利用斑马鱼幼虫作为宿主的胰腺癌患者来源异质性异种移植模型用于药物比较评估

摘要

本方案描述了利用斑马鱼幼体作为宿主的病毒介导双荧光标记肿瘤异种移植模型的优化步骤。该异质性异种移植模型可模拟胰腺癌微环境的组织构成，在个性化的斑马鱼患者来源异种移植（zPDX）模型中为评估药物反应提供了更为精确的工具。

摘要

患者来源的肿瘤异种移植（PDX）和细胞来源的肿瘤异种移植（CDX）是临床前评估、药物指导及基础癌症研究的重要技术。在传统宿主小鼠中建立PDX模型耗时较长，且仅适用于少数样本。近年来，斑马鱼PDX（zPDX）作为一种独特的宿主系统逐渐兴起，具有规模小、效率高的特点。本文介绍了一种优化的方法，用于构建双荧光标记的肿瘤异种移植模型，以在zPDX模型中进行比较性化疗评估。在不同培养条件下，从新鲜或冷冻的胰腺癌组织中分别富集肿瘤细胞和成纤维细胞。利用慢病毒对这两类细胞分别标记绿色或红色荧光蛋白，以及抗凋亡基因BCL2L1。将转染后的细胞预先混合后共同注射至2 dpf的斑马鱼幼鱼体内，并在改良E3培养基中于32 °C条件下培养。随后，对异种移植模型施用化疗药物和/或BCL2L1抑制剂，同时检测肿瘤细胞和成纤维细胞的存活情况。综上所述，该实验方案使研究人员能够快速构建大量具有异质性肿瘤微环境的zPDX模型，并在评估候选药物疗效时提供更长的观察窗口和更精确的定量分析。

引言

精准肿瘤学旨在为个体患者寻找最有益的治疗策略¹目前，已有多种临床前模型，例如体外原代培养、体外类器官培养²以及在类器官培养前后将患者来源的异种移植瘤（PDX）植入小鼠体内，可用于诊断及筛选或评估潜在的治疗方案³通过将人源原代癌细胞注射到免疫缺陷小鼠体内构建的PDX模型，是临床肿瘤学中用于个性化药物筛选最有前景的工具之一^3,4与体外培养的细胞系不同，PDX模型通常能够保留体内肿瘤微环境的完整性和异质性，更好地模拟不同肿瘤患者的多样性及个体特异性特征，因而可能更准确地预测患者的潜在治疗效果⁴然而，在小鼠中建立PDX模型需要高质量的患者样本，并需花费数月时间才能获得足够数量的细胞和模型用于多组实验，且异种移植瘤的细胞/遗传组成可能与原始患者样本发生偏离^’活检。建立小鼠PDX模型的成功率也较低，这使其难以在临床上广泛应用。对于携带胰腺癌等进展迅速癌症的患者而言，可能无法及时从PDX实验中获得有价值的信息。 

近年来，斑马鱼不仅被报道可作为CDX（细胞来源肿瘤异种移植）模型的潜在宿主，也可用于PDX模型⁵

方案

所有动物实验均经复旦大学动物伦理委员会批准，并遵循其指导方针；所有胰腺癌标本均来自复旦大学上海癌症中心。研究已获得复旦大学上海癌症中心伦理委员会的伦理批准，并从每位患者处获取了书面知情同意书。

1. 准备显微注射所需的设备

1. 准备注射板。
   1. 制备50 mL含1%琼脂糖的E3溶液（双蒸水中含0.6 g/L水族盐和0.01 mg/L亚甲蓝）。加热煮沸至琼脂糖完全溶解。
   2. 将50 mL琼脂糖溶液倒入直径10 cm的培养皿中，然后将斑马鱼胚胎固定模具置于表面。待琼脂糖溶液凝固后，移去模具。
   3. 向注射板中加入20 mL E3溶液，并于4 °C保存以供长期使用。
2. 准备注射针。
   1. 使用拉针仪将一根长10 cm、内径为0.9 mm的玻璃毛细管拉成两根注射针。
   2. 在显微镜下用镊子剪断针尖末端，以形成开口。

2. 准备受体胚胎进行移植

1. 在晚上7-9点将1至2对成年斑马鱼放入交配缸中，并于次日上午8点左右收集受精卵。
2. 将受精卵从交配缸转移至含有40 mL新鲜E3溶液的培养皿中，在28.5 °C条件下培养。
<....

结果

该实验流程的示意图如图1所示。简言之，将原发性癌组织细胞经消化后接种于完全培养基中，部分培养基中添加胰腺癌成纤维细胞抑制剂，部分不添加。癌细胞与成纤维细胞富集为两个不同的细胞群体：未加抑制剂时以成纤维细胞为主，加入抑制剂后则以癌细胞生长占优势（图2）。构建了两种慢病毒包装载体，分别表达绿色或红色荧光蛋白以及BCL2L1，如图3所示。基于病毒的荧光标记还可反映细胞的存活状态。将混合的癌细胞与成纤维细胞注射至48小时受精龄（hpf）斑马鱼的卵黄囊中，并用吉西他滨和/或 navitoclax 处理两天。不同细胞群体的存活率及异种移植瘤的细胞组成随药物处理而发生变化（图4）。

讨论

PDX 和 CDX 模型在肿瘤生物学领域都是重要的研究平台²²，而成功实现跨物种移植的关键步骤是提高异种移植物的存活率。 最近一些研究表明，在小鼠宿主体内，短暂表达BCL2L1 (BCL-XL) 或 BCL2 可显著提高人胚胎干细胞的存活能力，同时不影响细胞的身份和命运^23,24,25。在本研究中，我们利用慢病毒对细胞进行标记，使其持续表达抗凋亡基因BCL2L1 (BCL-XL)以及荧光蛋白。BCL2L1的引入显著延长了人源细胞在斑马鱼体内的存活时间，从而延长了研究的观察窗口；而荧光信号不仅可用于标记细胞，还可反映细胞的存活状态，因为我们发现细胞死亡后荧光会迅速减弱。 同时，我们目前正在对斑马鱼进行改造，以使其成为更适合人源异种移植物的宿主。一方面，我们正利用 CRISPR/Cas9 技术敲除

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	GIBCO	C11995500BT
FBS	Hyclone	sv30087.03
Y-27632	Cliniscience	Y0503	Rho 激酶抑制剂
Primocin	invivogen	ant-pm-1	用于原代细胞培养的抗生素
腐胺二盐酸盐	Sigma	P5780
烟酰胺	Sigma	N3376
青霉素-链霉素	GIBCO	15140122.00
磷酸盐缓冲液（PBS）	GIBCO	C10010500CP
HBSS	GIBCO	14170112.00
IV 型胶原酶	GIBCO	17104019.00
透明质酸酶	Sigma	H3884
DNase I	Sigma	D5025
胰岛素	Sigma	I9278
b-FGF	GIBCO	PHG0264
EGF	GIBCO	PHG0314
胰腺癌成纤维细胞抑制剂	CHI Scientific	FibrOUT
0.45 μm 无菌滤器	Millipore	SLHV033RB
浓缩柱	Millipore	Millipore UFC910008	用于病毒浓缩
聚凝胺	Sigma	H9268
透明质酸钠盐	Sigma	H7630
L-谷氨酰胺	GIBCO	21051024.00
吉西他滨	Gemzan
甲基纤维素	Sigma	M0262
Navitoclax(ABT-263)	Selleck	S1001	Bcl-xL 抑制剂
仪器
显微注射仪	NARISHIGE
体视显微镜	OLYMPUS	MVX10
共聚焦显微镜	LEICA	SP8	0.00