组合 miRNA 治疗调节细胞周期和血管生成的分析

A K M Nawshad Hossian; Chandra Mohan Reddy Muthumula; Md. Sanaullah Sajib; Paul  E. Tullar; April  M. Stelly; Karen  P. Briski; Constantinos  M. Mikelis; George Mattheolabakis

doi:10.3791/59460

方法文章

组合 miRNA 治疗调节细胞周期和血管生成的分析

DOI：

10.3791/59460

⸱

2019年3月30日

A K M Nawshad Hossian¹ , Chandra Mohan Reddy Muthumula¹ , Md. Sanaullah Sajib² , Paul E. Tullar³ , April M. Stelly¹ , Karen P. Briski¹ , Constantinos M. Mikelis² , George Mattheolabakis¹

¹School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, ²Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, ³Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

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摘要

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miRNA 疗法在调节癌症进展方面具有巨大的潜力。这里演示了用于鉴定组合 miRNA 治疗在停止细胞周期和血管生成方面的活性的分析方法。

摘要

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肺癌 (LC) 是全球癌症相关死亡的主要原因。与其他癌细胞类似, LC 细胞的一个基本特征是不受管制的增殖和细胞分裂。通过阻止细胞周期进展抑制增殖已被证明是一种有前途的癌症治疗方法, 包括 LC。

miRNA 疗法已成为重要的转录后基因调节剂, 并越来越多地被研究用于癌症治疗。在最近的工作中, 我们使用了两个 Mirna, Mir-143 和 Mir-506, 以调节细胞周期的进展。对 A549 非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞进行转染, 分析基因表达改变, 最后分析治疗后的凋亡活性。检测到环素依赖性激酶 (cdk) 的下行 (即 CDK1、CDK4 和 CDK6) 的下行调节, 并在 g试管和 g2m 相变时停止细胞周期。病理分析显示治疗具有潜在的抗血管生成活性, 这使得该方法具有多方面的活性。这里, 描述了用于识别 miRNA 活性有关细胞周期抑制, 诱导细胞凋亡, 以及通过抑制血管生成治疗对内皮细胞的影响的方法。希望这里介绍的方法将支持未来对 miRNA 疗法和相应活性的研究, 并希望有代表性的数据将指导其他研究人员进行实验分析。

引言

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细胞周期是多个调控事件的组合, 允许 DNA 复制和细胞通过有丝分裂过程¹增殖。环素依赖性激酶 (Cdk) 调节和促进细胞^{周期 2}。其中有丝分裂 CDK (CDK1) 和间期 Cdk (CDK2、CDK4 和 CDK6) 在细胞周期进展³中起着举足轻重的作用。视网膜母细胞瘤蛋白 (Rb) 由 cdkk! cdk6 复合物磷酸化, 以允许细胞周期进展⁴, CDK1 激活是成功的细胞分裂5的关键。在过去几十年里, 在临床试验中开发并评估了许多 CDK 抑制剂, 这表明在癌症治疗中有可能以 Cdk 为目标。事实上, 最近已经批准了三种 cdk 抑制剂来治疗乳腺癌^6、⁷^、⁸^、⁹^、^10.因此, Cdk, 特别是 CDK1 和 CDK--在调节癌细胞进展方面非常感兴趣。

Mirna (miRs) 是小型、非编码的 Rna 和转录后....

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方案

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1. Mir-143 和 Mir-506 转染

注意: 在进行上述实验时, 请使用乳胶手套、防护眼镜和实验室外套。必要时, 请使用带机柜风扇的生物安全柜, 不要堵塞气道或干扰层流。如制造商所述, 始终将保护玻璃窗设置为适当的高度。

种子 NSCLC A549 细胞在 t25 厘米²flask 96 井板在 dmm/f12k 介质中补充10% 的 fbs 和1% 的青霉素链霉素 (培养培养基) 在组织培养罩中, 在37°c 孵育, 在组织培养孵化器中培养5% 的 co2 。
将 mir-143 和 mir-506 模拟物悬浮在500μl 转染培养基和 1.5 ml 血清和不含抗生素的 Demf12k 培养基中, 或与转染剂 (2.4 微克的 miR 与14Μl 的转染剂混合; 见材料表) 中悬浮使用 Sir-143 和抗生素的 demf12k 培养基 (2.4 微克的 mir);最终 miRNA 浓度为 100 nM。miRNA 的数量可能需要对不同的细胞和浓度进行优化。适当的方法包括 Mrna 浓度增加的细胞转染 (即 50-200 nM) 和评估感兴趣的基因的表达下调。
从飞板中取出培养基, 用 1x PBS 清洗一次。
加入 mirnabusle 转染剂复合物, 在37°c 孵育, 5% co 2 6小时 (烧瓶大....

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结果

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RT-qPCR 和凝胶电泳基因表达分析

利用 RT-qPCR 进行的差异基因表达分析显示, 靶向基因 CDK1、CDK4 和 CDK6 有显著下调。CDK1 和 cdkk 6 分别有助于 g2m 和 GN.S 的过渡。所进行的分析可以直接比较单个 miRs 和组合 MiRs 活动。利用对检测到的基因下调过程中的任何干扰进行检测, 使其与转染剂的制备, 是最小的。使用双尾学生的t测试对数据进行统计分析,p < 0.05 被认为具有统计意义 (图 1)。在 qPCR 之前, 使用引物-blast < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/> 用于单基因扩增, 对引物序列进行了评估。通过凝胶电泳分析扩增产物也证实了这一点。每个分析的基因检测到单波段 DNA .......

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讨论

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Mirna 可以作为癌症治疗的靶向疗法, 认识到患病组织与正常组织表达水平的失调。这项研究旨在确定在多个阶段可能阻止细胞周期进展的 Mirna。经证实, Mir-143 和 Mir-506 停止了癌细胞的细胞周期, 并提出了旨在了解这种组合 miRNA 治疗的活性的协议。

所述方法为 Mirna 的功能提供了全面的理解。研究 Mirna 的挑战与它们针对多个基因的能力有关, 因此影响多个途径。所描述的 qPCR 分析可以识别感兴趣的特定基因的表达, 如果在治疗前确定了特定的目标。例如, 这里的主要重点是 CDK1 和 cdk 的表达以及细胞周期。

因此, 使用碘化丙基和流式细胞仪协议进行细胞周期分析是根据细胞周期中细胞群的阶段来检测细胞群变化的可靠方法。该方法依赖于与 DNA 结合的 pi 对荧光信号的比例增加, 与细胞周期的阶段相对应。简单地说, S 相的细胞合成 DNA, 诱导比 g？ g1 相的细胞更高的信号, G2 相的细胞复制了它们的 DNA, 产生了最强烈的信号。

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披露

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作者希望感谢路易斯安那州立大学的约翰·卡斯基在 RNA 测序数据的路径分析方面提供的协助, 并感谢德克萨斯大学西南医学中心麦克德莫特中心下一代测序核心。执行 RNA 测序和数据分析。这项研究得到了路易斯安那州梦露大学药学院启动资金的支持, 以及国家卫生研究院 (NIH) 通过国家普通医学科学研究所的赠款 5 P20 GM103424-15、3 P20 GM103424-15S1 提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号
-80 华氏度C 速冻仪	VWR	VWR40086A
96 孔板	CELLTREAT Scientific	50-607-511
96 孔微孔板	Thermo Scientific	12-556-008
A549非小细胞肺癌细胞	ATCC	ATCC CCL-185
琼脂糖	VWR	0710-25G
Agilent 2100 生物分析仪	Agilent Technologies	G2938c
Ambion Silencer 阴性对照 1 号 siRNA	Ambion	AM4611
抗生素-抗真菌溶液（100x）	Gibco	15240-062
抗体阵列检测试剂盒，2 次反应	Full Moon Bio	KAS02
明场显微镜	显微镜	IV-900
明场显微镜	新的Star Environment LLC
细胞周期抗体阵列，2张幻灯片	Full Moon Bio	ACC058
Cell Logic+ 生物安全小屋	Labconco	342391100
Cellquest Pro	BD生物科学	步骤5.14;6.13：用于根据细胞周期阶段计算群体分布，以及用于计算群体分布以进行分析细胞凋亡
CFX96 实时系统	BioRad	CFX96 光学模块
Chemidoc 触摸成像系统	BioRad	Chemidoc 触摸成像系统
CO2 培养箱	Thermo Scientific	HERAcell 150i
Cultrex 低生长因子基底膜基质	Trevigen	3433-010-01
数码相机	AmScope	FMA050
DMEM 4.5 g/L 葡萄糖，不含丙酮酸钠，含 L-谷氨酰胺	VWR	VWRL0100-0500
DNAse I	Zymo Research	E1010
内皮细胞生长补充剂（ECGS）	BD Biosciences	356006
Eppendorf 移液器 Pick-A-Pack 套装	Eppendrof	05-403-152
乙醇，绝对（200 标准），分子生物级，	Fisher BioReagents	BP2818500
溴化乙锭	Alfa acar	L07462
F-12K 营养混合物（Kaighn's Mod.）与 L-谷氨酰胺，康宁	康宁	45000-354
FACS Calibur 流式细胞仪	Becton Dickinson
胎牛血清 - 优质	Antlanta Biologicals	S11150
胎儿牛血清（FBS）	Fisher Scientific	10438026
Fisherbrand Basix 微量离心管，带标准卡口盖	Fisherbrand Basix	02-682-002
Forma 系列 II 水套 CO2 培养箱	Thermo Scientific
肝素溶液（5000 U/mL）	Hospira	NDC#63739-920-11
水平电泳系统	台式实验室系统	BT102
hsa-miR-143-3p miRNA 模拟物	ABM	MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA 模拟	物 ABM	MCH02824
人重组血管内皮生长因子（VEGF）	Thermo Scientific	PHC9394
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）	个体供体	IRB# A15-3891
HyClone 磷酸盐缓冲盐水（PBS）	Fisher Scientific	SH30256FS
Ingenuity 通路分析	Qiagen	结果：用于生物信息学通路分析
Invitrogen UltraPure DNase/RNase 无蒸馏水	Invitrogen	10-977-015
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11-668-027
加载染料 10X	ward's science+	470024-814
培养基 M199 （with Earle′s 盐、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠）	Sigma Aldrich	M4530
显微镜数码相机	AmScope	MU130
Modfit LT	Verity 软件	步骤 5.15：用于分析细胞周期种群分布
Life technologies 的 Nanodrop	Thermo Scientific	NanoDrop one C
Opti-MEM	Gibco	31985-070
青霉素-链霉素 10/10	Antlanta Biologicals	B21210
Power UPsybr green 预混液	Applied Biosystems	A25780
碘化丙啶	MP Biochemicals LLC	IC19545825
Proscanarray HT 微阵列扫描仪	Perkin elmer	ASCNPHRG。我们使用了 543 nm 的激发激光波长。
q PCR 光学胶粘剂盖	Applied Biosystems	4360954
Quick-RNA 试剂盒	Zymo Research	R1055
来自牛胰腺的核糖核酸酶 A	Sigma	R6513-50MG
ScanArray Express	PerkinElmer	步骤 7.33：微阵列分析软件
摇床	Thermo Scientific	2314
SimpliAmp 热循环仪	Applied Biosystems
SpectraTube 离心管 15ml	VWR	470224-998
SpectraTube 离心管 50ml	VWR	470225-004
TBS 缓冲液，20x 液体	VWR	10791-796
温控离心匹配剂	Thermo Scientific	ST16R
温控微量离心	Matchine Eppendrof	5415R
Thermo Scientific BioLite 细胞培养处理过的培养瓶	Thermo Scientific	12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白检测	Thermo Scientific	PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA 缓冲液	Thermo Scientific	PI89900
Thermo Scientific Thermo Fast 96 孔全裙边板	Thermo Scientific	AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA 合成试剂盒（100 次运行）	Thermo Scientific	AB1453B
超低范围 DNA 分子量标准	Invitrogen	10597012
VWR 标准实心门实验室冷藏箱	VWR

的替代软件机

参考文献

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Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
Malumbres, M., Barbacid, M.

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Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

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George Mattheolabakis

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