方法文章

神经疾病中的脂质组学与转录组学

DOI：

10.3791/59423

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2022年3月18日

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1Institute of Physiological Chemistry, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

本文内容

摘要

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本文介绍了一种模块化方案，用于神经系统疾病小鼠模型中的组织脂质组学和转录组学以及血浆脂质组学研究，重点针对与炎症和神经元活动相关的脂质、膜脂质、下游信使分子，以及编码脂质功能相关酶/受体的mRNA。文中概述了样本采集、样品处理、提取及定量分析的操作流程。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脂质作为脑部损伤或诱发神经系统疾病的刺激因素的主要界面，同时也是具有多种信号传导或配体功能的脂类物质的储存库，可能在疾病的发生与发展过程中发挥关键作用。脂质常在症状出现前即发生改变，因此正逐渐成为药物靶点和生物标志物的重要来源。许多神经系统疾病均表现出神经炎症、神经退行性变以及神经元兴奋性异常等共同特征，这些过程部分受到特定脂质信号系统的调控。多种脂质在合成上的相互依赖性和关联性，促使研究需采用多脂质、多酶及多受体联合分析策略，以揭示不同神经系统疾病背景下的共性与特异性，并加速解析疾病发生与进展的机制。明确脂质在不同脑区中的特定作用，有助于推进与神经系统疾病相关的脂质分子表型及形态学特征的确定。

本文介绍了一种模块化实验方案，适用于分析与特定神经系统疾病和/或状态相关的离散脑区中提取的膜脂质、下游脂质信号分子，以及介导其功能的酶和介质的mRNA。为确保准确的比较性脂质组学分析，本方案对以下流程和操作标准进行了优化和标准化：i）脑组织取样及目标脑区的分离；ii）多种脂质信号分子与膜脂质的共提取；iii）脂质与mRNA的双相提取；iv）采用液相色谱-多反应监测（LC/MRM）进行定量分析；v）标准mRNA表达谱分析。该流程适用于通过功能离散脑亚区取样（如脑组织穿孔法）所获得的微量组织样本，从而避免因组织异质性或动物个体差异导致的多分子分析偏差。为揭示神经系统疾病的外周影响，并建立神经系统疾病状态的可转化分子读数，本文还开展并描述了外周器官的取样与处理、后续脂质组学分析以及血浆脂质组学分析。本方案以急性癫痫小鼠模型为例进行了演示。

引言

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脂质功能及其在神经系统疾病发生和发展中作用的最新研究进展，为发现新的治疗靶点和阐明疾病机制开辟了新的研究与开发方向1。现代分子成像技术（如质谱成像和高阶质谱分析）已明确揭示不同脑区之间存在脂质组成差异，这使得脂质研究的范式从全脑水平转向功能上独立且解剖上分立的特定脑区。由于不同脑区的脂质组成存在差异，促使人们重新思考在脑损伤或刺激条件下，功能各异的脑区中膜脂质敏感性及下游脂质信号传导的机制。因此，脂质研究方法亟需进一步发展，以应对组织样本量少所带来的高空间分辨率检测与定量挑战，同时实现对细胞膜和信号通路中多种脂质成分的联合分析。此外，明确参与调控脂质水平与功能的酶、脂质配体及其受体，对于阐明神经系统疾病中受影响的信号通路、并指导病理生理背景下新的机制性研究至关重要。

除了提高大脑空间分辨率外，新型神经脂质组学方法的发展还面临两大主要困难。首先，与膜结构脂质相比，脂质信号分子通常丰度极低。其次，脂质组具有高度的结构异质性，难以通过单一分析方法进行解析。因此，提取和分析方法需针对不同类别的脂质进行定制，通常在不同的组织样本中分别进行2。霰弹枪脂质组学方法3是快速揭示膜脂质广泛谱型的优秀工具，而靶向发现与定量质谱方法则因其更高的灵敏度和选择性，被广泛用于研究低丰度信号脂质，包括：i）炎症性脂质和ii）参与神经元活动调节的脂质，如内源性大麻素....

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方案

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此处描述的所有实验操作均符合欧盟2010年9月22日发布的《欧洲共同体理事会指令》（2010/63/EU），并已获得德国莱茵兰-普法尔茨州当地动物伦理委员会批准（文件编号：23 177-07/G16-1-075）。

1. 急性及预防性治疗KA诱导癫痫的动物模型

  1. 进行癫痫发作诱导、治疗及行为学评分。
    1. 将小鼠按组别分笼单独饲养（每组至少 n = 6 只小鼠）。
    2. 配制癫痫发作诱导用注射溶液及其相应溶剂（见表 1），以及治疗用注射溶液及其相应溶剂（见表 2）。
    3. 根据小鼠所属组别（疾病组、治疗组或溶剂对照组，即 KA 组、PEA 治疗的 KA 组及两个溶剂对照组），在无麻醉条件下进行腹腔注射（i.p.，剂量为 10 mL/kg 体重）。参见图 2、表 1 和 表 2。
    4. 按照以下标准化癫痫发作强度评分标准进行行为学观察与评分：0 = 无反应；1 = 静止不动、凝视；2 = 前肢和/或尾巴伸展、僵直姿势；3 = 重复性动作、点头；4 = 站立并跌倒；5 = 持续站立并跌倒；6 = 严重阵挛-强直性癫痫发作；7 = 死亡14,

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结果

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可根据具体研究目的在不同层面组合所述的一系列方案，例如动物模型的选择、取样途径、提取方法及分析方法（图1）。

为了确定急性癫痫发作状态下脑内及外周组织中脂质水平随时间的变化，并揭示棕榈酰乙醇胺（PEA）潜在的抗癫痫作用13及其对脑和外周脂质组变化的影响，本研究设置了三组实验动物，分别给予溶剂对照、KA（诱导急性癫痫）以及PEA（作为候选抗癫痫药物）。PEA通过腹腔注射（i.p.）给药，于KA注射前给予（例如，急性治疗采用单次PEA注射，亚慢性治疗则给予两次PEA注射）。为满足治疗后5天进行多种分子分析和/或免疫组织化学染色的需要，动物实验根据需求重复进行（图2）。

K.......

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讨论

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本文所述的神经脂质组学与转录组学方法可用于在脑组织及外周器官中，以高空间分辨率和低空间分辨率研究任何疾病或健康发育过程。由于优化了血浆采样与处理流程，可从用于组织脂质组学和转录组学分析的同一动物个体中获取血浆样本，进而开展血浆脂质组学分析，从而提高组织与血液分子关联性分析及生物标志物发现的可靠性。通过单独应用或组合应用这三种实验方案，可获得广泛的数据集，不仅有助于在特定研究背景（动物模型实验）下探究神经系统疾病，也有助于跨实验模型及不同实验背景之间的比较研究。此外，采样、样本处理和分子分析的高度标准化，有助于分子数据的高重复性，从而在不同研究之间及不同实验室之间可靠地比对分子变化。

然而，要实现这一目标，关键在于建立一种实验设计，以最大限度地发挥既定研究目标的检测潜力。为了在实验组之间对分子变化进行可靠的比较，建议每组至少使用十只动物，以弥补个体动物的变异性以及脂质水平的生物学差异范围。当动物获取和/或动物操作的后勤条件受限时，每组至少使用六只动物是确保统计分析可靠性的必要条件。样本量计算时需考虑模型相关的死亡率（即尽管模型可能存在一定的死亡率，每组仍至少需要六只、理想情况下十只动.......

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们谨将本文献给埃尔梅琳达·洛马佐博士。在本文稿即将完成之际，埃尔梅琳达·洛马佐博士不幸逝世。她以满腔热忱投身科学事业，无私地参与团队合作，致力于实现富有意义的科研目标，是科学精神的典范。她始终怀抱着为人类更大福祉作出实质性贡献的梦想。无论科学探索与人生道路多么艰辛，她善良的本性始终未曾动摇。她将永远是我们心中不可替代的宝贵存在。

Julia M. Post 的研究由约翰内斯·古腾堡-美因茨大学医学中心转化神经科学重点研究项目（FTN）资助，目前由SPP-2225 EXIT项目资助至LB。Raissa Lerner 的研究部分由德国心血管研究中心（DZHK）项目81X2600250资助至LB以及脂质组学核心设施资助。本研究的部分经费由约翰内斯·古腾堡-美因茨大学医学中心生理化学研究所脂质组学核心设施以及医学中心内部资金（资助至LB）提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12(S)-HETEBiomolCay10007248-25脂质标准品
12(S)-HETE-d8BiomolCay334570-25脂质标准品
1200系列液相系统Agilent仪器设备/LCMS
2100生物分析仪Agilent仪器设备/qPCR
5(S)-HETE-d8BiomolCay 334230脂质标准品
ABI 7300实时荧光定量PCR仪Applied Biosystems仪器设备/qPCR
乙腈LC-MS级Chroma Solv溶剂Honeywell9814920溶剂/LCMS
棕色Eppendorf管Eppendorf样品制备
Analyst 1.6.2软件AB SCIEX, Darmstadt软件
分析天平Mettler Toledo仪器设备/样品制备
花生四烯酸-d8质谱标准品BiomolCay-10007277脂质标准品
Bessmann组织研磨器Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)仪器设备/样品制备
BinoZeiss显微镜
裂解型Caspase 3抗体Cellsignaling9661S显微镜
Leica CM3050 S冷冻切片机Leica Biosystems仪器设备/样品制备
CTC HTC PAL自动进样器CTC Analytics AG仪器设备/LCMS
Dumont弯头镊子Dumoxel #7FST11271-30手术工具
Dumont超细尖头镊子#5SF（x2）FST11252-00手术工具
EDTA 1000 A RöhrchenKabe Labortechnik078001样品制备
EP-1 EconoPump泵BioRAD700BR07757仪器设备/样品制备
镜面抛光精细镊子FST11412-11手术工具
精细直头锐利虹膜剪FST14094-11手术工具
碳化钨直头精细剪刀FST14568-09手术工具
虹膜刮匙FST10094-13手术工具
红藻氨酸Abcamab120100抗癫痫药物
Lipid View软件AB SCIEX, Darmstadt软件
LPC 17:0Avanis Polaris855676P脂质标准品
LPC 18:0Avanis Polaris855775P脂质标准品
Luna 2.5µm C18(2)- HAST 100A液相色谱柱Phenomenex00D-4446-B0仪器设备/LCMS
放大照明灯Maul GmbH仪器设备/样品制备
甲醇LC-MS级Chroma Solv 99.9%Honeywell9814920溶剂/LCMS
Motic相机Motic显微镜
MTBEHoneywell34875-1L溶剂/LCMS
MultiQuant 3.0定量分析软件包AB SCIEX, Darmstadt软件
NanoDrop 2000c分光光度计Thermo Scientific仪器设备/qPCR
PA 16:0-18:1Avanis Polaris840857P脂质标准品
PA 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1404脂质标准品
棕榈酰乙醇胺BiomolCay90350-100脂质标准品
棕榈酰乙醇胺-d5BiomolCay9000573-5脂质标准品
PC 16:0-18:1Avanis Polaris850457P脂质标准品
PC 16:0-18:1Avanis Polaris850457P脂质标准品
PC 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1004脂质标准品
PE 16:0-18:1Avanis Polaris850757P脂质标准品
PE 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1104脂质标准品
PG 16:0-18:1Avanis Polaris840457P脂质标准品
PG 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1204脂质标准品
PI 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1504脂质标准品
Precellys 24Peqlab仪器设备/样品制备
Precellys陶瓷研磨珠üPeqlab91-pcs-ck14p样品制备
Precellys钢珠2.8 mmPeqlab91-PCS-MK28P样品制备
Precellys陶瓷研磨套件1.4 mmVWR91-PCS-CK14样品制备
前列腺素D2BiomolCay 12010脂质标准品
前列腺素D2-d4BiomolCay 312010脂质标准品
前列腺素E2BiomolCay10007211-1脂质标准品
前列腺素E2-d9BiomolCay10581-50脂质标准品
PS 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1304脂质标准品
Q Trap 5500三重四极杆线性离子阱质谱仪AB SCIEXAU111609004仪器设备/LCMS
实时荧光定量PCR系统Appliert Biosystem仪器设备/qPCR
消退素D1BiomolCay10012554-11脂质标准品
RNeasy Mini试剂盒 - 无RNA酶的DNase试剂组（50次）Qiagen79254样品制备
Security Guard预柱Phenomenex仪器设备/LCMS
Shandon盖板Thermo Fisher72110017显微镜
Shandon载玻片架及盖Thermo Fisher73310017显微镜
SM 18:0Avanis Polaris860586P脂质标准品
SM d18:1/12:0Avanis PolarisLM-2312脂质标准品
直头平滑标准镊子FST11016-17手术工具
ToughCut标准型手术剪FST14130-17手术工具
T3000 PCR仪Biometra仪器设备/qPCR
血栓素B2BiomolCay19030-5脂质标准品
血栓素B2-d4BiomolCay319030-25脂质标准品
Tissue Lyser II组织研磨仪Qiagen/ Retsch12120240804仪器设备/样品制备
Tissue TekSakura Finetek4583显微镜
甲苯胺蓝Roth0300.2显微镜
VapothermBarkey4004734仪器设备/样品制备
水LC-MS级Chroma Solv溶剂VWR9814920溶剂/LCMS

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
  2. Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L.

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