需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

通过向小鼠乳腺导管内注射表达Cre的腺病毒建立乳腺癌模型

12.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59502

⸱

2019年6月7日

 ,  , 
1Division of Genetics, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Harvard Medical School

本文内容

摘要

本实验方案旨在介绍一种基于将表达Cre的腺病毒通过导管内注射至小鼠乳腺中来建立乳腺癌模型的新方法。该方法能够以时间可控的方式，在特定细胞类型和器官中特异性调控致癌事件。

摘要

乳腺癌是一种异质性疾病，可能源于不同起源细胞与致癌事件之间的复杂相互作用。小鼠模型对于深入理解这些复杂过程具有重要作用。尽管已有多种小鼠模型被开发用于研究不同致癌事件和起源细胞在乳腺肿瘤发生中的作用，但这些模型往往缺乏细胞类型或器官特异性，或无法以时间可控的方式诱导乳腺肿瘤的发生。本文介绍一种基于向小鼠乳腺导管内注射表达Cre的腺病毒（Ad-Cre）来构建新型乳腺癌小鼠模型的实验方案。由于Ad-Cre直接注射至乳腺导管内，该方法具有乳腺特异性，不会在其他器官中引发非预期的肿瘤。该导管内注射操作可在小鼠乳腺发育的不同阶段进行（因此可实现从约3-4周龄起对肿瘤诱导的时间控制）。通过在腺病毒载体中使用不同细胞类型特异性的启动子驱动Cre表达，可实现对特定细胞类型的靶向。我们证明，分别在角蛋白8（Keratin 8）或角蛋白5（Keratin 5）启动子控制下，通过导管内注射Ad-Cre，可高效且特异地靶向乳腺腔面细胞和基底细胞（MECs），实现基于Cre/loxP系统的遗传操作。通过引入条件性Cre报告基因（例如Cre/loxP诱导型Rosa26-YFP报告系统），我们证实经Ad-Cre靶向的MECs及其衍生的肿瘤细胞，可在导管内注射后通过追踪报告基因阳性细胞进行示踪。

引言

本方法的总体目标是建立一种基于将Ad-Cre注射至小鼠乳腺导管（MG）内来模拟乳腺癌的新方法。基于Cre/loxP重组系统的遗传学方法已被广泛用于在小鼠中模拟人类乳腺癌。第一代基于Cre/loxP的乳腺癌小鼠模型是通过使用在乳腺上皮细胞（MEC）特异性启动子控制下表达Cre的转基因小鼠构建的（例如，MMTV-Cre用于管腔型MEC及部分基底型MEC，Wap-Cre和Blg-Cre用于管腔祖细胞和腺泡管腔MEC，K14-Cre用于基底型MEC及部分管腔型MEC1,2,3,4,5)6,7,8,9）。然而，尽管这些Cre转基因品系能够实现Cre表达的空间控制（即在不同亚群的MEC中表达），但无法实现对Cre表达及Cre/loxP介导的遗传操作的时间控制。第二代基于Cre/loxP的乳腺癌小鼠模型则采用可诱导的Cre活性/表达策略（例如使用Cre-雌激素受体融合蛋白[CreER]，该蛋白仅在给予他莫昔芬后才能诱导Cre/loxP重组），因此这些遗传工具可在MEC中同时实现对致癌事件激活的空间和时间控制（例如基于K8-CreER和K5-CreER的模型）10,11,12。在这两代乳腺癌小鼠模型中，由于驱动Cre或CreER表达的启动子（如Krt8、Krt5）也可能在其他器官的上皮细胞中具有活性（即具有细胞类型特异性，但不具有器官特异性），或在非上皮细胞类型中出现渗漏性表达（例如MMTV在骨髓造血细胞中具有渗漏性活性），这些方法可能导致在其他器官中产生非预期的癌症。如果这些意外发生的癌症导致小鼠死亡，则会妨碍在这些小鼠中建立乳腺癌模型的原始目的（例如，由MMTV-Cre驱动的致癌事件可能因MMTV启动子在造血细胞中的渗漏性活性而导致造血系统恶性肿瘤及小鼠过早死亡）4。

本文报道了一种在小鼠中建立乳腺癌模型的方法，该方法能够以时间可控的方式实现对癌变事件的细胞类型特异性和器官特异性调控。该方法基于将 Ad-Cre 腺病毒颗粒注射至小鼠乳腺导管内（因此具有器官特异性）。通过在腺病毒载体中使用不同乳腺上皮细胞（MEC）亚群特异性的启动子，可实现对 Cre 表达的调控（例如，Krt8 启动子用于腔面型 MEC，Krt5 启动子用于基底型 MEC，从而实现细胞类型特异性）。通过在不同年龄阶段（从3-4周龄（青春期）至成年期）的小鼠中注射 Ad-Cre，可实现对乳腺肿瘤诱导的时间控制。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本文所述所有方法均已获得布莱根妇女医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 条件性基因敲除小鼠的制备与保种

  1. 从杰克逊实验室（The Jackson Laboratory，JAX）或美国国家癌症研究所人类癌症小鼠模型联盟（NCI Mouse Models of Human Cancer Consortium，MMHCC）资源库获取与乳腺癌相关的条件性敲除（floxed conditional knockout）小鼠品系（例如 Trp53tm1Brn [简称 Trp53L/L]、Brca1tm1Aash [Brca1L/L]），或条件性敲入小鼠品系（例如 Gt(ROSA)26Sortm1(Pik3ca*H1047R)Egan）。此外，为便于追踪经历 Cre 介导重组的乳腺上皮细胞（MECs），还可从 JAX 获取条件性 Cre 报告基因小鼠品系（例如 Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos [简称 R26Y]）。
  2. 将 Trp53L/L 纯合子小鼠与 R26Y 纯合子报告基因小鼠交配，或与携带 R26Y 报告基因等位基因及其他不同条件性敲除或敲入等位基因的纯合子小鼠交配，以获得杂合的 F1 代雄性和雌性子代。
  3. 将杂合的 F1 代雄性和雌性小鼠相互交配，以获得对各等位基因均为纯合的 F2 代复合雌性小鼠（作为实验组小鼠），以及仅携带 R26Y 的纯合雌性小鼠（作为对照组小鼠）。根据下表所列的 PCR 引物和扩增条件，使用两个标准的 20 µL PCR 反应体系（采用 Taq 5X Master Mix），在两个不同的 PCR 管中分别加入 R26Y 引物和 Trp53L 引物，对 F2 代小鼠进行基因型鉴定。所有繁育工作均使用成年小鼠（通常为 2–4 月龄）。
    1. 对于 R26Y，PCR 程序为：94 °C 预变性 3 min，随后进行 35 个循环（94 °C 变性 30 s，60 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 1 min），最后 72 °C 延伸 3 min，然后维持在 14 °C。使用以下引物：(i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT；(ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC；(iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG。
      注：出现一条 250 bp 的 PCR 条带表示 R26Y 纯合子，一条 500 bp 的条带表示野生型（WT），两条条带（R26Y：250 bp，WT：500 bp）表示 R26Y 杂合子（图 1A）。
      对于 Trp53L，PCR 程序为：94 °C 预变性 3 min，随后进行 35 个循环（94 °C 变性 30 s，60 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 1 min），最后 72 °C 延伸 3 min，然后维持在 14 °C。使用以下引物：(i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G；(ii) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC。
      注：出现一条 370 bp 的 PCR 条带表示 Trp53L/L 纯合子，一条 288 bp 的条带表示 Trp53+/+ 野生型，两条条带（WT：288 bp，Trp53L：370 bp）表示 Trp53L/+ 杂合子（图 1B）。

2. 术前准备

  1. 手术前一天对所有外科器械进行高压灭菌。
  2. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制0.1%溴酚蓝，并于4 °C保存。将用于导管内注射的Ad-Cre用含0.01 M CaCl2的DMEM培养基与溴酚蓝按1:10的比例稀释（即注射混合液）。
    注意：此处使用的Ad-Cre购自爱荷华大学病毒载体核心实验室，病毒原液滴度约为1010–1011 pfu/mL。
  3. 使用异氟烷麻醉舱对雌性小鼠（如步骤1.2所述的F2代，年龄范围为3–4周龄至成年）进行麻醉，并涂抹眼膏。在操作过程中，通过持续吸入含1%–2.5%异氟烷的氧气维持麻醉状态。至少每15分钟通过脚趾夹捏测试检查一次麻醉深度。密切监测小鼠呼吸频率的任何变化，并根据需要调整异氟烷浓度。
  4. 在手术前，以5 mg/kg的剂量皮下注射美洛昔康作为镇痛剂。
  5. 在乳头手术区域滴加数滴脱毛膏以暴露手术部位；使用软纸巾清除多余的脱毛膏和松散的毛发。
    注意：此步骤应在与手术区域分开的位置进行。不建议剃毛，以免损伤乳头。需谨慎及时清除化学脱毛剂，若停留时间过长可能导致皮肤化学灼伤。
  6. 首先用碘伏对手术部位进行消毒，随后使用70%酒精，最后再用碘伏擦洗剂进行终末消毒。使用纱布或棉签以从操作区域中心向外周画圆的方式进行。重复该过程3–4次。

3. 导管内注射

  1. 整个手术过程中均需采用无菌技术。
  2. 在第二对腹股沟乳腺之间沿皮肤做长约 ~1 cm 的切口（图 2）。小心将皮肤瓣（连同乳腺）从壁层腹膜分离，以暴露乳腺导管树。
  3. 用钟表匠镊子轻轻夹住乳头，使用显微解剖剪刀去除外部乳头，避免切割周围皮肤。
  4. 将约 3–5 µL 的 Ad-Cre 注射混合液吸入一支带有 33 G 金属接头针头的 25 µL Hamilton 注射器中。根据混合液中的蓝色染料估计注射器内的液体体积。
    注意：对 3–4 周龄雌性小鼠的乳腺进行注射时应使用较小体积（例如 3 µL），而对哺乳期雌性小鼠的乳腺注射时则使用较大体积（例如 10 µL）。
  5. 用精细弯镊轻轻夹住皮肤瓣边缘，缓慢将 Ad-Cre 注射混合液注入乳头，同时观察蓝色染料在乳腺导管树中的扩散情况。注射速度应尽可能缓慢，以避免损伤导管腔。
    注意：若可见注射液（通过其中的溴酚蓝染料显示）在整个导管树中均匀扩散，且未渗漏至间质区，则表明导管内注射成功。
  6. 缓慢将针头从乳头中退出，以防止注射液泄漏。
  7. 检查乳腺远端（即远离乳头的一侧）或注射乳头周围区域。若观察到蓝色染料肿胀扩散（即染料进入周围间质），提示注射进入了乳腺脂肪垫，而非成功的导管内注射。
  8. 使用伤口夹闭合皮肤上的手术切口（步骤 3.2 所致）。

4. 术后护理

  1. 将小鼠从麻醉状态中取出，置于清洁笼盒内的加热垫上进行恢复。
  2. 术后24小时后，再次皮下注射美洛昔康，剂量为5 mg/kg。
  3. 连续5天监测动物的一般状况，并观察手术切口部位是否有感染迹象。
  4. 术后约7至10天拆除伤口夹。

5. 监测乳腺肿瘤的发育

  1. 每周对注射后的小鼠进行两次触诊，观察是否有乳腺肿瘤形成的迹象。
  2. 一旦肿瘤可触及，需每日监测小鼠，并测量肿瘤大小 ，直至达到实验终点。实验终点由肿瘤大小（例如达到小鼠体重的10%–15%）、肿瘤状态（例如发生溃疡或坏死）或小鼠整体健康状况（例如昏迷、濒死）确定。
  3. 采用二氧化碳窒息法处死小鼠 ，并辅以第二种方法（如颈椎脱臼）确认死亡。
  4. 分离乳腺肿瘤组织，并通过流式细胞术、免疫荧光或表达谱分析（例如RNA测序 [RNAseq] 或微阵列）进行分析，具体方法如前所述12。
  5. 进行流式细胞术分析时，设门筛选谱系阴性细胞（Lin-：对谱系标记CD45 [白细胞标记]、CD31 [内皮细胞标记] 和 TER119 [红细胞标记] 呈阴性），并根据YFP、CD24和CD29的表达情况分析肿瘤中的细胞。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

代表性PCR基因分型结果 R26Y 和 Trp53L 等位基因显示在 图1.

尽管原则上所有10个乳腺（MG）均可进行导管内注射操作，但实际操作中通常选择两个第四腹股沟乳腺进行注射，因其更容易接近且乳腺体积较大（图2）。手术过程中，应保持工作区域无菌且整洁，并使用无菌器械进行操作（图3）。在导管内注射过程中，向注射混合物中加入蓝色染料（如溴酚蓝）有助于观察腺病毒-Cre（Ad-Cre）是否成功注入整个导管系统（图4）。可成功实施导管内注射（使用较小体积的注射混合物）的最年轻雌性小鼠约为3周龄（图4A）...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

该方法通过不同亚群的乳腺上皮细胞（MECs）诱导乳腺肿瘤的成功，不仅依赖于选择适当的细胞类型特异性启动子（以驱动Cre表达），还依赖于导管内注射操作本身。该策略的原理在于，注射的Ad-Cre病毒可保留在具有管腔结构的乳腺导管树中，从而仅使MECs暴露并感染Ad-Cre病毒。由于乳腺导管内管腔空间有限，每次向乳腺（MG）注射的体积必须控制在较小范围内（即约3–5 µL）。注射体积还应根据小鼠的年龄进行调整（例如，对3至4周龄小鼠注射时应使用更小的体积）。当注射液体积过大时，由于注射压力及导管管腔空间受限，液体可能溢出 "推出" 穿过上皮层进入基质，导致基质细胞发生不必要的病毒感染。

由于腺病毒载体中用于驱动 Cre 表达的启动子决定了细胞类型的特异性，因此该方法的一个局限性在于可能缺乏能够将 Cre 表达特异性靶向某一特定乳腺上皮细胞（MEC）亚群的合适启动子。我们此前曾报道使用广谱腔面细胞特异性 Ad-K8-Cre 病毒靶向腔面型 MECs12,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 CA222560和美国国防部突破奖W81XWH-18-1-0037支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
33号针头Hamilton7803-053型钝头
7 mm 反射夹Braintree ScientificRF7 CS
腺病毒 Ad-K5-Cre爱荷华大学病毒载体中心Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)
腺病毒 Ad-K8-Cre爱荷华大学病毒载体中心Ad5mK8-nlsCre
酒精FisherHC800-1GAL使用时配制成70%
生物素标记CD31eBiosciences13-0311-85
生物素标记CD45eBiosciences13-0451-85
生物素标记TER119eBiosciences13-5921-85
溴酚蓝Sigma-AldrichB0126-25G
CD24-AF-700BD Pharmingen564237
CD24-PEeBiosciences12-0242-83
CD29-APCeBiosciences17-0291-82
CD29-PEeBiosciences12-0291-82
脱毛乳液Nair9 盎司
Hamilton注射器Hamilton7636-010.025 mL
碘伏Betadine10% 聚维酮碘
异氟烷BaxterNDC 10019-360-401–2.5%
罗昔康NorbrookNDC 55529-040-105 mg/mL
润滑性眼膏AkornNDC 17478-062-35
显微解剖剪Pentair9M钟表匠镊子
显微解剖镊DumontM5
Taq 5X 主混合液New England BiolabsM0285L

参考文献

  1. Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
  2. Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
  3. Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
  4. van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881(2014).
  5. Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
  6. Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
  7. Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
  8. Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
  9. Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
  10. Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
  11. Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
  12. Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431(2017).
  13. Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
  14. Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
  15. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  16. The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  17. Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
  18. Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

腺病毒注射角蛋白8启动子角蛋白5启动子流式细胞术Rosa26-YFP报告基因乳腺上皮细胞乳腺癌模型
通过向小鼠乳腺导管内注射表达Cre的腺病毒建立乳腺癌模型
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。