枯草芽孢杆菌中细菌体和内膜的可视化

Summary

萌发细胞受体蛋白聚集在枯草芽孢杆菌内膜的 "生殖细胞" 中。我们描述了一个协议, 使用超级分辨率显微镜和荧光报告蛋白可视化生殖细胞。该协议还确定了优先与 fm4-64 的膜染料染色的孢子内膜域。

Abstract

孢子体积小, 萌发蛋白丰度相对较低, 因此难以使用荧光显微镜进行显微分析。超分辨率三维结构化照明显微镜 (3D-SIM) 是克服这一障碍并揭示枯草芽孢杆菌 (b. 枯草芽孢杆菌) 萌发过程分子细节的一个很有前途的工具。在这里, 我们描述了改进的 SIMcheck (ImageJ) 辅助三维成像过程和荧光报告蛋白在b. 枯草孢子的萌发体、萌发蛋白簇的 sim 显微镜中的应用。我们还提出了一个 (standard)3D-sim 成像程序 FM4-64 染色 b. 枯草孢子膜。通过这些方法, 我们获得了无与伦比的萌发细胞定位分辨率, 并表明在定义的最小 MOPS 培养基上培养后获得的 b . 枯草kgb80 休眠孢子有一个或两个 Gerd-gfp 和 GerKB-mCherry 的 gt;80%灶。在 FM4-64 染色孢子的3D-SIM 图像中也观察到明亮的病灶, 表明可能存在不同流动性的内膜脂质域。进一步的研究, 使用双重标记程序与膜染料和生殖细胞报告蛋白, 以评估共同定位, 从而得到一个最佳的概述, 在内孢子膜芽孢杆菌萌发蛋白的组织可能。

Introduction

Bacillales 和 Clostridiales 的孢子在代谢上处于休眠状态, 对苛刻的去污状态非常耐受, 但除非它们发芽, 否则不能对人类造成有害影响 1.在营养萌发引发枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌) 孢子萌发时, 萌发事件与位于孢子内膜 (im) 中的萌发受体 (gr) 结合。随后, Gs 将信号传递到也位于 IM 中的 SpoVA 通道蛋白。这导致孢子核心吡啶-2, 6-二羧酸 (二甲二胺酸) 的交换开始;政治部;由20% 的孢子芯干重) 组成, 用于通过 SpoVA 通道的水。随后, dpa 释放触发皮层肽多糖水解的激活, 额外的吸水跟随 2^,3,4。这些事件导致涂层层的机械应力, 其随后破裂, 开始生长, 最后, 植物生长。然而, 萌发过程的确切分子细节仍远未解决。

孢子萌发的一个主要问题涉及 im 萌发蛋白周围脂质的生物物理特性以及 IM SpoVA 通道蛋白。这种基本不动的 im 脂质双层是许多小分子的主要渗透屏障, 包括有毒化学防腐剂, 其中一些在孢子核或营养细胞细胞质^5,6中发挥作用。IM 脂质双层可能处于凝胶状态, 尽管在 IM⁵中有相当一部分的移动脂质。孢子的 IM 也有显著扩张的潜力⁵。因此, im 的表面积在不进行额外膜合成的情况下在萌发时增加 1.6倍, 并伴随着这种膜的低渗透性和脂质不动⁵,^6的丧失。

虽然萌发蛋白活化和在孢子中组织 im 脂质的分子细节是一个很有吸引力的研究课题,但枯草芽孢杆菌的体积小, 萌发蛋白的丰度相对较低, 构成了一个挑战微观分析。Griffiths 等人在荧光显微镜下使用荧光记者融合到萌发蛋白的证据表明, 在b. 枯草孢子中, 支架蛋白 Gerd 为 Gda、B 和 k grs 组织三个 gr 亚基 (A、B 和 c),在一个集群⁷。他们为这一萌发蛋白群创造了 "萌发细胞" 一词, 并将其描述为 ~ 300 纳米大 IM 蛋白焦点⁸。在孢子萌发开始后, 荧光萌发病灶最终变成更大的分散荧光模式, 在 l-valine⁸萌发1小时的孢子中, 有 gt;75% 的孢子群表现出这种模式。请注意, 上面提到的论文使用了数十张连续荧光图像的平均图像, 以获得统计能力, 并克服成像过程中观察到的低荧光信号的障碍。这些结构在细菌孢子中的这种可视化是在技术上是可行的, 与经典的微观工具, 既不是一个单一的孢子中的病灶的数量的评估, 也不是他们更详细的亚细胞定位这种方法的可能性。

在这里, 我们演示了使用结构照明显微镜 (SIM), 以获得详细的可视化和定量的萌发体 (s) 在孢子, 以及他们的 im 脂域⁹。该协议还包含由 SIMcheck (v1.0, imageJ 插件) 以及 ImageJ^10、11、12进行运动、幻灯片准备和图像分析的说明。

Protocol

1. b. 子底组织运动 (时间: 显微镜观察前 7天)

1. 第1天
   1. 在 Luria-Bertani 肉汤 (LB) 琼脂板 (1% 色氨酸、0.5% 酵母提取物、1% 氯化钠、1% 琼脂)^上传播细菌培养, 并在37°c 下孵育过夜, 以获得单一菌落。使用b. subtilis KGB80 (PS4150 gerka gerKA Gerkb-mcherry cat, gerd-gfp kan) 菌株及其父背景菌株b. SUBTILIS PS4150 (ps832 gere::: spc,: tet), 如上文^所述。
      请注意:在萌发体的可视化中 , 使用具有 Cotese 结果背景的孢子是必不可少的 , 以便最大限度地减少孢子涂层层 7 的自体荧光。
   2. 用适当的方法对所有介质、管材、管道和其他培养材料进行消毒。
2. 第2天
   1. 清晨将单个菌落接种到 LB 培养基的5ml 中, 并在 200 rm/min 和37°c 的螺帽管中连续搅拌培养培养, 直到 OD₆₀₀达到 0.3-0.4 (约 7小时)。
   2. 制造500毫升的 ML 介质 (pH 7.5), 包含 3 nM (NM₄) 6mo₇O2·4h2o_,0.4 Μm h 3bo 3, 30 nm ccl 2·6H 2o, 10 nM cso4·5h 2o, 10 nmZnSO_4·7h2o, 1.32 mm_{k 2}hpo₄, 0.4 mmmmmgcl 2·6h2 o, 0.276Mmk 2 so 4, 0.01 Mm feso7h2 o, 0.276 mm cl 2·h 2·h 2H, 80 mmMM, 4 mM Tricine, 0.1 mm MnCl 2h2o_,10 mm d-葡萄糖-一水, 和 10 MM nh 4 cl_.
   3. 在每个 5 mL ML 培养基中制备 lb培养体的 10-1-10-7 系列稀释剂, 并在 200 rm/min 和37°c 的连续搅拌下孵育培养物.
      请注意:这里制备的连续稀释的目的是在第二天早上获得早期指数阶段的稀释。这一步和下一步是必要的, 以允许细胞适应 MOPS 缓冲生长介质。
3. 第3天
   1. 选择 OD₆₀₀为 0.3-0.4 的 mops 稀释剂之一。在圆锥形 250 mL 烧瓶中, 将培养物的0.2 毫升培养成预热 (37°c) 20 mL, 并在连续搅拌_下孵育至 od 600 达到 0.3-0.4 (~ 7小时)。
   2. 在连续搅拌的情况下, 从步骤1.3.1 接种基于 ML 的孢子培养基 (250 毫升), 并在37°c 孵育 3天, 以 1% (v/v) 进行预培养。对于 PS4150 孢子的 FM4-64 染色, 在达到营养生长的峰值_{od 600}值 (一般约为 2) 后, 在孢子培养基中添加 2μgl Fm4-64 探针 (见材料表) 1 或 2小时, 并允许培养培养随后孢子, 同时保护它免受光⁵。
4. 第7天: 收集孢子
   1. 使用100X 放大的相对比显微镜确定孢子产量 (孢子与营养细胞), 以区分相明亮的孢子与相暗细胞和可能的非成熟孢子。预计将有90% 的相明亮孢子产量。
   2. 在 4, 270 x克的圆形离心管中, 在4°c 下, 以 4, 270 x g 的速度将孢子颗粒在4°c 下, 可在15分钟内进入。用40毫升的无菌超纯1型脱盐水在50毫升锥形离心管中清洗孢子颗粒2-3 次 (见材料表)。每次清洗时旋转 15分钟 (4°c), 每次下冲。
5. 第7天:孢子净化
   1. 孢子净化: 将孢子颗粒悬浮在205μl 的20% 非离子密度梯度介质中 (见材料表), 并在灭菌的微离心管中加载到50% 非离子密度梯度介质的800μl 上。离心时间为 26500 x g, 为60分钟。获得的颗粒含有游离孢子。悬浮在20% 非离子密度梯度介质的200μl 中悬浮孢子颗粒, 并在微离心管中加载到50% 非离子密度梯度介质的 1 mL 上, 离心板在 21, 500 x g 时等待 15分钟.
   2. 清洗最后的孢子制备和储存: 获得的颗粒含有纯化的休眠孢子。用 1.5 mL 的无菌超纯1型水 (见材料表) 清洗孢子颗粒2-3 次, 在4°c 下, 以 9 560 x克的速度自旋15分钟。最后, 将颗粒悬浮在无菌超纯1型水中, 最终 OD 600 约 30. 孢子的液体可以在-80°c 下储存 8周,^14周.

2. 解码

1. 用 0.1 m nablx置于 0.1 m nohxy% 去十二烷基硫酸钠 (SDS)/0.1 m 二硫酮醇 (dtt) 在70°c 下使用 1. 用消毒的超纯1型水清洗孢子 10次, 10次.通过这样做, 任何吸附在孢子外膜和外层的 FM4-64 探针都将被移除。

3. 盖板和滑块准备¹¹ (观察前的时间: 1h)

1. 预清洁高精度盖板 (见材料表) 与 1 m HCl 30分钟在轻轻晃动的水浴。用超纯1型水清洗两次盖板, 并将其储存在 100% (vol/vol) EtOH 中。让它们干燥, 并在使用前验证其清晰度。以 70% EtOH 预清洁玻璃滑梯。让它们干燥, 并在使用前验证其清晰度。

4. 在基因框架幻灯片10中取样荧光微球或孢子⁽时间为 15分钟)

1. 预热两个 70% EtOH 清洗和风干玻璃滑梯 (见材料表) 在70°c 加热块上几秒钟, 在一个玻璃滑块的顶部70°c 下降到65Μl 的消毒2% 琼脂糖, 并将另一张玻璃滑梯放在上面铺开琼脂糖 b在幻灯片之间。琼脂糖贴片将在大约5分钟内干燥。
2. 取出其中一块玻璃滑块后, 将琼脂糖贴片切割成1x1cm 的部分, 加入0.4Μl 的样品 (荧光微球或约 108/毫升的孢子), 并将贴片放置在贴片上, 将贴片转移到高精度的覆盖片上, 然后再将贴片贴在贴片上,滑动它了。
3. 将一个基因框架 (1.5 x 1.6 厘米2, 65μl) 固定在干燥的幻灯片上, 将覆盖物放置在上面, 将框架的各个角落关闭, 从而完成幻灯片, 以便在显微镜下使用。

5. 成像^11,17(时间: 1 h)

1. 在装有100x 油目标的结构照明显微镜 (见材料表) 上捕获孢子的透射和荧光图像以及红色和黄绿色羧酸酯修饰荧光微球的混合物 (见材料表) (数值光圈 = 1.49), CCD 摄像机和图像分析软件 (见材料表)。在室温下生成所有图像, 而不会受到环境光的干扰。在成像之前, 请务必使用75% 乙醇清洁100x 目标和幻灯片。
2. 聚焦在100纳米 (直径) 荧光微球上, 并通过调整100x 目标上的校正环, 直到获得对称的 psf, 从而最大限度地减少图像的模糊, 从而优化点扩散函数 (psf)。Psf 是成像系统对点源或点对象的脉冲响应或响应。
3. 选择具有大约10个圆形荧光微球的视场。应用 561 nm 和 488 nm 激励波长的光栅对焦调整作为图像分析软件的指南。
4. 用透射光聚焦孢子, 以16x 平均模式捕获透射光图像, 每个图像可曝光200毫秒。
5. 使用照明模式 "3D-SIM" 捕获孢子的3D-SIM 原始荧光图像, 相机设置为读出模式电子乘法 (EM) 在14-bit 时获得 10MHz, 在175时获得 em 增益。以20% 的激光功率和400毫秒的照明时间, 用561纳米激光在 PS4150 孢子中激发 FM4-64 探头。
6. 在 KGB80 孢子中激发 GerKB-mCherry 和 GerD-GFP, 561 纳米激光以30% 激光功率为 1秒, 488 nm 激光以60% 激光功率为 3秒. Z-Stack 设置在顶部至底部模式, 0.2Μm/step, 7 步和20个步骤的萌发体和IM 分析。
   请注意:应用这些激光参数是为了确保直方图窗口的最大亮度值约为 4, 000。

6. 重建 FM4-64 染色 PS4150 孢子的3D-SIM 原始图像

1. 执行 N-SIM 切片重建 FM4-64 染色 PS4150 孢子的原始数据。单击 "重建" n-sim 垫选项卡页上的"重建切片" 的param按钮, 打开 n-sim 切片重建窗口。
2. 在N-sim 切片重建窗口中设置重建参数。要获得完美重建的图像, 请按照 N-SIM 说明的建议, 单击N-sim 切片重建窗口中的相应控件, 将"照明调制对比度" (imc)设置为"自动、高"分辨率噪声抑制 (HRNS)到 1.00 , 并以0.5个起点退出对焦模糊抑制 (ofbs) 。
3. 单击N-sim 切片重建窗口中的"重建切片"按钮以重建图像。利用重建12后显示的快速傅立叶变换 (FFT) 图像和重建分数来评价重建图像的质量.
4. 通过单击N-sim 切片重建窗口中的相应控件 , 将 hrns 从0.10 调整到 5.00, 将ofbs从0.01 调整到 0.10, 直到获得最佳参数设置。
5. 单击N-sim 切片重建窗口中的 "应用" 按钮以应用更改的参数。单击 "关闭" 按钮关闭窗口。
6. 使 FM4-64 染色 PS4150 孢子原始图像处于活动状态, 然后单击N-sim pad选项卡上的"重建切片" 按钮, 执行切片重建。保存重建的图像。

7. 图像分析

1. 转换 KGB80 生殖细胞的伪基德菲尔德图像
   1. 通过左键单击 imagej 插件 simcheck 数据 si 激活, 将 KGB80 的3d-sim 原始图像转换为伪widefield映像. 伪宽幅数据平均来自原始 SIM 数据的图像, 并组装, 以进行比较, 该图像相当于传统的宽场照明¹²。为 ImageJ 本身看见 https://imagej.net/Welcome。在每个倒置传输图像中随机选择 ~ 25个孢子, 以便在荧光伪 widefield 图像中进行后期的生殖细胞群分析。
   2. 从两张幻灯片中总共选择大约 350个 (在本例中, 346) KGB80 孢子在14个视场中。选定的 KGB80 孢子中的 GerD-GFP 和 GerKB-mCherry 荧光焦点数应该由两位研究人员独立计算。研究人员可以参考3D-SIM 原始图像, 每当怀疑存在单独的荧光萌发病灶在孢子。
   3. 使用 imagej 评估每个 GerD-GFP 和 GerKB-mCherry 焦点的最大强度以及每个 KGB80 孢子3D 图像的集成强度。
2. KGB80 萌发体伪基德菲尔德图像的分析
   1. 采用7个堆栈的平均综合强度值作为 KGB80 孢子的综合信号强度。使用相同的设置对背景应变 PS4150 进行成像, 以确定背景强度。将单个 KGB80 孢子中的荧光斑点视为萌发体病灶, 而它们与背景有明显的区别。
   2. 使用软件 "起源" 9.0 应用单向方差测试进行显著性测定。认为 P 值和 lt;0.05 在统计学上具有显著性。利用斯皮尔曼的等级相关系数¹⁸ , 评价 GerD-GFP 和 gerkb-mcry 焦点数的相关性以及综合信号强度的测量。

Results

目前的协议提出了一种 sim 显微镜成像程序的细菌孢子。在成像之前, 进行了孢子和滑块制备过程, 如图 1所示。随后, 成像和分析程序被应用于暗淡 (荧光蛋白标记萌发蛋白) 和明亮 (亲脂性探针染色 im) 孢子样品, 如下文所示。

枯草芽孢杆菌萌发体的定位

根据西方对在富孢子培养基中制备的孢子提取物的印迹分析, 每株孢子的 GerD 和 GerKB 水平分别为 ~ 3, 500 和 ~ 700 分子.KGB80 菌株中的Gerd-gfp和Gerkb-mcherry 基因都在其原生启动子的控制之下。融合蛋白的相对丰度较低, 导致成像过程中荧...

Discussion

所介绍的协议包含一个标准的3D-SIM 程序, 用于分析 FM4-64 染色b.枯草孢子, 包括孢子, 幻灯片制备和成像过程。此外, 该协议还描述了一种改进的 SIMcheck (ImageJ) 辅助三维成像过程, 用于用荧光记者标记的b.枯草孢子萌发体的 sim 显微镜。后一个过程使我们能够观察到这个暗淡的子结构与增强对比度。通过将两个成像过程耦合起来, 可以用相同的 SIM 显微镜对同一孢子中的离散子结构进行可视化, 从而提高我们对萌发过程的机械理解的基础。请注意, 该程序的工作方式是横向分辨率 ~ 100 nm, 轴向分辨率约为 200-250 nm。这优于 Griffith⁷使用的差分干涉对比度 (dic) 广域显微镜方法。在萌发过程中对萌发时的萌发体形态进行时间解析分析将是下一步的工作。遗憾的是, 尽管 SIM 显微镜原则上与实时成像兼容, 但由于像时间分辨 sim 这样的生殖细胞信号的暗淡性质, 由于在图像采集过程中样品的快速漂白, 分析是不可行的。为了获得足够的孢子进行分析, 确保孢子的有效发生至关重要。因此, 研究人员必须以90% 的效率...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
风干玻璃载玻片	Menzel Gläser	630-2870
APO TIRF N20R8 100× 油物镜 （NA=1.49）
B. subtilis KGB80 （PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat， gerD-gfp kan）
B. subtilis PS4150 （PS832 ΔgerE：：spc， ΔcotE：：tet）
锥形瓶 1 L	Sigma-Aldrich	Z567868
锥形瓶 250 mL	Sigma-Aldrich	Z723088
FluoSpheres 羧酸盐修饰的微球	Invitrogen， 0.1 μm	F8803
FM4-64	Thermo Fisher Scientific	F34653
Histodenz 非离子密度梯度培养基	Sigma-Aldrich	D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD 相机	Andor Technology		https://imagej.net/Welcome
LB 琼脂	Sigma-Aldrich	L2897
微量离心管 1.5 mL	Thermo Fisher Scientific	3451PK
显微镜成像软件	日本尼康	NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ 超纯脱矿水	Millipore	Milli-Q IQ 7003
尼康 Eclipse Ti 显微镜
聚丙烯螺旋盖瓶 180 mL	Thermo Fisher Scientific	75003800
精密盖玻片	Paul Marienfeld	117650
圆底管 15 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM
螺口管 50 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM