Method Article

枯草芽孢杆菌中细菌体和内膜的可视化

DOI:

10.3791/59388

⸱

April 15th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Biology and Microbial Food Safety, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 2Van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 3Confocal.nl BV., 4Dept. of Molecular Biology and Biophysics, UConn Health

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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萌发细胞受体蛋白聚集在枯草芽孢杆菌内膜的 "生殖细胞" 中。我们描述了一个协议, 使用超级分辨率显微镜和荧光报告蛋白可视化生殖细胞。该协议还确定了优先与 fm4-64 的膜染料染色的孢子内膜域。

Abstract

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孢子体积小, 萌发蛋白丰度相对较低, 因此难以使用荧光显微镜进行显微分析。超分辨率三维结构化照明显微镜 (3D-SIM) 是克服这一障碍并揭示枯草芽孢杆菌 (b. 枯草芽孢杆菌) 萌发过程分子细节的一个很有前途的工具。在这里, 我们描述了改进的 SIMcheck (ImageJ) 辅助三维成像过程和荧光报告蛋白在b. 枯草孢子的萌发体、萌发蛋白簇的 sim 显微镜中的应用。我们还提出了一个 (standard)3D-sim 成像程序 FM4-64 染色 b. 枯草孢子膜。通过这些方法, 我们获得了无与伦比的萌发细胞定位分辨率, 并表明在定义的最小 MOPS 培养基上培养后获得的 b . 枯草kgb80 休眠孢子有一个或两个 Gerd-gfp 和 GerKB-mCherry 的 gt;80%灶。在 FM4-64 染色孢子的3D-SIM 图像中也观察到明亮的病灶, 表明可能存在不同流动性的内膜脂质域。进一步的研究, 使用双重标记程序与膜染料和生殖细胞报告蛋白, 以评估共同定位, 从而得到一个最佳的概述, 在内孢子膜芽孢杆菌萌发蛋白的组织可能。

Introduction

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Bacillales 和 Clostridiales 的孢子在代谢上处于休眠状态, 对苛刻的去污状态非常耐受, 但除非它们发芽, 否则不能对人类造成有害影响 1.在营养萌发引发枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌) 孢子萌发时, 萌发事件与位于孢子内膜 (im) 中的萌发受体 (gr) 结合。随后, Gs 将信号传递到也位于 IM 中的 SpoVA 通道蛋白。这导致孢子核心吡啶-2, 6-二羧酸 (二甲二胺酸) 的交换开始;政治部;由20% 的孢子芯干重) 组成, 用于通过 SpoVA 通道的水。随后, dpa 释放触发皮层肽多糖水解的激活, 额外的吸水跟随 2,3,4。这些事件导致涂层层的机械应力, 其随后破裂, 开始生长, 最后, 植物生长。然而, 萌发过程的确切分子细节仍远未解决。

孢子萌发的一个主要问题涉及 im 萌发蛋白周围脂质的生物物理特性以及 IM SpoVA 通道蛋白。这种基本不动的 im 脂质双层是许多小分子的主要渗透屏障, 包括有毒化学防腐剂, 其中一些在孢子核或营养细胞细胞质5,6....

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Protocol

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1. b. 子底组织运动 (时间: 显微镜观察前 7天)

  1. 第1天
    1. 在 Luria-Bertani 肉汤 (LB) 琼脂板 (1% 色氨酸、0.5% 酵母提取物、1% 氯化钠、1% 琼脂)上传播细菌培养, 并在37°c 下孵育过夜, 以获得单一菌落。使用b. subtilis KGB80 (PS4150 gerka gerKA Gerkb-mcherry cat, gerd-gfp kan) 菌株及其父背景菌株b. SUBTILIS PS4150 (ps832 gere::: spc,: tet), 如上文所述。
      请注意:在萌发体的可视化中 , 使用具有 Cotese 结果背景的孢子是必不可少的 , 以便最大限度地减少孢子涂层层 7 的自体荧光。
    2. 用适当的方法对所有介质、管材、管道和其他培养材料进行消毒。
  2. 第2天
    1. 清晨将单个菌落接种到 LB 培养基的5ml 中, 并在 200 rm/min 和37°c 的螺帽管中连续搅拌培养培养, 直到 OD

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Results

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目前的协议提出了一种 sim 显微镜成像程序的细菌孢子。在成像之前, 进行了孢子和滑块制备过程, 如图 1所示。随后, 成像和分析程序被应用于暗淡 (荧光蛋白标记萌发蛋白) 和明亮 (亲脂性探针染色 im) 孢子样品, 如下文所示。

枯草芽孢杆菌萌发体的定位

根据西方对在富孢子培养基中制备的孢子提取物的印迹分析, 每株孢子的 GerD 和 GerKB 水平分别为 ~ 3, 500 和 ~ 700 分子.KGB80 菌株中的Gerd-gfp和Gerkb-mcherry 基因都在其原生启动子的控制之下。融合蛋白的相对丰度较低, 导致成像过程中荧.......

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Discussion

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所介绍的协议包含一个标准的3D-SIM 程序, 用于分析 FM4-64 染色b.枯草孢子, 包括孢子, 幻灯片制备和成像过程。此外, 该协议还描述了一种改进的 SIMcheck (ImageJ) 辅助三维成像过程, 用于用荧光记者标记的b.枯草孢子萌发体的 sim 显微镜。后一个过程使我们能够观察到这个暗淡的子结构与增强对比度。通过将两个成像过程耦合起来, 可以用相同的 SIM 显微镜对同一孢子中的离散子结构进行可视化, 从而提高我们对萌发过程的机械理解的基础。请注意, 该程序的工作方式是横向分辨率 ~ 100 nm, 轴向分辨率约为 200-250 nm。这优于 Griffith7使用的差分干涉对比度 (dic) 广域显微镜方法。在萌发过程中对萌发时的萌发体形态进行时间解析分析将是下一步的工作。遗憾的是, 尽管 SIM 显微镜原则上与实时成像兼容, 但由于像时间分辨 sim 这样的生殖细胞信号的暗淡性质, 由于在图像采集过程中样品的快速漂白, 分析是不可行的。为了获得足够的孢子进行分析, 确保孢子的有效发生至关重要。因此, 研究人员必须以90% 的效率.......

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Acknowledgements

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作者感谢克里斯蒂安·泽伦伯格在 SIM 成像过程中提供的帮助。JW 感谢中国奖学金委员会获得博士奖学金, 并感谢艾琳·斯泰林沃夫在成像的最初阶段提供的帮助。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
风干玻璃载玻片Menzel Gläser630-2870
APO TIRF N20R8 100× 油物镜 （NA=1.49）
B. subtilis KGB80 （PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat， gerD-gfp kan）
B. subtilis PS4150 （PS832 ΔgerE：：spc， ΔcotE：：tet）
锥形瓶 1 LSigma-AldrichZ567868
锥形瓶 250 mLSigma-AldrichZ723088
FluoSpheres 羧酸盐修饰的微球Invitrogen， 0.1 μmF8803
FM4-64Thermo Fisher ScientificF34653
Histodenz 非离子密度梯度培养基Sigma-AldrichD2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD 相机Andor Technologyhttps://imagej.net/Welcome
LB 琼脂Sigma-AldrichL2897
微量离心管 1.5 mLThermo Fisher Scientific3451PK
显微镜成像软件日本尼康NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ 超纯脱矿水MilliporeMilli-Q IQ 7003
尼康 Eclipse Ti 显微镜
聚丙烯螺旋盖瓶 180 mLThermo Fisher Scientific75003800
精密盖玻片Paul Marienfeld117650
圆底管 15 mLThermo Fisher ScientificNunc TM
螺口管 50 mLThermo Fisher ScientificNunc TM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
  2. Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Re....

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Bacillus subtilis SporesGerminosome Localization3D Structured Illumination MicroscopySuper Resolution ImagingInner Membrane AnalysisFluorescent Reporter ProteinsGermination Protein ClustersFM4 64 Membrane StainingImageJ SIMcheck PluginSpore Germination Process

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