本实验方案旨在介绍一种基于将表达Cre的腺病毒通过导管内注射至小鼠乳腺中来建立乳腺癌模型的新方法。该方法能够以时间可控的方式，在特定细胞类型和器官中特异性调控致癌事件。
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本文内容
摘要
摘要
乳腺癌是一种异质性疾病，可能源于不同起源细胞与致癌事件之间的复杂相互作用。小鼠模型对于深入理解这些复杂过程具有重要作用。尽管已有多种小鼠模型被开发用于研究不同致癌事件和起源细胞在乳腺肿瘤发生中的作用，但这些模型往往缺乏细胞类型或器官特异性，或无法以时间可控的方式诱导乳腺肿瘤的发生。本文介绍一种基于向小鼠乳腺导管内注射表达Cre的腺病毒（Ad-Cre）来构建新型乳腺癌小鼠模型的实验方案。由于Ad-Cre直接注射至乳腺导管内，该方法具有乳腺特异性，不会在其他器官中引发非预期的肿瘤。该导管内注射操作可在小鼠乳腺发育的不同阶段进行（因此可实现从约3-4周龄起对肿瘤诱导的时间控制）。通过在腺病毒载体中使用不同细胞类型特异性的启动子驱动Cre表达，可实现对特定细胞类型的靶向。我们证明，分别在角蛋白8（Keratin 8）或角蛋白5（Keratin 5）启动子控制下，通过导管内注射Ad-Cre，可高效且特异地靶向乳腺腔面细胞和基底细胞（MECs），实现基于Cre/loxP系统的遗传操作。通过引入条件性Cre报告基因（例如Cre/loxP诱导型Rosa26-YFP报告系统），我们证实经Ad-Cre靶向的MECs及其衍生的肿瘤细胞，可在导管内注射后通过追踪报告基因阳性细胞进行示踪。
引言
本方法的总体目标是建立一种基于将Ad-Cre注射至小鼠乳腺导管（MG）内来模拟乳腺癌的新方法。基于Cre/loxP重组系统的遗传学方法已被广泛用于在小鼠中模拟人类乳腺癌。第一代基于Cre/loxP的乳腺癌小鼠模型是通过使用在乳腺上皮细胞（MEC）特异性启动子控制下表达Cre的转基因小鼠构建的（例如，MMTV-Cre用于管腔型MEC及部分基底型MEC，Wap-Cre和Blg-Cre用于管腔祖细胞和腺泡管腔MEC，K14-Cre用于基底型MEC及部分管腔型MEC1,2,3,4,5)6,7,8,9）。然而，尽管这些Cre转基因品系能够实现Cre表达的空间控制（即在不同亚群的MEC中表达），但无法实现对Cre表达及Cre/loxP介导的遗传操作的时间控制。第二代基于Cre/loxP的乳腺癌小鼠....
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方案
本文所述所有方法均已获得布莱根妇女医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 条件性基因敲除小鼠的制备与保种
- 从杰克逊实验室（The Jackson Laboratory，JAX）或美国国家癌症研究所人类癌症小鼠模型联盟（NCI Mouse Models of Human Cancer Consortium，MMHCC）资源库获取与乳腺癌相关的条件性敲除（floxed conditional knockout）小鼠品系（例如 Trp53tm1Brn [简称 Trp53L/L]、Brca1tm1Aash [Brca1L/L]），或条件性敲入小鼠品系（例如 Gt(ROSA)26Sortm1(Pik3ca*H1047R)Egan）。此外，为便于追踪经历 Cre 介导重组的乳腺上皮细胞（MECs），还可从 JAX 获取条件性 Cre 报告基因小鼠品系（例如 Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos [简称 R26Y]）。
- 将 Trp53L/L 纯合子小鼠与 R26Y 纯合子报告基因小鼠交配，或与携带
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结果
代表性PCR基因分型结果 R26Y 和 Trp53L 等位基因显示在 图1.
尽管原则上所有10个乳腺（MG）均可进行导管内注射操作，但实际操作中通常选择两个第四腹股沟乳腺进行注射，因其更容易接近且乳腺体积较大（图2）。手术过程中，应保持工作区域无菌且整洁，并使用无菌器械进行操作（图3）。在导管内注射过程中，向注射混合物中加入蓝色染料（如溴酚蓝）有助于观察腺病毒-Cre（Ad-Cre）是否成功注入整个导管系统（图4）。可成功实施导管内注射（使用较小体积的注射混合物）的最年轻雌性小鼠约为3周龄（图4A）.......
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讨论
该方法通过不同亚群的乳腺上皮细胞（MECs）诱导乳腺肿瘤的成功，不仅依赖于选择适当的细胞类型特异性启动子（以驱动Cre表达），还依赖于导管内注射操作本身。该策略的原理在于，注射的Ad-Cre病毒可保留在具有管腔结构的乳腺导管树中，从而仅使MECs暴露并感染Ad-Cre病毒。由于乳腺导管内管腔空间有限，每次向乳腺（MG）注射的体积必须控制在较小范围内（即约3–5 µL）。注射体积还应根据小鼠的年龄进行调整（例如，对3至4周龄小鼠注射时应使用更小的体积）。当注射液体积过大时，由于注射压力及导管管腔空间受限，液体可能溢出 "推出" 穿过上皮层进入基质，导致基质细胞发生不必要的病毒感染。
由于腺病毒载体中用于驱动 Cre 表达的启动子决定了细胞类型的特异性，因此该方法的一个局限性在于可能缺乏能够将 Cre 表达特异性靶向某一特定乳腺上皮细胞（MEC）亚群的合适启动子。我们此前曾报道使用广谱腔面细胞特异性 Ad-K8-Cre 病毒靶向腔面型 MECs12,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 CA222560和美国国防部突破奖W81XWH-18-1-0037支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 33号针头 | Hamilton | 7803-05 | 3型钝头 |
| 7 mm 反射夹 | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| 腺病毒 Ad-K5-Cre | 爱荷华大学病毒载体中心 | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| 腺病毒 Ad-K8-Cre | 爱荷华大学病毒载体中心 | Ad5mK8-nlsCre | |
| 酒精 | Fisher | HC800-1GAL | 使用时配制成70% |
| 生物素标记CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| 生物素标记CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| 生物素标记TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| 溴酚蓝 | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| 脱毛乳液 | Nair | 9 盎司 | |
| Hamilton注射器 | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| 碘伏 | Betadine | 10% 聚维酮碘 | |
| 异氟烷 | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1–2.5% |
| 罗昔康 | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/mL |
| 润滑性眼膏 | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| 显微解剖剪 | Pentair | 9M | 钟表匠镊子 |
| 显微解剖镊 | Dumont | M5 | |
| Taq 5X 主混合液 | New England Biolabs | M0285L |
参考文献
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (19....
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重印与许可
