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方法文章

神经疾病中的脂质组学与转录组学

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DOI：

10.3791/59423

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2022年3月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiological Chemistry, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

本文内容

摘要

本文介绍了一种模块化方案，用于神经系统疾病小鼠模型中的组织脂质组学和转录组学以及血浆脂质组学研究，重点针对与炎症和神经元活动相关的脂质、膜脂质、下游信使分子，以及编码脂质功能相关酶/受体的mRNA。文中概述了样本采集、样品处理、提取及定量分析的操作流程。

摘要

脂质作为脑部损伤或诱发神经系统疾病的刺激因素的主要界面，同时也是具有多种信号传导或配体功能的脂类物质的储存库，可能在疾病的发生与发展过程中发挥关键作用。脂质常在症状出现前即发生改变，因此正逐渐成为药物靶点和生物标志物的重要来源。许多神经系统疾病均表现出神经炎症、神经退行性变以及神经元兴奋性异常等共同特征，这些过程部分受到特定脂质信号系统的调控。多种脂质在合成上的相互依赖性和关联性，促使研究需采用多脂质、多酶及多受体联合分析策略，以揭示不同神经系统疾病背景下的共性与特异性，并加速解析疾病发生与进展的机制。明确脂质在不同脑区中的特定作用，有助于推进与神经系统疾病相关的脂质分子表型及形态学特征的确定。

本文介绍了一种模块化实验方案，适用于分析与特定神经系统疾病和/或状态相关的离散脑区中提取的膜脂质、下游脂质信号分子，以及介导其功能的酶和介质的mRNA。为确保准确的比较性脂质组学分析，本方案对以下流程和操作标准进行了优化和标准化：i）脑组织取样及目标脑区的分离；ii）多种脂质信号分子与膜脂质的共提取；iii）脂质与mRNA的双相提取；iv）采用液相色谱-多反应监测（LC/MRM）进行定量分析；v）标准mRNA表达谱分析。该流程适用于通过功能离散脑亚区取样（如脑组织穿孔法）所获得的微量组织样本，从而避免因组织异质性或动物个体差异导致的多分子分析偏差。为揭示神经系统疾病的外周影响，并建立神经系统疾病状态的可转化分子读数，本文还开展并描述了外周器官的取样与处理、后续脂质组学分析以及血浆脂质组学分析。本方案以急性癫痫小鼠模型为例进行了演示。

引言

脂质功能及其在神经系统疾病发生和发展中作用的最新研究进展，为发现新的治疗靶点和阐明疾病机制开辟了新的研究与开发方向1。现代分子成像技术（如质谱成像和高阶质谱分析）已明确揭示不同脑区之间存在脂质组成差异，这使得脂质研究的范式从全脑水平转向功能上独立且解剖上分立的特定脑区。由于不同脑区的脂质组成存在差异，促使人们重新思考在脑损伤或刺激条件下，功能各异的脑区中膜脂质敏感性及下游脂质信号传导的机制。因此，脂质研究方法亟需进一步发展，以应对组织样本量少所带来的高空间分辨率检测与定量挑战，同时实现对细胞膜和信号通路中多种脂质成分的联合分析。此外，明确参与调控脂质水平与功能的酶、脂质配体及其受体，对于阐明神经系统疾病中受影响的信号通路、并指导病理生理背景下新的机制性研究至关重要。

除了提高大脑空间分辨率外，新型神经脂质组学方法的发展还面临两大主要困难。首先，与膜结构脂质相比，脂质信号分子通常丰度极低。其次，脂质组具有高度的结构异质性，难以通过单一分析方法进行解析。因此，提取和分析方法需针对不同类别的脂质进行定制，通常在不同的组织样本中分别进行2。霰弹枪脂质组学方法3是快速揭示膜脂质广泛谱型的优秀工具，而靶向发现与定量质谱方法则因其更高的灵敏度和选择性，被广泛用于研究低丰度信号脂质，包括：i）炎症性脂质和ii）参与神经元活动调节的脂质，如内源性大麻素（eCBs）、氨基酸连接脂质等4,5。为了全面涵盖神经系统疾病模型中脑区细胞膜和 信号水平上的脂质变化，通常需在不同组织样本中分别进行脂质提取与分析，这些样本可能来自不同动物批次、不同半脑，或通过将较大组织区域分割为多个部分获得。当同时关注酶和受体的mRNA水平时，其检测通常也需要独立的组织样本。例如，对膜脂质、内源性大麻素和mRNA的研究将需要三个不同的组织样本（例如，两个样本分别用于两种脂质提取方法——膜脂质和信号脂质——以及后续的两种脂质分析方法，一个样本用于mRNA分析）。对炎症性脂质和内源性大麻素的研究则分别需要两个独立的组织样本、提取方法和分析方法。另一个例子是对脑组织穿孔或激光显微切割样本中mRNA及任一类脂质的研究，这相应地需要两只动物，以从每个脑（亚）区获取两个样本。在这种情况下，结果常常出现较大程度的变异性或重复性差，其来源主要是生物学变异和/或组织异质性。基于上述多分子分析在实际操作中的局限性，尤其是在脑组织高空间分辨率研究中的挑战，我们设计了一种三模块神经脂质组学方案，包括：1）采用LC/MRM技术对炎症性脂质（如二十碳类化合物（eiCs））以及参与神经元活动调节的脂质（如eCBs）进行共提取与共分析2；2）对磷脂（PLs）和eCBs进行共提取，随后进行多扫描LC/MRM及前体离子/中性丢失扫描分析2；以及3）对膜（磷）脂质、eCBs和mRNA进行双相提取，随后进行LC/MRM和qPCR或RNA测序分析6。根据所研究的神经系统疾病及目标脑区的具体生物学问题，可在同一组织样本上联合应用第一和第二种方案，或第一和第三种方案，适用于约4 mg重的组织。第一和第三种方案可独立用于约2 mg的组织。第二种方案则可应用于低至0.5 mg的组织。无论选择哪种神经脂质组学方案模块，组织取样与分析前处理、脑组织分离与区域解剖，以及动物模型处死的操作流程在所有三个模块中均标准化且保持一致。在我们对神经系统疾病的研究中，始终同时采集并分析与疾病病理后果相关的外周器官组织，使用上述模块化方案进行检测。此外，常规采集血液样本进行血浆脂质组学分析，以期为神经系统疾病的转化应用提供读出指标。本文所介绍的模块化脂质组学方案具有高度通用性：可扩展至更大组织量，并可广泛适用于几乎所有组织类型和疾病。在神经系统疾病中应用该模块化方案（图1）时，任何标准化的啮齿类动物神经疾病发生与进展模型，如创伤性脑损伤、帕金森病、阿尔茨海默病或癫痫模型，均可适用。

这些方案已广泛应用于研究海人酸（kainic acid, KA）诱导的小鼠癫痫模型在癫痫急性期的组织脂质组和/或转录组变化2,7，该模型因其与人类颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy, TLE）高度相似，被广泛用于临床前研究8,9,10,11。利用这些方案，研究人员在同一癫痫小鼠模型中评估了棕榈酰乙醇胺（Palmitoylethanolamide, PEA）等药物的治疗潜力12,13。该研究在癫痫发作强度达到峰值的时间点（发作诱导后60分钟），以及在KA诱导癫痫发作后不同时间点（20、60、120和180分钟）进行急性与亚慢性PEA治疗期间，以高和低空间分辨率检测了脑组织及外周组织中的脂质和mRNA变化，覆盖了癫痫急性期的时间窗口。在各个时间点采集了未治疗的KA注射小鼠、急性及亚慢性PEA处理小鼠，以及溶剂对照和PEA溶剂对照小鼠的血浆、脑组织和外周器官样本12,13，并对其进行上述分子分析。分子数据与通过癫痫评分获得的行为表型，以及基于免疫组织化学的神经退行性过程数据进行了关联分析，以揭示癫痫急性期的进展机制及PEA缓解该过程的潜在作用。

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方案

此处描述的所有实验操作均符合欧盟2010年9月22日发布的《欧洲共同体理事会指令》（2010/63/EU），并已获得德国莱茵兰-普法尔茨州当地动物伦理委员会批准（文件编号：23 177-07/G16-1-075）。

1. 急性及预防性治疗KA诱导癫痫的动物模型

  1. 进行癫痫发作诱导、治疗及行为学评分。
    1. 将小鼠按组别分笼单独饲养（每组至少 n = 6 只小鼠）。
    2. 配制癫痫发作诱导用注射溶液及其相应溶剂（见表 1），以及治疗用注射溶液及其相应溶剂（见表 2）。
    3. 根据小鼠所属组别（疾病组、治疗组或溶剂对照组，即 KA 组、PEA 治疗的 KA 组及两个溶剂对照组），在无麻醉条件下进行腹腔注射（i.p.，剂量为 10 mL/kg 体重）。参见图 2、表 1 和 表 2。
    4. 按照以下标准化癫痫发作强度评分标准进行行为学观察与评分：0 = 无反应；1 = 静止不动、凝视；2 = 前肢和/或尾巴伸展、僵直姿势；3 = 重复性动作、点头；4 = 站立并跌倒；5 = 持续站立并跌倒；6 = 严重阵挛-强直性癫痫发作；7 = 死亡14,15（图 3）。
  2. 实施安乐死程序，用于脂质组学和转录组学分析。
    1. 在KA或溶剂注射后的四个时间点（即20、60、120和180分钟），根据IACUC批准的实验方案，分别从以下各组中各处死6只小鼠：PEA治疗组、未接受PEA治疗的癫痫溶剂对照组1和溶剂对照组2。
    2. 到达每个时间点后10秒，使用浸有异氟烷的纱布在玻璃 chamber 中对小鼠进行麻醉。通过翻转玻璃 chamber 缓慢移动小鼠，若其失去翻正反射（即无法自主调整体位），则确认麻醉成功。使用手术剪迅速断头，并采集血浆、脑组织及外周器官（见步骤 2.2.2−2.2.4）。
      警告：不同地区动物伦理委员会对安乐死操作的伦理规定存在差异，请务必查阅并遵守当地动物伦理委员会发布的相关规定。
  3. 实施安乐死程序，用于免疫组织化学分析。
    1. 进行免疫组织化学染色13时，对以下各组小鼠（PEA治疗组、未接受PEA治疗的癫痫组及溶剂对照组）在全部观察期间（180分钟）的行为学表现进行评分，每组取3只小鼠。
    2. 5天后实施安乐死并进行灌流。通过腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）和布托啡诺（0.1 mg/kg）对小鼠进行深度麻醉（小鼠分组见步骤 1.3.1）。通过检测足趾间反射是否消失来确认深度麻醉状态。
    3. 将小鼠固定于聚苯乙烯板上，使用精细剪刀和标准镊子立即打开胸腔。将蝶形针插入左心室，并用精细剪刀剪开右心房。
    4. 调节泵速和压力，维持恒定的蠕动流速（2−3 mL/min），用冰浴预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）灌流约5分钟。如有必要，更换蝶形针。
      注意：灌流充分时，内脏器官（脾脏除外）通常在1−2分钟内开始褪色。
    5. 切换至冰浴预冷的4%多聚甲醛（PFA）溶液继续灌流约5分钟。按步骤 2.2.2 所述方法完整取出脑组织，并在4% PFA溶液中于4 °C固定24小时。
    6. 将脑组织在30%蔗糖溶液中4 °C孵育48小时。用干燥的纸巾吸除残留蔗糖溶液后，将脑组织置于金属板上（-80 °C）冷冻。将脑组织保存于-80 °C，以备后续染色操作13。

2. 用于脂质组学/转录组学分析的采样流程

  1. 采样前准备。
    1. 将用于血浆采样的 EDTA 管预冷至 4 °C。将离心机和涡旋振荡器预冷至 4 °C。将覆盖铝箔的金属板置于干冰（-80 °C）上预冷，用于快速冷冻脑组织或其他目标组织。将标记好的 2 mL 和 5 mL 管分别在干冰（-80 °C）上预冷，用于血浆分装、冷冻组织和脑组织收集。使用棕色管以保护对光敏感的分子，例如 eiCs。
    2. 使用消毒剂（如 70% 乙醇）清洁组织采样和分离设备（手术剪、直头精细尖头剪、直头光滑标准镊子、镜面精细镊子、弯头镊子和刮匙、聚苯乙烯泡沫板以及固定用针头）。
  2. 采样流程
    1. 确定采样顺序。
      1. 断头后立即在预冷的 1 mL EDTA 管中采集血液（见步骤 2.2.3）。
      2. 取出完整脑组织，并在取出后立即进行快速冷冻。此步骤耗时 1−2 分钟。将冷冻脑组织储存在 -80 °C 下以备后续处理（见步骤 2.2.2）。
      3. 在脑组织取出后 5 分钟内，取出感兴趣的外周器官（如肺、心脏、肝脏），并立即快速冷冻，储存在 -80 °C 下以备后续处理（见步骤 2.2.4）。
    2. 取出脑组织用于解剖或打孔操作。该操作每只脑组织耗时 1−2 分钟。
      1. 断头后（见步骤 1.2），使用精细剪刀从皮肤正中线开始做切口。将皮肤翻过眼睛以暴露颅骨。到达颅顶后，在顶间骨水平处开始向尾侧做小切口。注意避免切穿脑组织。
      2. 用力剪断两眼之间颅骨最前部，以便取出脑组织。使用窄型弯头镊子撬起一侧顶骨并折断。对另一侧重复此操作。
      3. 去除脑膜。将刮匙插入脑组织前部（即嗅球）下方，轻轻向上抬起脑组织。继续将刮匙向后滑动，以切断视神经及其他颅神经。
      4. 将脑组织从颅腔中取出，并立即将整个脑组织腹面朝下放置在预冷（-80 °C）的金属板上进行快速冷冻（背面向上）。
      5. 待脑组织完全冻结后，转移至预冷的 5 mL 管中，并在 -80 °C 下保存，直至进行脑区解剖或打孔操作（见步骤 3.1 和 3.2）。
    3. 进行血浆采样。
      1. 向预冷的 EDTA 管中加入 10 µL 新鲜配制的吲哚美辛稀释液，使其终浓度为 10 µM。
      2. 断头后立即通过轻柔挤压躯体将躯干血液收集至预冷的 EDTA 管中，最大采血量为 1 mL。
        注：若血压正常，则无需挤压。若采血量少于 1 mL，可缩短异氟烷麻醉时间以保证正常血流。
      3. 立即将血液样本在 4 °C 条件下以 2,000 x g 离心 10 分钟。
      4. 移取上层血浆相，并为多脂质分析目的，将确定体积的血浆分装至预冷的 2 mL 管中：50 µL 用于 eCBs/eiCs 分析，30 µL 用于 PLs 分析，剩余血浆作为备份样本或用于其他类型分析。
      5. 将血浆样本在 -80 °C 下保存，用于后续提取（见步骤 4.1.2 和 4.1.4）。
    4. 进行外周器官采样。
      注：参考小鼠解剖学资料16 及动物实验人员所参加的强制性课程（FELASA）提供的文档，以识别各个器官、其结缔组织和/或血管。
      1. 使用针头固定小鼠躯干，便于器官取出。在耻骨水平处使用直头尖锐剪刀做腹侧正中切口。剪开腹腔时，用钝头标准镊子固定腹壁。
      2. 固定皮肤，以便使用钝头镊子取出腹腔器官。如需取出心脏或肺脏，继续沿胸腔方向做正中切口。使用精细镊子取出肺脏和/或心脏。
      3. 小心打开胸腔，避免出血。剪断固定相应器官的结缔组织和血管，但不要切穿器官本身。
      4. 立即将组织块转移至预冷的金属板（-80 °C）上，待其完全冻结后，转移至预冷的试管中，并在 -80 °C 下保存以备后续处理（见步骤 4.1）。

3. 生物材料处理

注意：对于内源性大麻素（eCBs）/内源性类花生酸类物质（eiCs）的共提取，使用2 mL棕色管作为提取管，并在每根管中加入七颗预冷的钢珠。对于磷脂（PLs）/内源性大麻素（eCBs）的共提取以及脂质与RNA的双相共提取，使用含有陶瓷珠的2 mL无RNA酶提取管（材料表）。

  1. 进行脑组织解剖和外周器官处理。
    注意：使用放大灯以增强脑组织在解剖过程中的可见性。
    1. 用70%乙醇将手术器械（包括超细尖镊子）清洗2次。
    2. 将冻存的大脑从 -80 °C 转移至含有预冷生理缓冲液（pH 5.5）的培养皿中，确保培养皿温度保持在 4 °C。待大脑完全解冻后再进行解剖操作。使用镊子小心测试组织状态。
      警告：脑组织在 4 °C 下保存的时间不得超过解冻所需时间。
    3. 将金属板置于冰上（4 °C）预冷，并用浸有冰冻生理缓冲液（pH 5.5）的湿纱布覆盖，小心将脑组织腹面朝上转移至预冷的（4 °C）金属板上。用浸有冰冻生理缓冲液（pH 5.5）的湿纱布覆盖脑组织。
    4. 使用超细尖镊子在5分钟内解剖脑区。首先取下丘脑（HYP），然后将背侧朝上，继续解剖右侧。分离右侧海马（HCr）、右侧前额叶皮层（PFCr）、右侧纹状体（STRr）和右侧大脑皮层（cCTXr）。随后解剖左侧，分离左侧海马（HCl）、左侧前额叶皮层（PFCl）、左侧纹状体（STRl）和左侧大脑皮层（cCTXl）。解剖小脑及丘脑区域。参考已发表的解剖学文献16,17 用于脑区鉴定。
    5. 将每块解剖组织直接转移至预先冷却的、覆盖铝箔的金属板（-80 °C）上。待其冻结后，将分离的脑区转移至已标记的预冷2 mL离心管中。
    6. 使用组织研磨仪（在 -80 °C 下）将组织块粉碎，避免组织解冻。在低温环境中，将组织粉末分装至预冷的、已标记并含有陶瓷珠或钢珠的提取管中。进行脂质组学/转录组学联合分析时，需在低温环境中称量各份组织粉末。仅进行脂质组学分析时，可选择根据组织重量或蛋白含量进行归一化；若选择后者，则无需称量组织，直接进行后续操作。
    7. 用手术剪将外周器官组织剪切成最大重量为20 mg的组织块。按3.1.6步骤进行组织粉碎。
    8. 继续进行组织样本的提取（参见步骤 4.1.1、4.1.3 或 4.1.5），或将试管保存于 -80 °C 以备后续提取。
      注意：如果研究设计允许，也可使用脑组织矩阵。然而，该方法更适用于数量有限且位置明确的脑区，而在规定的时间范围内分离和获取上述所有脑区并不现实。
  2. 进行脑组织取样。
    1. 将完整的冷冻脑组织安装到切片装置上（材料表在恒冷切片机中设置切片厚度为50 µm，并在修片模式下靠近目标区域进行切片。
    2. 使用甲苯胺蓝（0.1%−1%）对脑切片（18−20 µm）进行染色，作为定位目标亚区的参考。在显微镜下观察染色切片，以确定需打孔的感兴趣区域。参考小鼠脑图谱，定位相应的脑解剖区域16使用预冷的样品钻孔器，在预冷的离心管中取直径为0.8−1.0 mm的组织样本。
    3. 在低温室内，将冷冻组织块称重后放入已预冷并标记的2 mL提取管中，管内含陶瓷珠或钢珠。若需共提取eCBs和eiCs，则使用棕色管。
    4. 开始提取（参见步骤 4.1.1、4.1.3 或 4.1.5），或将试管置于 -80 °C 保存以备后续提取。
  3. 进行血浆处理。
    1. 将冷冻的血浆样本置于冰上（4 °C），使其解冻（约20分钟）。
    2. 确保在开始提取前血浆已完全解冻。
    3. 继续进行血浆提取操作（见步骤 4.1.2 或 4.1.4）。
      注意：血浆样本在提取前应始终保持在 -80 °C。避免反复冻融循环。

4. 提取步骤

  1. 进行液-液（LLE）脂质共提取实验。
    1. 从脑组织碎片、穿孔样本或组织粉末样本中进行eCBs和eiCs的共提取。
      注意：整个操作过程中均需精确移液。
      1. 将含有组织样本和7个钢珠的提取管置于冰上（4 °C）。加入600 µL预冷的MTBE和50 µL ACN/H2O (1:1；v/v) 溶液，其中含有内标物。在最终分析体积（50 µL）中，各内标物的目标浓度如下：AEA-d4 为 1 ng/mL，2-AG-d5 为 125 ng/mL，AA-d8 为 3,000 ng/mL，OEA-d4 和 PEA-d4 均为 2 ng/mL，1-AG-d5 为 12.5 ng/mL，PGF2α-d4 为 2.5 ng/mL，PGD2-d4、PGE2-d9、5(S)-HETE-d8、12(S)-HETE-d8、20-HETE-d6 和 TXB2-d4 均为 5 ng/mL。
      2. 加入 400 µL 0.1 M 甲酸，使用组织研磨器匀浆（30 秒至 1 分钟）。将匀浆液在 5,000 x g 条件下离心 15 分钟 g 在 4 °C 下孵育。将水相下层于 -80 °C 冷冻 10 分钟，以方便上层有机相的转移。
      3. 将有机相转移至新管中。在温和的氮气流下蒸发。2 在 37 °C 下重新溶解，并用 50 µL 乙腈/水（ACN/H）复溶2O（1:1；v/v）用于进一步分析。
      4. 将水相储存于 -20 °C 或 -80 °C，用于后续蛋白质含量分析。
    2. 从血浆样本中进行内源性大麻素（eCBs）和内源性类花生酸类物质（eiCs）的共提取。
      1. 在 4 °C 下解冻血浆等分试样。加入 800 µL MTBE 和 50 µL ACN/H2O（1:1；v/v）混合液，其中含有内标物（与组织分析所用内标物类似，参见步骤 5.1.1）。使用参考血浆样品优化内标物的加标浓度。
      2. 加入 600 µL 0.1 M 甲酸，在 4 °C 下涡旋振荡样品 2 分钟。在 4,000 x g 4 °C下离心15分钟。
      3. 将有机相转移至新管中，在温和的氮气流下蒸发2 在 37 °C 下重新溶解，并用 50 µL 乙腈/水2O（1:1；v/v）用于LC/MRM分析。
        注意：如果可能，应避免保存eiCs的干燥提取物，并立即进行LC/MRM分析。若无法避免保存，则仅可在4°C下短期储存2−3天，样品需置于LC进样溶剂中。
    3. 从脑区、组织穿孔样本或其他组织粉末样本中进行PLs和eCBs的共提取。
      1. 将含有组织样本和陶瓷珠的提取管置于冰上（4 °C）。加入800 µL MTBE/MeOH（10:3；v/v）以及含有内标物的10 µL甲醇（MeOH）。最终分析体积（100 µL）中各内标物的目标浓度如下：PC 17:0/14:1、PE 17:0/14:1、PA 17:0/14:1 为150 ng/mL；PG 17:0/14:1、PS 17:0/14:1、PI 17:0/14:1、LPC 17:0、LPA 17:0、SM d18:1/12:0 为100 ng/mL；AEA-d4 为1 ng/mL；2-AG-d5 为60 ng/mL；AA-d8 为4,000 ng/mL；OEA-d2 为2 ng/mL；PEA-d4 为3 ng/mL。
      2. 加入200 µL含有25 µM四氢脂抑素/URB597和50 µg/mL BHT的0.1%甲酸溶液。使用组织匀浆器匀浆材料表) 并在 5,000 x g 4 °C 下孵育 15 分钟
      3. 将上层有机相转移至新管中，并在温和的氮气流下蒸发2 在37 °C下孵育。用90 µL甲醇重悬，可于-20 °C或-80 °C保存，或直接进行下一步操作。
      4. 加入10% H2向一份脂质提取物（4.1.3.3）中加入内标，取10 µL注入液相色谱-质谱联用仪（LC/MS）用于磷脂分析。 如需进行进一步的eCB分析，请继续执行步骤4.3.5。
      5. 取一份提取液（4.1.3.3），蒸干后用乙腈/水（ACN/H₂O）重新溶解2O (1:1；v/v)。取20 µL用于LC/MS进样以分析eCB。
    4. 从血浆样本中进行磷脂和内源性大麻素的共提取。
      1. 在 4 °C 下解冻血浆等分试样，加入 1,000 µL 甲基叔丁基醚/甲醇（10:3；v/v）和 10 µL 甲醇 含有 内标物（类似于步骤 4.1.3）并在 4 °C 下涡旋震荡 1 分钟。
      2. 加入 250 µL H2O，4 °C下涡旋振荡45分钟。5,000 x g离心15分钟。 g 以及 4 °C。回收上层有机相，在温和的氮气流下蒸发2 在37 °C下孵育，并用90 µL甲醇重悬，用于后续LC/MS分析。可于-20 °C或-80 °C保存，或直接进行下一步操作。
      3. 进行磷脂分析时，向一份脂质提取物（4.1.2.2）中加入10%的水。
      4. 用于eCB分析时，向脂质提取物的等分试样（见4.1.4.3）中加入10%水，蒸发至干燥，再用50%乙腈/水重新溶解2O (1:1；v/v)。
    5. 从组织样本中进行RNA和脂质的双重提取（磷脂和内源性大麻素的共提取）。
      注意：务必在无RNA酶的条件下操作，以避免RNA降解。
      1. 解冻组织粉末分装样本或脑组织块（置于4 °C），向含有冷冻脑组织穿孔样本和陶瓷珠的提取管中加入600 µL RLT缓冲液（含5 µM THL/URB597、10 µg/mL BHT和1% β-巯基乙醇，缓冲液终体积的百分比参见步骤4.1）以及200 µL氯仿。
      2. 加入10 µL用于PLs和eCB共提取的内标混合物（见步骤4.1.3），对尖峰样品进行匀浆处理（高速，20 s）。
      3. 将裂解液转移至新的离心管中，在4 °C条件下以最大速度离心5分钟，以实现相分离。
      4. 回收上层相，并使用标准RNA提取试剂盒进行RNA提取（材料表用50 µL无RNase的水洗脱RNA，总体积为50 µL，于-80 °C保存。
        注意：步骤 4.1.5.4 中的样品可根据适当的方法和仪器用于 RNA 测序和 qPCR。
      5. 使用含有氯仿的下层相进行脂质提取。加入800 µL MTBE/甲醇（10:3；v/v）和200 µL 0.1%甲酸，于4 °C条件下涡旋振荡45分钟。收集上层有机相，并在温和的氮气流下蒸发2 在 37 °C 下。
      6. 用 90 µL 甲醇重悬，用于后续 LC/MS 分析。储存于 -20 °C 或 -80 °C，或直接进行步骤 5。
      7. 加入10% H2取一份脂质提取物（见上述步骤 4.1.5.6），加入 O，取 10 µL 进行 LC/MS 分析以检测磷脂（PLs）。如需进一步进行内源性大麻素（eCB）分析，请继续执行步骤 5.7。
      8. 取一份提取液（见上述步骤 4.1.5.6），蒸发至干，然后用乙腈/水（ACN/H₂O）重新溶解2O (1:1；v/v)。取20 µL用于LC/MS进样，进行eCB分析（类似于步骤4.3.5）。

5. 液相色谱/多反应监测定性与定量分析

  1. 准备液相色谱溶剂体系、校准溶液和质控样品。
    1. 对于磷脂（PLs），配制流动相A：含7.5 mM甲酸铵和0.1%三乙胺（TEA）的甲醇/水（1:1；v/v）溶液。配制流动相B：含7.5 mM甲酸铵和0.1% TEA的甲醇/异丙醇（2:8；v/v）溶液。将溶剂储存于液相色谱瓶中。
    2. 对于内源性大麻素（eCB）和内源性大麻素类似物（eiC）的分离，配制以下液相色谱溶剂：含0.1%甲酸的水溶液作为流动相A，含0.1%甲酸的100%乙腈（ACN）作为流动相B。将溶剂储存于液相色谱瓶中。
    3. 使用校准标准品和内标物（表3）配制等摩尔浓度或用户自定义浓度的质控样品。
    4. 配制包含七个浓度点的标准曲线。使用同一批次的内标物对标准曲线溶液和待分析样品进行加标。
  2. 采用LC-MRM方法进行脂质的定性和定量分析。
    1. 在商用软件（如Analyst）中打开建立采集方法选项卡，选择LC/MRM模式并启用极性切换功能。在方法中设置用于定量分析的离子跃迁参数（见表3），设定稳定时间为50 ms。
    2. 进行磷脂（PLs）分析时，设定以下离子源参数：帘气（curtain gas）= 40 psi；源加热温度 = 550 °C；负离子模式下离子喷雾电压 = -4,500 V，正离子模式下 = +5,200 V。
    3. 进行eCB和eiC共分析时，设定以下参数：帘气 = 40 psi；源加热温度 = 550 °C；负离子模式下离子喷雾电压 = -4,500 V，正离子模式下 = +4,500 V。
    4. 进行PL分析时，设定柱温为45 °C，流速为200 µL/min，并设置以下梯度程序：0分钟时B相为40%；3分钟时为40%；42分钟时为90%；43分钟时为99%；50分钟时为99%；52分钟时回到40%。进样体积设为10 µL。
    5. 进行eCB和eiC分析时，设定柱温为室温，并设置以下梯度程序：0分钟时B相为20%；1分钟时为20%；5分钟时为50%；12分钟时为50%；13分钟时为90%；17分钟时为90%；17.5分钟时回到20%；20分钟时保持20%。进样体积设为20 µL。
      注：不同仪器平台的MRM条件可能存在差异，因此需通过实验确定碎裂条件和MRM参数，并根据需要测试和调整电离参数，以获得最佳灵敏度和选择性。
  3. 执行批量分析。
    1. 打开建立采集批处理界面，填写样品描述、自动进样器样品架中的位置以及采集方法（按步骤5.2设定）等必要参数。
    2. 在分析开始前、结束时以及批次内均应包含质控样品。每分析25−30个样品后，至少插入三条标准曲线，并在每个质控样品、标准曲线以及整批样品分析结束后加入一次清洗步骤，使用选定溶剂进行冲洗。
    3. 将步骤4中获得的样品转移至液相色谱/质谱（LC/MS）小瓶中。根据批处理中定义的位置，将样品放入自动进样器的样品架上，并将样品架装入LC自动进样器。
    4. 提交批处理任务并启动队列分析。
  4. 脂质定量
    1. 使用商用软件（如Analyst）及其内置的定量模块对eCB和eiC进行定量分析；使用另一商用软件（如Multiquant）对PLs进行定量分析。
      注：第二种软件也可用于eCB和eiC的定量，特别是在使用单一内标物对多个分析物进行定量时。
    2. 打开建立定量方法界面，填写分析物、内标物、MRM跃迁参数，并将内标物与待定量的分析物进行匹配（见表3）。设定最低峰高为500 cps。
    3. 采用以下一项或多项标准进行脂质鉴定及后续定量6：将内源性脂质分析物的保留时间与校准标准品和/或氘代内标物（如可用）进行比对；在无标准品的情况下，通过正负离子模式下的碎片离子比对特定脂质分析物的m/z值；参考文献中类似液相条件下脂质的洗脱行为，以区分同分异构体和/或同量异位结构；在条件允许时，采用与靶向分析（LC/MRM）相似的液相条件，结合高分辨质谱进行LC/MS和MS/MS分析，准确鉴定目标内源性脂质的结构和洗脱行为18,19。
    4. 为验证批处理分析的有效性，采用以下标准：定量准确度 ≤ ±20%；回归系数 ≥0.97（理想情况下 ≥0.99）。
      注：应遵循生物分析方法开发与验证的指导原则，确保目标分子分析的可靠性与可重复性。

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结果

可根据具体研究目的，以不同方式组合本文所述的实验方案，例如动物模型的选择、取样途径、提取方法及分析方法（图1）。

为了确定急性癫痫发作状态下脑内和外周组织中脂质水平随时间的变化，并揭示花生四烯酸乙醇胺（PEA）潜在的抗癫痫作用13及其对脑和外周脂质组变化的影响，本研究设置了三个实验动物组，分别给予溶剂对照、KA（诱导急性癫痫）以及PEA（作为候选抗癫痫药物）。PEA通过腹腔注射（i.p.）给药，于KA注射前给予（例如，急性治疗采用单次PEA注射，亚慢性治疗则给予两次PEA注射）。为满足治疗后5天进行多种分子分析和/或免疫组织化学染色的需要，动物实验根据需求重复进行（图2）。

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讨论

本文所述的神经脂质组学与转录组学方法可用于在脑组织及外周器官中，以高空间分辨率和低空间分辨率研究任何疾病或健康发育过程。由于优化了血浆采样与处理流程，可从用于组织脂质组学和转录组学分析的同一动物个体中获取血浆样本，进而开展血浆脂质组学分析，从而提高组织与血液分子关联性分析及生物标志物发现的可靠性。通过单独应用或组合应用这三种实验方案，可获得广泛的数据集，不仅有助于在特定研究背景（动物模型实验）下探究神经系统疾病，也有助于跨实验模型及不同实验背景之间的比较研究。此外，采样、样本处理和分子分析的高度标准化，有助于分子数据的高重复性，从而在不同研究之间及不同实验室之间可靠地比对分子变化。

然而，要实现这一目标，关键在于建立一种实验设计，以最大限度地发挥既定研究目标的检测潜力。为了在实验组之间对分子变化进行可靠的比较，建议每组至少使用十只动物，以弥补个体动物的变异性以及脂质水平的生物学差异范围。当动物获取和/或动物操作的后勤条件受限时，每组至少使用六只动物是确保统计分析可靠性的必要条件。样本量计算时需考虑模型相关的死亡率（即尽管模型可能存在一定的死亡率，每组仍至少需要六只、理想情况下十只动...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们谨将本文献给埃尔梅琳达·洛马佐博士。在本文稿即将完成之际，埃尔梅琳达·洛马佐博士不幸逝世。她以满腔热忱投身科学事业，无私地参与团队合作，致力于实现富有意义的科研目标，是科学精神的典范。她始终怀抱着为人类更大福祉作出实质性贡献的梦想。无论科学探索与人生道路多么艰辛，她善良的本性始终未曾动摇。她将永远是我们心中不可替代的宝贵存在。

Julia M. Post 的研究由约翰内斯·古腾堡-美因茨大学医学中心转化神经科学重点研究项目（FTN）资助，目前由SPP-2225 EXIT项目资助至LB。Raissa Lerner 的研究部分由德国心血管研究中心（DZHK）项目81X2600250资助至LB以及脂质组学核心设施资助。本研究的部分经费由约翰内斯·古腾堡-美因茨大学医学中心生理化学研究所脂质组学核心设施以及医学中心内部资金（资助至LB）提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12(S)-HETEBiomolCay10007248-25脂质标准品
12(S)-HETE-d8BiomolCay334570-25脂质标准品
1200系列液相系统Agilent仪器设备/LCMS
2100生物分析仪Agilent仪器设备/qPCR
5(S)-HETE-d8BiomolCay 334230脂质标准品
ABI 7300实时荧光定量PCR仪Applied Biosystems仪器设备/qPCR
乙腈LC-MS级Chroma Solv溶剂Honeywell9814920溶剂/LCMS
棕色Eppendorf管Eppendorf样品制备
Analyst 1.6.2软件AB SCIEX, Darmstadt软件
分析天平Mettler Toledo仪器设备/样品制备
花生四烯酸-d8质谱标准品BiomolCay-10007277脂质标准品
Bessmann组织研磨器Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)仪器设备/样品制备
BinoZeiss显微镜
裂解型Caspase 3抗体Cellsignaling9661S显微镜
Leica CM3050 S冷冻切片机Leica Biosystems仪器设备/样品制备
CTC HTC PAL自动进样器CTC Analytics AG仪器设备/LCMS
Dumont弯头镊子Dumoxel #7FST11271-30手术工具
Dumont超细尖头镊子#5SF（x2）FST11252-00手术工具
EDTA 1000 A RöhrchenKabe Labortechnik078001样品制备
EP-1 EconoPump泵BioRAD700BR07757仪器设备/样品制备
镜面抛光精细镊子FST11412-11手术工具
精细直头锐利虹膜剪FST14094-11手术工具
碳化钨直头精细剪刀FST14568-09手术工具
虹膜刮匙FST10094-13手术工具
红藻氨酸Abcamab120100抗癫痫药物
Lipid View软件AB SCIEX, Darmstadt软件
LPC 17:0Avanis Polaris855676P脂质标准品
LPC 18:0Avanis Polaris855775P脂质标准品
Luna 2.5µm C18(2)- HAST 100A液相色谱柱Phenomenex00D-4446-B0仪器设备/LCMS
放大照明灯Maul GmbH仪器设备/样品制备
甲醇LC-MS级Chroma Solv 99.9%Honeywell9814920溶剂/LCMS
Motic相机Motic显微镜
MTBEHoneywell34875-1L溶剂/LCMS
MultiQuant 3.0定量分析软件包AB SCIEX, Darmstadt软件
NanoDrop 2000c分光光度计Thermo Scientific仪器设备/qPCR
PA 16:0-18:1Avanis Polaris840857P脂质标准品
PA 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1404脂质标准品
棕榈酰乙醇胺BiomolCay90350-100脂质标准品
棕榈酰乙醇胺-d5BiomolCay9000573-5脂质标准品
PC 16:0-18:1Avanis Polaris850457P脂质标准品
PC 16:0-18:1Avanis Polaris850457P脂质标准品
PC 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1004脂质标准品
PE 16:0-18:1Avanis Polaris850757P脂质标准品
PE 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1104脂质标准品
PG 16:0-18:1Avanis Polaris840457P脂质标准品
PG 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1204脂质标准品
PI 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1504脂质标准品
Precellys 24Peqlab仪器设备/样品制备
Precellys陶瓷研磨珠üPeqlab91-pcs-ck14p样品制备
Precellys钢珠2.8 mmPeqlab91-PCS-MK28P样品制备
Precellys陶瓷研磨套件1.4 mmVWR91-PCS-CK14样品制备
前列腺素D2BiomolCay 12010脂质标准品
前列腺素D2-d4BiomolCay 312010脂质标准品
前列腺素E2BiomolCay10007211-1脂质标准品
前列腺素E2-d9BiomolCay10581-50脂质标准品
PS 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1304脂质标准品
Q Trap 5500三重四极杆线性离子阱质谱仪AB SCIEXAU111609004仪器设备/LCMS
实时荧光定量PCR系统Appliert Biosystem仪器设备/qPCR
消退素D1BiomolCay10012554-11脂质标准品
RNeasy Mini试剂盒 - 无RNA酶的DNase试剂组（50次）Qiagen79254样品制备
Security Guard预柱Phenomenex仪器设备/LCMS
Shandon盖板Thermo Fisher72110017显微镜
Shandon载玻片架及盖Thermo Fisher73310017显微镜
SM 18:0Avanis Polaris860586P脂质标准品
SM d18:1/12:0Avanis PolarisLM-2312脂质标准品
直头平滑标准镊子FST11016-17手术工具
ToughCut标准型手术剪FST14130-17手术工具
T3000 PCR仪Biometra仪器设备/qPCR
血栓素B2BiomolCay19030-5脂质标准品
血栓素B2-d4BiomolCay319030-25脂质标准品
Tissue Lyser II组织研磨仪Qiagen/ Retsch12120240804仪器设备/样品制备
Tissue TekSakura Finetek4583显微镜
甲苯胺蓝Roth0300.2显微镜
VapothermBarkey4004734仪器设备/样品制备
水LC-MS级Chroma Solv溶剂VWR9814920溶剂/LCMS

参考文献

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