miRNA 治疗在调控癌症进展方面具有重要意义。本文展示了用于鉴定联合 miRNA 治疗在抑制细胞周期和血管生成中活性的分析方法。
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摘要
摘要
肺癌（LC）是全球癌症相关死亡的首要原因。与其他癌细胞类似，肺癌细胞的一个基本特征是不受调控的增殖和细胞分裂。通过阻滞细胞周期进程来抑制增殖，已被证明是包括肺癌在内的癌症治疗的一种有前景的策略。
miRNA 治疗剂已成为重要的转录后基因调控因子，并在癌症治疗研究中受到日益关注。在近期研究中，我们利用两种 miRNA（miR-143 和 miR-506）调控细胞周期进程。对 A549 非小细胞肺癌（NSCLC）细胞进行转染，分析基因表达变化，并最终评估治疗所诱导的凋亡活性。检测到周期蛋白依赖性激酶（CDKs）表达下调（即 CDK1、CDK4 和 CDK6），细胞周期停滞于 G1/S 和 G2/M 期转换阶段。通路分析表明该治疗可能具有抗血管生成活性，使该策略具备多方面的生物学效应。本文详细描述了用于鉴定 miRNA 在抑制细胞周期、诱导凋亡以及通过抑制血管生成影响内皮细胞方面活性的研究方法。希望本文所呈现的方法能够支持未来关于 miRNA 治疗剂及其生物学活性的研究，且所提供的代表性数据可为其他研究人员开展实验分析提供指导。
引言
细胞周期是一系列调控事件的组合，通过有丝分裂过程实现DNA复制和细胞增殖1。周期蛋白依赖性激酶（CDKs）可调控并促进细胞周期进程2。其中，有丝分裂期CDK（CDK1）和间期CDKs（CDK2、CDK4和CDK6）在细胞周期进展中发挥关键作用3。视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）被CDK4/CDK6复合物磷酸化，从而促进细胞周期进程4，而CDK1的活化对成功完成细胞分裂至关重要5。过去几十年中，多种CDK抑制剂已被开发并在临床试验中进行评估，显示出靶向CDK在癌症治疗中的潜力。事实上，最近已有三种CDK抑制剂被批准用于乳腺癌治疗6,7,8,9,10。因此，CDKs，特别是CDK1和CDK4/6，在调控癌细胞进展方面具有重要意义。
miRNA（miR）是一类小型非编码RNA，可在转录后水平调控基因表达，调控约30%的人类基因
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方案
1. miR-143 和 miR-506 转染
警告：进行所述实验时，须佩戴乳胶手套、防护眼镜并穿上实验服。必要时，应在生物安全柜内操作，且需开启柜内风扇，不得阻塞通风口或扰乱层流气流。应始终按照制造商说明，将防护玻璃窗调节至适当高度。
- 在生物安全柜中，将 NSCLC A549 细胞接种于 T25 cm2 培养瓶/6 孔板/96 孔板中，使用添加了 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM/F12K 培养基（完全培养基），于 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中过夜培养。
- 将 miR-143 和/或 miR-506 模拟物，或阴性对照 siRNA 与转染试剂（2.4 µg miR 与 14 µL 转染试剂混合；参见材料表）在 500 µL 转染培养基和 1.5 mL 无血清无抗生素的 DMEM/F12K 培养基中悬浮，最终 miRNA 浓度为 100 nM。不同细胞系可能需要对 miRNA 用量和浓度进行优化。建议方法包括使用递增浓度的 miRNA（例如 50–200 nM）转染细胞，并检测目的基因的表达下调情况。
- 从培养瓶/板中移除完全培养基，并用 1× PBS 洗涤一次。
- 加入 miRNA/阴性对照-转染试剂复合物，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 6 小时（孵育体积....
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结果
使用RT-qPCR和凝胶电泳进行基因表达分析
使用RT-qPCR进行差异基因表达分析，结果显示靶基因CDK1、CDK4和CDK6显著下调。CDK1和CDK4/6分别在G2/M期和G1/S期转换过程中发挥关键作用。本研究的分析方法实现了单个miR与联合miR作用效果的直接比较。采用乱序siRNA与转染试剂共同处理，以评估转染操作本身对基因下调检测结果可能产生的干扰，结果表明干扰极小。数据采用双尾t检验进行统计学分析。 t-测试，以及p < 0.05 被认为具有统计学意义（图1）。在进行 qPCR 之前，使用 Primer-BLAST 对引物序列进行评估 用于单基因扩增。通过凝胶电泳分析扩增产物也证实了这一点。.......
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讨论
miRNA 可作为癌症治疗的靶向疗法，其依据是疾病组织与正常组织之间表达水平的失调。本研究旨在确定可能在多个阶段抑制细胞周期进程的 miRNA。研究发现，miR-143 和 miR-506 能够阻滞癌细胞的细胞周期，本文所述实验方案旨在阐明这种联合 miRNA 治疗的作用机制。
所述方法可全面了解miRNA的功能。研究miRNA的挑战在于其能够靶向多个基因，从而影响多条信号通路。如果在处理前已确定特定靶点，则可通过所述qPCR分析鉴定特定目的基因的表达情况。例如，本研究的重点是CDK1和CDK4/6的表达及其对细胞周期的影响。
因此，使用碘化丙啶（propidium iodide）和流式细胞术进行细胞周期分析是一种可靠的方法，可根据细胞在细胞周期中的不同阶段检测细胞群体的变化。该方法基于碘化丙啶（PI）与DNA结合后产生的荧光信号强度与其DNA含量成正比，从而反映细胞所处的周期阶段。简言之，处于S期的细胞正在合成DNA，其荧光信号强于G0/G1期的细胞；而处于G2期的细胞已完成DNA复制，因此产生最强的荧光信号。
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披露
作者感谢路易斯安那州立大学的 John Caskey 在 RNA 测序数据通路分析方面的协助，以及德克萨斯大学西南医学中心 McDermott 中心下一代测序核心实验室在 RNA 测序和数据分析方面的工作。本研究得到了路易斯安那大学门罗分校药学院启动资金以及美国国立卫生研究院（NIH）下属国家普通医学科学研究所基金 5 P20 GM103424-15 和 3 P20 GM103424-15S1 的资助。
致谢
未声明任何利益冲突。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| -80 °C 冰箱 | VWR | VWR40086A | |
| 96 孔板 | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96 孔微量培养板 | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 非小细胞肺癌细胞 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| 琼脂糖 | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 生物分析仪 | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer 阴性对照 No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| 抗生素-抗真菌素溶液（100 倍） | Gibco | 15240-062 | |
| 抗体芯片检测试剂盒，2 次反应 | Full Moon Bio | KAS02 | |
| 明场显微镜 | Microscoptics | IV-900 | |
| 明场显微镜 | New Star Environment LLC | ||
| 细胞周期抗体芯片，2 张芯片 | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ 生物安全柜 | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | 步骤 5.14；6.13：用于根据细胞周期 阶段计算细胞群体分布，以及 计算细胞凋亡分析中的群体分布 | |
| CFX96 实时系统 | BioRad | CFX96 光学模块 | |
| Chemidoc Touch 成像系统 | BioRad | Chemidoc Touch 成像系统 | |
| CO2 培养箱 | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex 低生长因子基底膜基质 | Trevigen | 3433-010-01 | |
| 数码相机 | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L 葡萄糖，不含丙酮酸钠，含 L-谷氨酰胺 | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNase I | Zymo Research | E1010 | |
| 内皮细胞生长补充剂（ECGS） | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf 移液器 Pick-A-Pack 套装 | Eppendrof | 05-403-152 | |
| 乙醇，绝对（200 证明），分子生物学级 | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| 溴化乙锭 | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K 营养混合物（Kaighn 改良型），含 L-谷氨酰胺，Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur 流式细胞仪 | Becton Dickinson | ||
| 胎牛血清 - 优质 | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| 胎牛血清（FBS） | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix 微量离心管，带标准 snap caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II 水套式 CO2 培养箱 | Thermo Scientific | ||
| 肝素溶液（5000 U/mL） | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| 水平电泳系统 | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA 模拟物 | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA 模拟物 | ABM | MCH02824 | |
| 人重组血管内皮生长因子（VEGF） | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| 人脐静脉内皮细胞（HUVEC） | 个体供体 | IRB# A15-3891 | |
| HyClone 磷酸盐缓冲盐水（PBS） | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity 通路分析 | Qiagen | 结果：用于生物信息学通路分析 | |
| Invitrogen UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水 | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| 上样染料 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199（含 Earle′s 盐、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠） | Sigma Aldrich | M4530 | |
| 显微镜数码相机 | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | 步骤 5.15：用于分析细胞周期群体分布的替代软件 | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| 青霉素-链霉素 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green 主混合液 | Applied Biosystems | A25780 | |
| 碘化丙啶 | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT 微阵列扫描仪 | Perkin elmer | ASCNPHRG。我们使用 543 nm 激光激发波长。 | |
| q PCR 光学粘性封膜 | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA 试剂盒 | Zymo Research | R1055 | |
| 牛胰核糖核酸酶 A | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | 步骤 7.33：微阵列分析软件 | |
| 摇床 | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp 热循环仪 | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube 离心管 15 ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube 离心管 50 ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS 缓冲液，20x 液体 | VWR | 10791-796 | |
| 温度控制 离心机 | Thermo Scientific | ST16R | |
| 温度控制微量离心机 | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite 细胞培养处理烧瓶 | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒 | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA 缓冲液 | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96 孔全裙边板 | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA 合成试剂盒（100 次反应） | Thermo Scientific | AB1453B | |
| 超低范围 DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR 标准实心门实验室冰箱 | VWR |
参考文献
- Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
- Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Malumbres, M., Barbacid, M.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. An author name was updated.
One of the authors' names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis
