。
   4. 小心吸取含 DNA 的上层相，加入步骤 2.3.2 中已准备好的含 PCI 的管中。剧烈涡旋，按步骤 2.3.3 的条件再次离心。
      注意：若下层相发生污染，可再次离心，或先移除大部分下层相后再离心，并小心吸取上层相。
   5. 按照步骤 2.3.4 所述小心吸取上层相，加入步骤 2.3.2 中已准备好的含醋酸钠和糖原的管中。加入 250 µL 乙醇。通过颠倒混匀，室温孵育 10 分钟。在 4 °C 下以最高速度（例如 20,000 × g）离心 30 分钟。
      注意：溶液在室温下孵育不影响 DNA 回收率^8,9。
   6. 确认管底的沉淀物。小心吸除上清液，避免扰动沉淀，加入 500 µL 70% 乙醇。在 4 °C 下以最高速度（例如 20,000 × g）离心 5 分钟。
   7. 彻底吸除上清液，在室温下干燥沉淀约 5 分钟。将沉淀溶解于 20 µL 的 10 mM Tris·HCl/1 mM EDTA（pH 8.0）（TE）中。使用紫外分光光度计测定 DNA 浓度。
   8. 将 0.5 µg DNA 与上样染料混合，加样至 2% 琼脂糖凝胶中。在 TAE 缓冲液中以 100 V 电泳，直至紫色染料迁移至凝胶三分之二处，用 0.5 µg/mL 溴化乙锭染色 10 分钟，拍摄凝胶图像。
      注意：详见 图 2。

3. 染色质免疫沉淀

1. 消化染色质的制备
   1. 准备细胞。对于贴壁细胞，每处理组在2个培养皿（6 cm或10 cm）中接种2-10 × 10⁶个细胞，并使细胞贴附于培养皿底部超过1天。对于悬浮细胞，每处理组接种于2个T25培养瓶中。按需处理细胞。
   2. 从每组中取出一个培养皿或培养瓶，按步骤2.1.2所述方法计数细胞数量。按照步骤2.1.3–2.1.7所述方法制备交联染色质。
   3. 按照步骤2.2.1–2.2.7所述方法裂解细胞沉淀并进行MNase消化。使用步骤2中确定的最佳量的MNase消化染色质。将消化后的染色质储存于-80 °C。
   4. 取20 µL消化后的染色质进行交联逆转，并按步骤2.3.8所述方法纯化DNA。按照步骤2.3.7所述方法测定DNA浓度。将样品在2%琼脂糖凝胶中电泳，以检测消化后染色质的片段大小，如步骤2.3所述。
      注意：该DNA浓度与步骤3.1.3中制备并储存的消化染色质相同。
   5. 将步骤3.1.4中逆转交联的消化染色质样品用水稀释至10 ng/µL，并进行系列稀释，得到1、0.1和0.01 ng/µL的浓度。储存于-20 °C。
      注意：这些样品用于实时PCR的标准品。
2. 免疫沉淀
   注意：在本方案的步骤3.2–3.5中，测定VCaP细胞中三甲基化组蛋白H3赖氨酸4（H3K4me3）的占据情况。另见图3。
   1. 解冻步骤3.1.3中获得的消化染色质。所有样品均需保持在冰上。
   2. 通过向缓冲液中加入1/100体积的100×蛋白酶抑制剂混合物（PIC），制备含PIC的ChIP稀释缓冲液。用含PIC的ChIP稀释缓冲液将消化染色质稀释至5 µg/500 µL。准备1,000 µL以上体积，用于以下两种免疫沉淀：(1) 使用非免疫性IgG（对照IgG）进行IP；(2) 使用H3K4me3抗体进行IP。
   3. 取5 µL浓度为5 µg/500 µL的消化染色质加入1.5 mL螺口管中作为输入样品（相当于一次IP的1%）。将样品储存于-80 °C。
   4. 取500 µL浓度为5 µg/500 µL的消化染色质加入1.5 mL螺口管中作为IP样品。向管中加入2 µg抗体。盖紧管盖，在4 °C下轻轻振荡孵育过夜，使用摇床平台进行温和混合。
      注意：尽管最佳抗体用量应通过实验确定，但建议初次使用时每IP加入2 µg抗体。
   5. 每IP加入30 µL ChIP级蛋白G磁珠。在4 °C下轻轻振荡孵育2小时，使用摇床平台进行温和混合。
      注意：磁珠无需预先洗涤。
3. 免疫复合物的洗涤与交联逆转
   1. 短暂离心步骤3.2.5中的管子。将管子放入含钕磁铁的聚乙烯架中静置1分钟。小心吸除上清液。
   2. 每管加入0.5 mL低盐免疫复合物洗涤缓冲液。通过轻弹管壁或短暂涡旋使磁珠充分分散。在4 °C下轻轻振荡孵育5分钟。5分钟后，重复步骤3.3.1。
   3. 每管加入0.5 mL高盐免疫复合物洗涤缓冲液。按步骤3.3.2的方法分散并洗涤磁珠。洗涤后，重复步骤3.3.1。
   4. 每管加入0.5 mL LiCl免疫复合物洗涤缓冲液。按步骤3.3.2的方法分散并洗涤磁珠。洗涤后，重复步骤3.3.1。
   5. 将管子置于磁力架中1分钟，彻底去除残留上清液。
   6. 向管中加入150 µL洗脱缓冲液。涡旋振荡使磁珠完全分散。盖紧管盖，在65 °C下孵育30分钟，每隔5分钟颠倒混匀或涡旋一次，以确保磁珠充分分散。
   7. 孵育期间，准备一个1.5 mL螺口管，加入6 µL 5 M NaCl和2 µL蛋白酶K。解冻步骤3.2.3中制备的1%输入样品。向该输入样品中加入150 µL洗脱缓冲液、6 µL 5 M NaCl和2 µL蛋白酶K。
   8. 孵育结束后，短暂离心管子。将管子置于磁力架中1分钟，转移上清液至步骤3.3.7中已加入NaCl和蛋白酶K的螺口管中。
   9. 盖紧所有IP和输入样品管的管盖，充分涡旋混匀。在65 °C下孵育过夜。
4. DNA纯化
   1. 按步骤2.3.2所述准备试管，加入150 µL PCI（而非100 µL）。在另一试管中加入12 µL 3 M乙酸钠（pH 5.2）和2 µL糖原。
   2. 从孵育器中取出试管，短暂离心后加入150 µL PCI。
   3. 剧烈涡旋试管以形成乳液。在室温下以最大速度（例如20,000 × g）离心30秒。
   4. 小心转移140 µL上层液体至步骤3.4.1中已准备好的含PCI的试管中。重复步骤3.4.3。
      注意：另见步骤2.3.4中的说明。
   5. 小心转移120 µL上层液体至步骤3.4.1中已准备好的含乙酸钠和糖原的试管中。
      注意：另见步骤2.3.4中的说明。
   6. 加入300 µL乙醇。颠倒混匀，室温孵育10分钟。
   7. 在4 °C下以最大速度（例如20,000 × g）离心30分钟。按步骤2.3.6所述方法洗涤沉淀。
   8. 按步骤2.3.7所述方法干燥沉淀后，将沉淀溶解于50 µL TE缓冲液中。储存于-20 °C。
5. 使用实时PCR检测DNA片段
   1. 解冻以下样品：(1) 使用对照IgG进行的IP样品，(2) 使用抗H3K4me3抗体进行的IP样品，(3) 1%输入样品。同时解冻步骤3.1.5中制备的4个浓度的标准品（共7个样品）。
      注意：使用同一组标准品对输入和IP样品中的DNA量进行定量。
   2. 配制8个样品的PCR工作液。混合40 µL 2×实时PCR超混合液、8 µL 4 µM正向引物、8 µL 4 µM反向引物和8 µL水。
      注意：每个PCR反应体系包含5 µL 2×实时PCR超混合液、1 µL 4 µM正向引物、1 µL 4 µM反向引物和1 µL水。引物序列见表2。
   3. 将8 µL PCR工作液分装至PCR板的一个孔中。加入2 µL来自步骤3.4.8的样品或来自步骤3.1.5的标准品。
   4. 密封PCR板，并按以下条件运行PCR程序：1) 95 °C预变性3分钟；2) 95 °C变性10秒；3) 56 °C退火30秒；4) 72 °C延伸30秒并采集数据；重复步骤2)至4)共55个循环。循环结束后，测定PCR产物的熔解曲线并分析数据。
      注意：图3的原始数据见表3。利用标准曲线计算样品的起始量（SQ）。将1%输入样品的SQ乘以100，将其调整为相当于一次IP的输入量，得到输入样品的校正SQ值（公式1）。将IP样品的SQ除以输入样品的校正SQ，得到%输入值（百分比输入法，公式2）。计算富集倍数时，将抗H3K4me3抗体IP样品的SQ除以对照IgG IP样品的SQ（富集倍数法，公式3）。
      输入样品校正SQ = （1%输入样品SQ）× 100 （1）
      H3K4me3的%输入 = 100 × （抗H3K4me3抗体IP样品SQ）/（输入样品校正SQ）（2）
      H3K4me3的富集倍数 = （抗H3K4me3抗体IP样品SQ）/（对照IgG IP样品SQ）（3）

结果

染色质消化是ChIP实验中的关键步骤之一。我们使用MNase消化染色质，以获得核小体寡聚体的混合物。在MNase消化过程中，MNase能够穿过核膜并消化染色质，但消化后的染色质无法穿过核膜，仍保留在细胞核内。为了将消化后的染色质从细胞核中释放出来，需要进行短暂的超声处理。图1A展示了VCaP细胞悬液在超声处理前后的显微照片。未进行超声处理时，细胞结构保持完整，表明染色质仍位于细胞核内。短暂的超声处理可破坏细胞结构，通过显微照片观察细胞状态有助于确定合适的短暂超声条件。我们还展示了在293T细胞（图1B）、人B细胞急性淋巴细胞白血病细胞系REH细胞（图1C）以及人前列腺癌细胞系LNCaP（图1D）中进行短暂超声的其他示例。

图2A显示了在VCaP细胞中使用不同量的MNase处理后染色质的片...

讨论

尽管超声处理常用于获得片段化的染色质，但确定可重复的实验条件往往耗时且繁琐。在本实验方案中，我们采用MNase消化法，因为酶消化更易于实现条件的可重复性。MNase消化后需进行短暂的超声处理（见步骤2.2），以破坏细胞膜并释放已消化的染色质。因此，本方案中的超声功率应尽可能低。我们对所使用的所有细胞均采用相同的超声条件（见图1和Table 1），以实现细胞膜的完全破裂。

使用MNase消化染色质是本实验方案中的关键步骤，因此我们投入了大量精力优化细胞内染色质消化的条件。消化活性取决于酶量、底物（染色质）量以及孵育时间。此外，由于不同细胞的倍性存在差异，必须针对每种细胞类型确定MNase消化的最佳条件。一旦确定，无论细胞接受何种处理，均可采用相同的消化条件。在每次实验中，我们都会检测染色质的消化模式，以确保其适用于ChIP实验，如图2A第5泳道所示。

某些因素会影响染色质免疫沉...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Thermo Scientific	AM9010
2 M KCl	Thermo Scientific	AM9010
2x iQ SYBR Green supermix	Bio-Rad	1706862
5 M NaCl	Thermo Scientific	AM9010
50 bp DNA ladder	New England Biolabs	N3236S
琼脂糖	Research Product International	A20090
支链辛基苯氧基聚乙氧基乙醇	Millipore Sigma	I8896	IGEPAL CA-630
ChIP级蛋白G磁珠	Cell signaling technology	9006S
染色质免疫沉淀（ChIP）稀释缓冲液	Millipore Sigma	20-153	缓冲液成分：0.01% SDS，1.1% Triton X-100，1.2 mM EDTA，16.7 mM Tris-HCl，pH 8.1，167 mM NaCl。
紫色凝胶上样染料（6x）	New England Biolabs	B7024S
甘氨酸	Bio-Rad	161-0724	电泳级
糖原	Millipore Sigma	G1767	19–22 mg/mL
Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液（无EDTA，100x）	Thermo Scientific	78445
高盐免疫复合物洗涤缓冲液	Millipore Sigma	20-155	缓冲液成分：0.1% SDS，1% Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris-HCl，pH 8.1，500 mM NaCl。
H3K4me3组蛋白抗体（pAb）	Active Motif	39915
LiCl免疫复合物洗涤缓冲液	Millipore Sigma	20-156	缓冲液成分：0.25 M LiCl，1% IGEPAL CA630，1%脱氧胆酸钠，1 mM EDTA，10 mM Tris，pH 8.1。
低盐免疫复合物洗涤缓冲液	Millipore Sigma	20-154	缓冲液成分：0.1% SDS，1% Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris-HCl，pH 8.1，150 mM NaCl。
Magna GrIP磁力架（8孔）	Millipore Sigma	20-400	任何可兼容1.5 mL离心管的磁力分离架均可使用。
微球菌核酸酶	New England Biolabs	M0247S	附带10x缓冲液（500 mM Tris-HCl，50 mM CaCl2，25 °C时pH 7.9）和100x BSA（10 mg/mL）
NaHCO3	JT Baker	3506-01
正常兔IgG	Millipore Sigma	12-370
PIPES	Millipore Sigma	P6757
蛋白酶K	Millipore Sigma	3115887001
实时PCR系统	Bio-Rad	CFX96, C1000
RNA聚合酶II CTD磷酸化Ser5抗体	Active Motif	39749
SDS	Boehringer Mannheim	100155	电泳级
乙酸钠	Millipore Sigma	S5636
配备微探头的超声破碎仪	QSONICA	Q700	任何可兼容1.5 mL离心管的超声破碎仪均可使用。
UltraPure苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1, v/v）	Thermo Scientific	15593031	pH 8.05