利用三维类器官培养技术观察唾液腺的形态和功能标志物，可能为揭示辐射后组织损伤的机制提供新的见解。本文介绍了一种实验方案，用于在暴露于电离辐射前后，对50–90 μm厚的唾液腺组织切片进行切片、培养、辐照、染色和成像。
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摘要
摘要
唾液分泌减少和口干症会导致头颈部癌症患者在接受放射治疗后出现慢性口腔并发症，降低其生活质量。目前针对唾液腺功能障碍机制及功能恢复的研究主要依赖于体内模型，但这些模型难以系统性地筛选治疗候选物，且在转染效率方面存在局限，无法有效调控特定基因。本唾液腺类器官培养方案的目的是评估组织体外培养的最长可行时间，并表征离体辐射处理后细胞发生的变化。我们采用免疫荧光染色和共聚焦显微镜技术，确定在30天培养期间特定细胞群体及标志物的存在时间。此外，还评估了既往在体内辐射模型中报道的细胞标志物在离体辐射处理后的培养组织中的表达情况。该方法为进一步快速评估改善唾液腺功能的治疗药物对小鼠及人类唾液腺组织的离体反应提供了一个有吸引力的实验平台。
引言
唾液腺功能正常对口腔健康至关重要，而在头颈部肿瘤接受放射治疗后，唾液腺功能会发生改变1。2017年，美国报告了近5万例头颈部癌症新发病例2。由于放射治疗对唾液腺等周围正常组织具有损伤性，且其影响常常不可逆，患者常伴有严重副作用，并导致生活质量下降2,3,4。放射损伤引起的常见并发症表现为口干症（主观感觉口腔干燥）、龋齿、咀嚼和吞咽能力受损、言语障碍以及口腔微生物组失衡2,3,4。这些症状综合可导致患者营养不良及生存能力下降5。尽管该人群中唾液腺功能障碍已有充分记录，但腺泡细胞损伤的潜在机制仍存在争议，且不同动物模型之间的研究结果缺乏整合6,7。
目前研究唾液腺功能及辐射诱导损伤的方法包括使用体内模型、永生化细胞系、二维（2-D）原代细胞培养以及三维（3-D）唾液腺球体培养8,9,10,11,12。传统上，来自永生化细胞系和二维培养的细胞模型是在平坦表面培养的单层细胞，具有快速、简便且成本低廉的优点，适用于高通量实验。然而，人工细胞培养条件可能改变细胞在不同刺激下的分化状态和生理反应，其研究结果往往难以在整体生物模型中重现14,15。此外，永生化细胞培养需要调控p53活性，而p53在唾液腺对DNA损伤的响应中起关键作用16,17。
在培养早期，三维唾液腺球体培养物富含干细胞和前体细胞，有助于理解这类唾液腺细胞亚群的放射敏感性9,18。所有这些培养模型的一个关键局限性在于，它们无法有效观察唾液腺的三维结构，包括细胞外基质（ECM）以及多层结构中的细胞间相互作用，而这些结构对于调控唾液分泌至关重要15。因此，迫切需要一种既能反映组织整体行为，又可在实验室条件下进行干预以研究治疗效应的方法，从而进一步揭示辐射诱导唾液腺功能障碍的潜在机制。
活体组织切片与培养此前已有文献记载19,20 并常用于研究脑组织相互作用21在之前的研究中，小鼠腮腺（PAR）唾液腺组织被切片至约 50 µm 厚度，并培养长达 48 小时，随后进行活力、细胞死亡及功能分析19. Su 等. (2016) 年在此方法基础上进行了拓展，将人下颌下腺（SMGs）切成 35 µm 或 50 µm 的切片后培养 14 天20该方法的改进之处在于，它同时包含了以50 µm和90 µm厚度切取的腮腺和下颌下腺唾液腺组织切片，并对培养物进行了为期30天的评估。能够制备不同厚度的组织切片，对于研究与细胞过程（如顶-基底极性及支配分泌功能的神经支配）相关的细胞间以及细胞与细胞外基质（ECM）间的相互作用具有重要意义。此外，唾液腺组织切片在体外培养期间接受了照射，以评估该培养模型用于研究辐射所致唾液腺损伤的可行性。
本唾液腺类器官培养方案的目的是评估组织切片在离体辐射处理后的最长培养存活时间，并表征细胞的变化。为确定解剖后组织切片的最大存活时间，进行了台盼蓝染色、活细胞染色以及针对细胞死亡的免疫组织化学染色。采用共聚焦显微镜和免疫荧光染色技术，评估特定细胞群体、形态结构及增殖水平。此外，将组织切片培养物暴露于电离辐射，以研究辐射对该三维模型中多种标志物的影响。将离体辐射培养物中细胞死亡的诱导、细胞骨架破坏、分化标志物的丢失以及代偿性增殖现象，与既往体内模型的研究结果进行比较。该方法为研究辐射损伤后细胞间相互作用的作用提供了途径，同时也提供了一种实验模型，可高效评估治疗干预措施（如基因操作或药理学试剂）的效果，而这些干预措施可能较不适合用于体内模型。
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方案
1. 振动切片机的准备
- 使用70%乙醇喷洒振动切片机的可拆卸部件，包括缓冲托盘、刀片固定装置、琼脂糖块模具和实验室用膜，然后进行至少30分钟的紫外灭菌。
- 在缓冲托盘上方再覆盖一张实验室用膜并固定，以防止冰屑落入。
- 将碎冰填入冰室，移除缓冲托盘上的实验室用膜，并向缓冲托盘中加入100 mL冰冷的含1%青霉素-链霉素-氨苄青霉素（PSA）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。
- 将不锈钢剃须刀片放入刀片夹持器中。使用螺丝刀拧紧或松开，并调节刀片的角度。
2. 使用琼脂糖包埋组织样本并用振动切片机进行切片
- 将所有必要的解剖和切片工具（包括镊子、剪刀和毛笔）进行高压灭菌处理。
- 在无菌的1×PBS中配制3%低熔点琼脂糖，放入微波炉加热至琼脂糖完全溶解。注意避免溶液沸腾溢出，并定期旋转瓶子以混匀。
注意：将低熔点琼脂糖置于温水浴中以防止其凝固。该琼脂糖在37 °C时呈液态，在25 °C时凝固。然而，水浴温度应低于40 °C，以便在生理温度下将琼脂糖浇注于组织周围。 - 分离唾液腺，并将解剖所得组织置于含有1% PSA的2 mL冰浴1×PBS中，放入无菌的30 mm培养皿内。
- 使用已灭菌的镊子将唾液腺从含1% PSA的1×PBS溶液中取出，放置于包埋模具底部，然后加入液态3%低熔点琼脂糖，完全覆盖组织。
- 用镊子调整组织至琼脂糖块中央，并将唾液腺置于合适的切面方向。下颌下腺和腮腺的最佳横截面为垂直平面。
- 将琼脂糖块置于冰上10分钟，使其凝固硬化。
- 用剃须刀片沿琼脂糖块外缘小心划一圈，松动后使琼脂糖块滑落至第1.1步中的紫外灭菌实验室膜上。
- 使用剃须刀片切割出包含唾液腺的琼脂糖方块。确保切面平整且与块体对侧（即用于粘附的底面）平行。由于琼脂糖不会渗入组织内部，因此组织周围的琼脂糖不宜修剪过多，以保证组织得到充分支撑。
- 使用速干胶将琼脂糖块固定于切片台上。
- 使用振动切片机以0.075 mm/s的速度和100 Hz的频率进行切片，厚度为50 µm或90 µm。
注意：将振动切片机设置为最高频率和最低刀速可获得最佳切片效果。 - 使用已灭菌的天然毛发毛笔，将切片收集至24孔细胞培养板中，每孔含约1 mL冰浴PBS；每次收集切片之间，将毛笔浸入70%乙醇中以维持无菌状态。
3. 切片培养
- 将微型刮铲和镊子进行高压灭菌。
- 配制含或不含胎牛血清（FBS）的振动切片机培养基：在DMEM/F12培养基中添加1% PSA、5 µg/mL 转铁蛋白、1.1 µM 氢化可的松、0.1 µM 视黄酸、5 µg/mL 胰岛素、80 ng/mL 表皮生长因子、5 mM L-谷氨酰胺、50 µg/mL 硫酸庆大霉素以及10 µL/mL 微量元素混合物。加入适量FBS，配制成0%、2.5%、5.0%或10%的溶液。
- 切片前，在24孔细胞培养板的每孔中加入300 μL预热的培养基，并放入直径12 mm、孔径0.4 µm的膜插件。培养基应上升至膜底部，以形成液-气界面培养环境。
- 用微型刮铲将唾液腺组织切片轻轻放置于膜插件表面，在37 °C、含5% CO2和95%空气的加湿培养箱中进行培养。
- 每隔一天或根据需要，在每孔中加入约300 μL初级培养基，并在膜插件内滴加数滴（约40 μL）。适当的培养条件下，细胞可在体外存活并维持长达30天。
4. 唾液腺切片的照射
- 使用钴-60（或等效）辐照仪对组织切片进行单次辐射处理（5 Gy）。
- 使用带盖的泡沫塑料容器将切片运送至辐照设施，以避免温度波动。此外，在将切片运回实验室培养箱的过程中需格外小心，防止培养基溅到培养皿盖上而引起污染。
- 将含有唾液腺组织切片的24孔板置于距离辐射源80 cm处，并位于32英寸×32英寸辐射野的中心。辐射剂量的计算及相应的辐照时间会因仪器型号和钴-60衰变情况而异。
- 按照第3节所述方法继续对这些组织切片进行监测和培养。
5. 活性染色
- 吸去旧培养基，用无菌预热的 1× PBS 洗涤切片两次。
- 用台盼蓝染料对切片进行染色。
- 使用微型刮铲将切片从培养环境中转移至载玻片上。
- 向振动切片机切片中加入 0.4% 台盼蓝溶液，用量足以覆盖组织（10–20 µL）。
- 室温（RT）孵育 1–2 分钟，使染料渗入组织。死细胞将被染成蓝色，而活细胞不着色。
- 用钙黄绿素 AM 活细胞染料对切片进行染色。
- 向 24 孔板中的一个孔内加入足量染色液以覆盖切片（200–300 µL）。
- 室温孵育 15 分钟，使染料充分渗透。
- 小心将切片从孔中取出并置于载玻片上，加入一滴封片剂封片。
- 在荧光显微镜下以 488 nm 激发波长和 515 nm 发射波长对切片进行成像。
6. 抗体染色振动切片
注意：以下提供的是针对 Ki-67 的通用抗体染色方案；然而，该方案可适用于任何抗体。除非另有说明，所有洗涤步骤均在室温下进行。
- 在多孔组织培养皿中，吸除培养基，并用无菌的1×PBS至少洗涤2次。
- 使用4%多聚甲醛（PFA）在4 °C下过夜固定组织切片。
- 吸除4% PFA，用PBT [1×PBS、1%牛血清白蛋白（BSA）、0.1% Triton X-100]洗涤3次。
注意：组织切片可在4 °C下保存于1×PBS中，后续再进行染色。本文献中测试的最长保存时间为3周。如需更长时间保存，用户需自行优化条件。 - 使用含0.3% Triton X-100的1×PBS对组织切片进行通透处理，持续30分钟。
注意：此步骤可根据特定抗体染色需求和通透要求进行调整和优化。 - 用移液器吸除通透液。
- 用1×PBS、1% BSA和0.1% Triton X-100（PBT）洗涤切片3次，每次5分钟。
- 用含1%正常山羊血清的封闭剂对切片进行封闭，处理1小时。
- 用PBT洗涤切片3次，每次5分钟。
- 在4 °C下，将切片与500 µL抗Ki67兔单克隆抗体在含1% BSA的1×PBS中稀释后孵育过夜。
注意：如进行鬼笔环肽（phalloidin）染色，请跳过步骤6.9，并按照所用鬼笔环肽试剂的具体方案进行操作。如进行DNA复染，请直接跳至步骤6.15。 - 吸除抗Ki67兔单克隆抗体。
- 用1×PBS洗涤切片6次，每次5分钟。
- 在室温避光条件下，将切片与500 µL荧光标记的二抗（与抗Ki67抗体相容）在含1% BSA的1×PBS中稀释后孵育1.5小时。
注意：根据所用二抗的不同，用户可进一步优化二抗孵育时间。此外，二抗对光敏感，后续所有洗涤步骤均需在避光条件下进行。 - 吸除二抗溶液。
- 用1×PBS洗涤切片3次，每次5分钟。
- 用去离子水洗涤切片5分钟。
- 在室温下，用DAPI（1 µg/mL）对切片进行复染，持续20分钟。
- 用去离子水洗涤切片一次，持续5分钟。
- 每张切片滴加一滴（约40 µL）封片剂进行封片。为避免产生过多气泡，应将盖玻片以45°角缓慢放置于载玻片的封片剂上。
- 为防止厚切片被盖玻片压碎，可在每张切片周围使用间隔垫。可通过在组织切片周围涂抹一圈真空脂形成方形边框作为间隔垫。
- 放置盖玻片时，可用真空脂密封其边缘，并用拇指轻压盖玻片边缘，使其牢固粘附于载玻片上。或者，也可使用透明指甲油将盖玻片密封固定在显微载玻片上。
7. 成像振动切片
- 染色后5天内对染色切片进行成像。
- 使用共聚焦显微镜获取染色后振动切片机切片的光学切片。通过共聚焦显微镜，可根据用户的实验设计，以设定的步长采集z轴层扫图像（z-stack），或采集单张图像。共聚焦图像采集后，可在任意计算机屏幕上进行观察。
注意：由于振动切片机切片较厚，建议使用共聚焦显微镜或具备z轴层扫功能的显微镜以观察样品内部的细节。本研究中所用图像采用63倍油镜获取；然而，具体参数可根据使用者及其所用显微镜的具体情况进行调整和优化。推荐的像素分辨率基于奈奎斯特采样定理（在X和Y方向上，对最小光学可分辨结构采用2.5个像素），并结合各物镜和缩放倍数进行设定。然而，部分研究者建议使用2.3个像素，也有建议使用2.8个像素。有关此类计算的更多细节，请参阅《生物共聚焦显微镜手册》22。
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结果
原代二维培养在添加胎牛血清（FBS）的培养基中进行，而原代三维唾液腺球培养通常在无血清条件下进行10,11。此外，先前两项利用唾液腺振动切片进行培养的研究分别在含0%或10% FBS的培养基中培养组织切片19,20。小鼠下颌下腺组织切片使用振动切片机切成50 µm厚度，并通过一系列不同FBS浓度（0%、2.5%、5.0%和10%）确定最佳培养条件。为评估细胞存活特性，在切片后第1、4、7、14和30天进行明场显微镜成像（图1）。此外，在指定时间点，使用0.4%台盼蓝染料对腺体切片染色，并在40倍明场显微镜下成像（图2A）。死亡细胞被染成蓝色，而活细胞保持无色。
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讨论
唾液腺研究已采用多种培养模型，包括永生化二维培养、原代二维培养、三维唾液球培养以及来自胚胎外植体的三维器官培养，以探究其基本生物学和生理学问题。这些培养模型已在多种研究问题中提供了深入的见解，并将继续在唾液腺研究中发挥重要作用。然而，这些培养模型也存在局限性，包括永生化过程中p53活性的改变、原代培养存活时间短暂、培养过程中分化特征和分泌蛋白的丢失，以及无法评估成体组织中的细胞间、细胞与细胞外基质（ECM）以及极性相互作用。首个用于唾液腺的三维类器官切片培养方法（振动切片机切片培养）于2008年发表18；尽管该技术在其他领域被广泛使用，但在唾液腺研究中却长期未被充分应用。此前的研究仅将腮腺切片培养48小时，限制了对辐射处理后慢性效应的观察，也无法在特定基因操作后应用转染或转导方案研究表型变化。本文所述方法已优化，可实现更长的培养时间，通过共聚焦显微镜获得高分辨率图像，提供在三维切片上研究细胞内和细胞间动态过程的方法，并可在至少14天的培养期内评估辐射诱导的变化。
尽管该技术的每一步骤在实施过程中都是必需的，但其中某些步骤对于成功切片和...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了亚利桑那大学研究与发现办公室以及美国国立卫生研究院（R01 DE023534）向 Kirsten Limesand 提供的试点资金支持。癌症生物学培训项目（T32CA009213）为 Wen Yu Wong 提供了助学金支持。作者谨此感谢 M. Rice 在技术方面作出的宝贵贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | 用于切片的振动切片机 |
| 双刃不锈钢剃须刀片 | 电子显微镜科学公司 | 72000 | |
| 琼脂糖 | Fisher Scientific | BP165-25 | 低熔点 |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| 青霉素-链霉素-两性霉素B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24孔板 | CellTreat | 229124 | |
| 杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（DPBS） | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite 超级凝胶控制胶水 | Loctite | N/A | 五金店购买 |
| 天然红貂圆头画笔 | 普林斯顿艺术 & Brush Co | 7400R-2 | |
| 硫酸庆大霉素 | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| 转铁蛋白 | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030-081 | |
| 微量元素 | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| 胰岛素 | Fisher Scientific | 12585014 | |
| 表皮生长因子 | 康宁 | 354001 | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| 视黄酸 | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| 胎牛血清 | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 培养基 | 康宁 | 150-90-CV | |
| Millipore细胞培养小室 | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 毫米，0.4 微米孔径，适用于 24 孔板 |
| 0.4% 台盼蓝 | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD 细胞成像试剂盒（488/570） | Thermo-Fisher | R37601 | 仅使用 LIVE 染料组分 |
| 抗Ki-67抗体 | 细胞信号技术公司 | 9129S | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | 细胞信号技术公司 | 3195S | |
| 抗裂解型 Caspase-3 抗体 | 细胞信号技术公司 | 9661L | |
| 抗平滑肌肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| 抗淀粉酶抗体 | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| 抗CD31抗体 | Abcam | ab28364 | |
| 抗TUBB3抗体 | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 抗体标记试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| 牛血清白蛋白 | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| 多聚甲醛小球 | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear 封闭剂 | Perkin Elmer | 2346249 | 不再销售 |
| DAPI | 细胞信号技术公司 | 4083S | |
| Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII 光谱共聚焦显微镜 | Leica Biosystems | N/A | 用于共聚焦成像 |
| 徕卡 DMIL 倒置相差显微镜 | Leica Biosystems | N/A | |
| 钴-60 远距离治疗仪 | 加拿大原子能有限公司 Theratron-80 | N/A | |
| 透明 Amac 盒 | 容器商店 | 60140 | 琼脂糖凝胶制备模具 |
参考文献
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