一种无需酶解法分离与扩增人脂肪源性间充质干细胞的方法

摘要

本方案提供了一种无需使用酶消化的方法，通过组织块法从腹部整形术和吸脂术样本中分离间充质干细胞。该方法避免了剧烈的酶处理或离心步骤，所获得的干细胞更符合临床应用需求，可用于体外研究或重新返回临床应用。

摘要

间充质干细胞（MSCs）是一类具有多向分化潜能的细胞，可从多种成体和胎儿组织（包括脂肪组织）中分离获得。作为一种具有临床应用价值的细胞类型，亟需优化其体外分离与扩增的方法。目前大多数分离脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）的方法依赖于胶原酶等强效酶类来消化脂肪组织。然而，尽管这类酶在分解脂肪组织和获得较高ADSC回收率方面效果显著，但其成本较高，且可能对ADSCs产生不利影响——包括在临床应用中使用异种成分所带来的风险。本实验方案详细描述了一种无需使用酶解步骤，从新鲜抽脂术样本和腹壁成形术样本中分离ADSCs的方法。简而言之，该方法通过机械法解离大块组织，随后采用组织块贴壁培养系统。ADSCs可从组织块中迁移出来并附着于组织培养板表面，之后即可在体外进行培养和扩增，用于各种科研和/或临床应用。

引言

间充质干细胞（MSCs）是一类多能成体干细胞，可从多种成体和胎儿组织中分离获得，包括脂肪组织。这类细胞因其具有体外分化为三胚层细胞的可塑性，能够跨越同种异体屏障、归巢至炎症区域并抑制炎症反应，在基础研究和临床应用中均具有重要价值（详见 Sherman 等人综述¹）。脂肪组织来源的间充质干细胞（ASCs）尤其具有吸引力，因为脂肪组织通常在常规吸脂术和腹壁成形术后被视为废弃组织，易于获取。然而，传统方法在获取组织后通常需要经历较为剧烈的处理条件——如酶消化或离心——以分离ASCs^2,3。本文介绍一种利用组织块法（explant method）分离ASCs的简便方法，无需使用剧烈的酶处理或离心步骤。

分离ASC的最常用方法包括冲洗脂肪组织样本，用胶原酶对样本进行酶消化，离心样本，最后在培养ASC之前裂解红细胞⁴。尽管该方法能够高效地获得大量ASC，但美国食品药品监督管理局（FDA）认为使用异种成分（例如胶原酶进行酶消化）已超出“最小程度操作”的范畴，可能带来免疫反应等风险，从而限制了这些细胞在临床中的应用^5,6。为了降低异种成分带来的风险，许多研究团队建议使用非动物来源的合成酶来消化脂肪组织。然而，这些酶仍然较为剧烈，可能改变细胞表型⁷。

分离 ASC 的其他方法包括高速离心（离心力高达 1,200 × g）以及涡旋震荡以分离 ASC⁸。即使低至 400 × g 的离心力也足以分离出具有活力的 ASC⁹。尽管这些方法能够获得大量有活力的细胞，但许多实验方案在培养超过 14 天后无法实现细胞增殖⁸。此外，与酶消化法相比，机械分离法获得的细胞数量较少，但在第 0 代时，所分离细胞中 ASC 所占比例高于脂肪组织中其他内源性细胞¹⁰。

在更短的时间内分离出更纯净、活性更高的ASC群体，同时考虑到异源成分的成本和风险，使得酶消化法在向临床转化过程中越来越缺乏吸引力。尽管机械分离法最初是一种较为理想的方法，但其采用的方法存在显著差异，且处理的组织量受限于专用离心装置的尺寸，并可能依赖于操作者的稳定性²。

尽管酶消化法和离心法能够快速获得大量脂肪来源的基质细胞（ASCs），但这些分离得到的细胞会出现表型改变，从而引发关于将其回输至患者体内后其行为特性的疑问²。因此，一些研究团队开始采用基于组织块培养的ASC分离方法（如本实验方案所述），即ASCs从少量固体脂肪组织块中迁移出来^3,11,12。这种迁移现象可能是由于细胞趋向于营养丰富的培养基所致。与其他类型的间充质干细胞（MSCs）类似，ASCs具有贴附塑料表面的特性，并可在所用的组织培养基（见下文组分）中存活并增殖，从而实现从脂肪组织中其他细胞类型中分离纯化。虽然初始回收的细胞数量较少——通常需要>1周时间才能在组织培养板上观察到细胞——但这些未经处理的ASCs可在体外持续增殖，进而扩增至具有临床应用价值的数量^11,12,13。

方案

使用抽脂术和腹壁成形术样本已获得罗格斯大学纽瓦克校区机构审查委员会（IRB）的批准。

1. 组织培养基的制备

1. 在分离ASCs之前，无菌条件下配制500 mL组织培养基。配制培养基时，向含高糖和2 mM L-谷氨酰胺的杜氏必需培养基（DMEM）中加入10%定义明确的胎牛血清（FCS）和青霉素-链霉素溶液（10,000 U/100 mL）。培养基可在4 °C保存最多3周，使用时应预热（室温至37 °C之间）。
   1. 若偏好使用其他培养基培养干细胞，可改用该培养基。

2. 从脂肪组织中分离ASCs

1. 获取脂肪抽吸物或腹壁成形术样本。在获得机构审查委员会（IRB）批准后，将此类样本作为各种外科手术后的废弃组织收集。将脂肪抽吸物保留在外科医生取出组织时所用的容器中并运送至实验室；腹壁成形术样本则应置于手术室标本袋或容器中运输。
2. 若不立即处理，可将样本在室温下保存最多6小时，或在4 °C下保存最多24小时。超过上述时间处理的组织样本，其细胞得率可能降低。通过添加1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS），保持腹壁成形术样本湿润。
3. 从此时起，所有操作均须在层流罩内无菌条件下进行。佩戴手套以进行个人防护。附近应备有10%次氯酸钠溶液、70%乙醇和纸巾，以便迅速清理任何生物溢出物。所有多余组织应作为生物医学废弃物妥善处置。
4. 将样本切成 < 1 mm 的小块。若腹壁成形术组织块过大不便操作，可先切取适当大小的组织块再进行剪碎。将腹壁成形术组织转移至无菌100 mm培养皿的皿盖上。使用无菌针头固定组织块，并用无菌手术刀通过切割或轻柔撕碎的方式将其剪成小片。
   1. 脂肪抽吸物通常无需此步骤。然而，若在脂肪抽吸物中观察到较大的组织团块，应用无菌镊子将其移除，并按上述方法处理。
5. 将组织转移至新离心管中，倒置或轻轻振荡5–6次，以确保各层充分混合。可选步骤：若脂肪抽吸物已完全分层，可在混合前移除并弃去上层油相。
6. 将2.5–5 mL组织转移至经真空-气体等离子体处理的100 mm组织培养皿中（材料表）。通过将样本倒入新的离心管中测量其体积。必要时可使用无菌刮铲辅助转移组织。
7. 向培养皿中加入等体积的组织培养基。轻轻旋转培养皿以混匀内容物。
8. 将培养皿置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育，直至在皿底观察到足够数量的细胞。随着时间推移，细胞将从组织内部迁移至培养皿表面，并黏附于塑料表面。当细胞从组织块中迁移出来时，会在其周围形成小的细胞簇。
9. 每24小时尽可能移除大部分液体，并更换等量新鲜培养基。如有可能，保留组织块在原位。
10. 当培养皿中出现足够数量的细胞（>10个细胞簇，每个簇包含>15–25个细胞）或孵育达7天（以先到者为准），移除所有剩余的组织块。
11. 继续在组织培养基中培养ASCs，直至细胞达到70%融合度，或细胞簇变得密集（>5个致密的细胞簇，每个直径约>500 μm），此时应进行传代。

3 ASCs 的培养

1. 当亲代培养皿中的ASCs达到约70%融合度时进行传代。注意避免ASCs培养物过度融合。
2. 用1×磷酸盐缓冲液轻轻冲洗培养皿，并对贴壁细胞进行胰蛋白酶消化。进行胰酶消化时，吸除磷酸盐缓冲液，每皿加入1 mL含0.25% EDTA的胰蛋白酶溶液，在37 °C孵育5分钟。5分钟后，通过显微镜观察确认细胞是否脱壁。若细胞仍贴壁，将培养皿放回培养箱继续孵育5分钟。
3. 向培养皿中加入少量培养基（约为总胰酶体积的25%）以中和胰酶活性，并用培养基/胰酶混合液轻轻冲洗皿底。冲洗时将培养皿倾斜一定角度，从皿的上部向下部轻柔吹打，使松散附着的细胞脱离皿面。细胞可按1:3比例重新接种，或以每皿120,000–500,000个细胞的密度接种。
   1. 若根据细胞计数进行接种，将胰酶/培养基混合液从培养皿转移至锥形离心管中，于300 ×g离心7分钟以收集细胞沉淀。用组织培养基重悬细胞（每块初始培养皿约1 mL），并在接种前进行细胞计数。计数时取10 μL细胞悬液加入血细胞计数板，计数网格四个角的4×4象限中的细胞数，取平均值后乘以10⁴，计算出细胞总数。
   2. 在接种细胞前向培养皿中加入培养基。以滴加方式加入细胞，随后轻轻旋转培养皿，确保细胞在皿内均匀分布。
      注：经过3次传代后，贴壁细胞应呈现不对称的梭形形态。可通过流式细胞术和分化实验进一步确认ASC的表型与生物学特性。
4. 使用流式细胞术和分化实验确认ASC的表型与生物学特性
   1. 流式细胞术
      1. 按照上述方法收集并离心获得细胞沉淀。用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀，然后根据制造商推荐的用量加入抗体对细胞进行标记。有关流式细胞术（一种常见的实验室操作）的详细实验方案，请参见此处^12,14,15。
      2. 从以下表面标志物组合中选择用于确认ASC表型：CD14、CD31、CD34、CD45和CD106为阴性；CD29、CD36、CD44、CD73、CD90和CD105为阳性^16,17,18,19。CD36的表达以及CD106的缺失可用于区分ASCs与骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）²⁰。
   2. 分化实验：使用间充质干细胞分化试剂盒确认多向分化潜能。多个厂商提供可验证成脂、成骨和成软骨分化能力的试剂盒。根据制造商说明书，每3–4天更换一次试剂盒提供的培养基，持续3周或直至观察到形态学上的分化特征。
5. 将细胞进行多次传代培养；所需传代次数取决于具体应用。每次传代时，均应使用前述细胞表面标志物确认MSC的形态和表型，并确保其多向分化潜能未丧失。尽管不同供体间的扩增潜能存在差异，但大多数样本可扩增至6–9代。
6. 将细胞冻存并置于液氮中保存，以备后续使用。

4 ASCs 的冻存

1. 配制10 mL的冻存液A和冻存液B。
   1. 对于冻存液A，将20%胎牛血清（FCS）加入高糖DMEM培养基中。
   2. 对于冻存液B，将20%胎牛血清（FCS）和20%二甲基亚砜（DMSO）加入高糖DMEM培养基中。
2. 以300 × g 离心5分钟收集细胞。用少量冻存液A重悬细胞，并使用血细胞计数板按照步骤3.3.1进行细胞计数。
3. 计算使细胞重悬后达到终浓度为500,000–1,000,000个细胞/mL所需的最终体积。用冻存液A将细胞沉淀重悬于该最终体积的50%中。边轻轻振荡离心管，边逐滴缓慢加入等体积的冻存液B，以达到目标细胞浓度。
4. 立即将细胞分装至1–2 mL冻存管中进行冷冻。将冻存管置于程序降温仪中，或放入-80 °C的冻存盒中（可实现1 °C/min的降温速率）进行冷冻。完成程序降温后（若使用冻存盒则过夜），将细胞转移至液氮中长期保存。

结果

采用本文详述的方法，成功地从吸脂术和腹壁成形术样本中分离出脂肪来源的基质细胞（ASCs）（图1）。经过三次传代后，分离的细胞表现出间充质干细胞（MSC）的形态（不对称、纺锤形）和表型，与经酶消化法获得的ASCs相似（图2）。我们团队及其他研究团队的前期研究表明，这些ASCs可分化为脂肪细胞、成骨细胞和神经元，与其他来源的MSC（包括通过其他方法分离的ASCs）类似^11,21。

大多数情况下，通过明场显微镜可在3–5天内观察到ASCs迁移至组织培养板。然而，某些情况下，7天后仅可见少量细胞。极少数情况下，细胞未能迁移至培养板和/或在第三代之前未发生增殖。该结果通常与组织样本处理延迟相关。

图1：从腹壁成形术和吸脂术样本中分离ASC的示意图。 腹壁成形术和吸脂术样本取自常规手术后废弃的组织。腹壁成形术样本经剪碎处理后，将腹壁成形术或吸脂术样本作为组织外植体接种于组织培养基中。ASC从组织中迁移出来，向营养丰富的培养基移动。一周后，移除外植体，继续培养ASC用于后续实验和/或临床应用。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：具有间充质干细胞形态和表型的分离脂肪源性干细胞（ASCs）。 通过无酶的组织块法分离的ASCs在第3代时表现出间充质干细胞（MSC）的形态和表型。(A) 与其他MSCs相似，无论采用组织块法还是酶消化法（如胶原酶法）分离，这些ASCs均呈现不对称的纺锤形形态。采用酶法分离的ASCs形态更细长、狭窄，而组织块法分离的ASCs形态更接近于其他无酶分离方法获得的MSCs，例如骨髓来源的MSCs。(B) 与其他MSCs类似，组织块法分离的ASCs对CD45呈阴性，对CD73、CD90和CD105呈阳性。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

由于组织易于获取，ASC 是一种颇具吸引力的 MSC 来源。在临床和科研应用中，科研人员在分离和培养这些细胞时必须考虑供体间的差异性。由于尚未阐明的原因，来自不同供体的 MSC 在体外增殖能力上表现出差异，这将继而影响 ASC 从脂肪组织外植块中迁移出来的能力及其增殖潜力。尽管从这些无酶处理的外植块中分离得到的 ASC 达到汇合所需时间存在个体差异，但样本在体外无法增殖的情况极为罕见。

除供体差异外，细胞无法从组织中迁移出来和/或在体外增殖的最可能原因是在处理前组织储存的时间过长。当样本在处理前放置时间超过>12 小时，或在采集至处理期间未保持湿润时，细胞的迁移和增殖率明显降低。其中经常无法增殖的样本是那些未用生理盐水保持湿润的腹部整形术样本：在这种情况下，组织块中心的组织通常仍足够湿润可用于处理，但偶尔也不得不丢弃。因此，从组织采集到处理的整个过程中保持组织湿润至关重要。

若在第1周时未在培养板上观察到ASCs，则仍应从组织培养板中移除脂肪组织块，以防止组织坏死。有时细胞数量过少而难以识别，但这些少量细胞仍可在培养体系中扩增。若在3周时仍未观察到细胞，则视为分离失败。

在某些情况下，特别是进行腹壁成形术时，由于手术环境的限制，可能无法获得真正无菌的样本。如果无法使用无菌容器将组织从手术室运送至超净工作台，则通常切除组织外层约1 cm即可有效防止微生物污染。若腹壁成形术样本附有皮肤，可在切碎脂肪组织前，先用70%乙醇擦拭皮肤表面，以对该区域进行消毒。

在剪碎组织的过程中，必须将组织剪切成细小的碎片。如果组织块过大，则不利于脂肪来源干细胞（ASCs）从组织中迁移至培养板表面。此外，组织在培养板中停留的时间不应超过必要时长，以免组织发生坏死。

该方法的一个局限性是在组织培养过程中使用酶（在所述方案中为胰蛋白酶）来解离ASCs。可以使用其他非动物来源的酶（如Accutase）替代，以避免使用动物来源的制品，但这将增加组织培养的成本。因此，以及其他原因，许多研究团队正在探索非二维的组织培养方法，例如生物反应器和基于支架的培养系统，以提高MSC的增殖潜能，同时尽量减少细胞从其基质上解离的需求²²。

将脂肪干细胞（ASCs）应用于临床时，组织块分离法的一个主要局限性在于其依赖于符合药品生产质量管理规范（GMP）标准的组织培养设施，而许多医疗机构并不具备此类条件。在这种情况下，需采用任何一种 commercially available 的封闭式酶解法或离心法。然而，随着GMP设施日益普及，这一限制预计将逐渐减弱。与此同时，即使缺乏GMP级组织培养设施的机构，也可考虑使用组织块法在体外研究ASCs：操作越少，这些细胞越接近其体内状态¹¹。

该方法提供了一种简单的方式，可在无需使用剧烈酶解或离心步骤的情况下，从脂肪组织（包括吸脂术获取物和腹部整形术获取物）中分离脂肪源性基质细胞（ASCs）。尽管ASCs的初始得率低于其他方法，但这些细胞可在体外增殖，从而最大限度地减少初始得率较低的影响。由于该方法避免了过度或强力的操作，所分离的ASCs具有更高的相关性，因为由此引发的问题更少（例如，所观察到的效应究竟是源于细胞本身，还是源于分离过程中对细胞的操作）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二甲基亚砜	Fisher Bioreagents	BP231
杜尔贝科改良伊格尔培养基 - 高糖	Sigma-Aldrich	D5671
Falcon 3003 组织培养板	Corning	Corning
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F2442	血清经批次检测，以确保支持间充质干细胞生长
L-谷氨酰胺溶液	Sigma-Aldrich	G7513
Mr. Frosty	Nalgene	5100-0001
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4333
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	T4049