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方法文章

利用斑马鱼幼虫作为宿主的胰腺癌患者来源异质性异种移植模型用于药物比较评估

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DOI：

10.3791/59507

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2019年4月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Key Laboratory of Metabolism and Molecular Medicine, Ministry of Education, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, 2National Human Genetic Resources Sharing Service Platform (2005DKA21300), 3Fudan University Shanghai Cancer Center, 4Department of Pancreatic Surgery, Fudan University Shanghai Cancer Center, 5Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, 6Pancreatic Cancer Institute, Fudan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了利用斑马鱼幼体作为宿主的病毒介导双荧光标记肿瘤异种移植模型的优化步骤。该异质性异种移植模型可模拟胰腺癌微环境的组织构成，在个性化的斑马鱼患者来源异种移植（zPDX）模型中为评估药物反应提供了更为精确的工具。

摘要

患者来源的肿瘤异种移植（PDX）和细胞来源的肿瘤异种移植（CDX）是临床前评估、药物指导及基础癌症研究的重要技术。在传统宿主小鼠中建立PDX模型耗时较长，且仅适用于少数样本。近年来，斑马鱼PDX（zPDX）作为一种独特的宿主系统逐渐兴起，具有规模小、效率高的特点。本文介绍了一种优化的方法，用于构建双荧光标记的肿瘤异种移植模型，以在zPDX模型中进行比较性化疗评估。在不同培养条件下，从新鲜或冷冻的胰腺癌组织中分别富集肿瘤细胞和成纤维细胞。利用慢病毒对这两类细胞分别标记绿色或红色荧光蛋白，以及抗凋亡基因BCL2L1。将转染后的细胞预先混合后共同注射至2 dpf的斑马鱼幼鱼体内，并在改良E3培养基中于32 °C条件下培养。随后，对异种移植模型施用化疗药物和/或BCL2L1抑制剂，同时检测肿瘤细胞和成纤维细胞的存活情况。综上所述，该实验方案使研究人员能够快速构建大量具有异质性肿瘤微环境的zPDX模型，并在评估候选药物疗效时提供更长的观察窗口和更精确的定量分析。

引言

精准肿瘤学旨在为个体患者寻找最有益的治疗策略1目前，已有多种临床前模型，例如体外原代培养、体外类器官培养2以及在类器官培养前后将患者来源的异种移植瘤（PDX）植入小鼠体内，可用于诊断及筛选或评估潜在的治疗方案3通过将人源原代癌细胞注射到免疫缺陷小鼠体内构建的PDX模型，是临床肿瘤学中用于个性化药物筛选最有前景的工具之一3,4与体外培养的细胞系不同，PDX模型通常能够保留体内肿瘤微环境的完整性和异质性，更好地模拟不同肿瘤患者的多样性及个体特异性特征，因而可能更准确地预测患者的潜在治疗效果4然而，在小鼠中建立PDX模型需要高质量的患者样本，并需花费数月时间才能获得足够数量的细胞和模型用于多组实验，且异种移植瘤的细胞/遗传组成可能与原始患者样本发生偏离’活检。建立小鼠PDX模型的成功率也较低，这使其难以在临床上广泛应用。对于携带胰腺癌等进展迅速癌症的患者而言，可能无法及时从PDX实验中获得有价值的信息。 

近年来，斑马鱼不仅被报道可作为CDX（细胞来源肿瘤异种移植）模型的潜在宿主，也可用于PDX模型5,6,7,8,9,10。作为一种脊椎动物模型，斑马鱼在遗传学和生理学上与哺乳动物具有足够的相似性，且具备两个显著优势：身体透明和个体微小11。斑马鱼繁殖力强，一对成鱼在数天内即可产生数百条近交系幼鱼12。已有多个研究利用斑马鱼构建了转基因和异种移植的癌症疾病模型13,14。与小鼠异种移植相比，斑马鱼异种移植可实现单细胞分辨率的动态追踪。一定量的人体组织可构建数百个斑马鱼PDX模型（zPDXs），而仅能构建少数几个小鼠PDX模型15,16。此外，斑马鱼幼鱼在2–5天后（dpf）已发育出完整的循环系统以及肝脏、肾脏等代谢器官，但免疫系统尚未发育成熟17，而残留的卵黄囊则是一种天然的三维培养环境，非常适合用于药物筛选、耐药性检测以及肿瘤迁移观察6,18,19,20,21。

为了最终将zPDX用作临床应用的筛选/测试平台，本文介绍了一种优化的胰腺癌zPDX模型构建方案，该方案可在较短时间内以较少细胞数量和较低成本实现候选药物的体内评估。相较于以往关于zPDX的文献6,9,10，我们引入了多项优化措施，以提高该系统在临床个体化诊断中的可行性与可靠性：1）对原发肿瘤组织中的不同细胞群进行预分选，并在进一步实验前将原代细胞稳定培养一周；2）利用慢病毒介导的遗传修饰对人源细胞进行标记，并提高其在异种移植中的细胞活力；3）优化斑马鱼的培养条件，包括营养补充物（葡萄糖和谷氨酰胺）和培养温度；4）以比较方式定量评估不同类型细胞对药物的反应。此外，我们还通过添加多种辅助成分对注射溶液进行了改良。总体而言，这些改进使得能够在斑马鱼宿主体内快速构建出更接近患者特征的异种移植模型，从而为候选药物疗效评估提供一种可靠的工具。

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方案

所有动物实验均经复旦大学动物伦理委员会批准，并遵循其指导方针；所有胰腺癌标本均来自复旦大学上海癌症中心。研究已获得复旦大学上海癌症中心伦理委员会的伦理批准，并从每位患者处获取了书面知情同意书。

1. 准备显微注射所需的设备

  1. 准备注射板。
    1. 制备50 mL含1%琼脂糖的E3溶液（双蒸水中含0.6 g/L水族盐和0.01 mg/L亚甲蓝）。加热煮沸至琼脂糖完全溶解。
    2. 将50 mL琼脂糖溶液倒入直径10 cm的培养皿中，然后将斑马鱼胚胎固定模具置于表面。待琼脂糖溶液凝固后，移去模具。
    3. 向注射板中加入20 mL E3溶液，并于4 °C保存以供长期使用。
  2. 准备注射针。
    1. 使用拉针仪将一根长10 cm、内径为0.9 mm的玻璃毛细管拉成两根注射针。
    2. 在显微镜下用镊子剪断针尖末端，以形成开口。

2. 准备受体胚胎进行移植

  1. 在晚上7-9点将1至2对成年斑马鱼放入交配缸中，并于次日上午8点左右收集受精卵。
  2. 将受精卵从交配缸转移至含有40 mL新鲜E3溶液的培养皿中，在28.5 °C条件下培养。
  3. 在E3溶液中培养8小时后，向其中加入0.03%的1-苯基-2-硫脲（PTU）以抑制色素形成。将胚胎在含0.03% PTU的E3溶液中于28.5 °C继续培养至48 hpf。若使用近交系Casper突变型斑马鱼，则可省略此步骤。

3. 从新鲜手术胰腺癌标本或冷冻组织中分离和培养原代人类细胞

  1. 获取约1 cm大小的人胰腺癌组织标本3 在腹部手术期间获取组织，并立即将其转移至生长培养基中（DMEM，含10%胎牛血清（FBS）、10 μM Y-27632、100 μg/mL primocin、10 μg/mL 二盐酸腐胺、10 mM 烟酰胺和1%青霉素-链霉素）。
  2. 将胰腺癌样本转移至培养皿中，并剔除周围的坏死组织、脂肪组织和结缔组织。
  3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）将癌组织冲洗5-6次，并将组织切成1 mm大小3 使用手术刀切割成小块。
  4. 将剪碎的组织转移至含有5 mL HBSS的50 mL离心管中，并加入IV型胶原酶、透明质酸酶和DNase I，终浓度分别为200 units/mL、100 mg/L和20 mg/L。用移液器反复吹打混合均匀。
  5. 在37 °C、5%二氧化碳培养箱中孵育混合物15-20分钟。每5分钟用移液器将混合物上下吹打几次。
  6. 加入7 mL DMEM至离心管中，于110 x g条件下离心 g 消化完成后，在 4 °C 下离心 5 分钟。
  7. 弃去上清液，用DMEM重新悬浮肿瘤混合物。
  8. 将混合物接种至含3 mL完全培养基（DMEM，含10% FBS、20 μg/mL胰岛素、100 ng/mL bFGF、10 ng/mL EGF、10 μM Y-27632、100 μg/mL primocin、10 μg/mL盐酸腐胺、10 mM烟酰胺、1%青霉素-链霉素）的6 cm培养皿中。将细胞分为两组。
  9. 第一组：48小时后向培养基中加入100倍浓度的胰腺癌成纤维细胞抑制剂，以清除过度生长的成纤维细胞，使癌细胞成为主要的细胞类型；第二组：成纤维细胞将在一周内过度生长并超过癌细胞。
  10. 根据细胞密度和纯度，将两组细胞培养1-2周，每三天更换一次培养基。预期在两组中获得的细胞类型包括 & II 在典型的成功实验中比例可超过 98%。

4. 分别使用表达抗凋亡基因 BCL2L1 (BCL-XL) 和不同荧光蛋白的慢病毒标记细胞

  1. 慢病毒生产
    1. 接种 3 × 106 在10 cm培养皿中，将HEK 293T细胞接种于含10%胎牛血清的完全DMEM培养基中，于37 °C、5%二氧化碳培养箱中过夜培养。转染前更换为6 mL无血清培养基。
    2. 制备溶液A：8 μg的 BCL2L1含有慢病毒载体（pCDH-EF1α-mKate2-E2A-BCL2L1-WPRE 或 pCDH-EF1α-eGFP-E2A-BCL2L1-WPRE）、2.4 μg pVSVG、4 μg pMDL(Gag/Pol)、1.6 μg pREV 以及无血清 DMEM，总体积为 500 µL。轻轻吹打混合数次，室温放置 5 分钟。
    3. 配制溶液B：将40 µL PEI（聚乙烯亚胺）加入460 µL无血清DMEM中，室温放置5分钟。
    4. 将溶液B缓慢加入溶液A中，室温下静置30分钟。
    5. 将最终混合物加入第4.1.1步制备的HEK 293T细胞培养皿中，置于含5%二氧化碳的37 °C培养箱中孵育。12小时后，补充5 mL完全DMEM培养基。48小时后，收集含有慢病毒的培养上清。
    6. 使用 0.45 μm 无菌滤器过滤上清液，将滤过的上清液加入浓缩柱中，在 6,000 x g 在4 °C下孵育25-30分钟。将慢病毒分装为每管100 µL，于-80 °C保存。
  2. 原代细胞的感染
    1. 接种细胞（第 I 组 & II) 在12孔板中以30-40%的密度接种细胞，于37 °C、5%二氧化碳培养箱中培养过夜。
    2. 更换为含8 μg/mL多聚素（polybrene）的无血清培养基500 µL，孵育4 h。随后，在培养基中加入额外100 µL慢病毒（I组为eGFP-E2A-BCL2L1，II组为mKate2-E2A-BCL2L1）。12 h后，更换培养基为1 mL 完全培养基。
    3. 48小时后检查荧光标记。
    4. 收获感染的细胞，并以1:1比例混合，终浓度为106/mL
    5. 以 110 x g 离心细胞 g 5分钟后，将细胞混合物重悬于50 µL注射液（含10% FBS、0.05%透明质酸钠盐、0.05%甲基纤维素的1640培养基）中。

5. 将混合细胞悬液注射到斑马鱼体内

  1. 将10倍浓度的三卡因溶液加入E3水中以麻醉斑马鱼幼鱼，并将幼鱼（来自步骤2.3）转移至含有改良E3溶液（含1 g/L葡萄糖和5 mmol/L L-谷氨酰胺的E3溶液）的注射板中。
  2. 将25 µL混合细胞悬液吸入微量毛细玻璃针中，并将针头插入显微注射操作仪。
  3. 设定注射压力和时间，向48 hpf斑马鱼的卵黄囊内注射50–80个细胞（约8 nL）。

6. 异种移植斑马鱼（zPDX模型）的培养

  1. 将移植异种移植物后的斑马鱼幼鱼转移至40 mL混合溶液（含1 g/L葡萄糖和5 mmol/L L-谷氨酰胺的E3溶液）中，在32 °C条件下培养。

7. 药物在异种移植斑马鱼模型中的给药及肿瘤细胞/成纤维细胞活力的评估

  1. 确定吉西他滨/Navitoclax 的最佳浓度。
    1. 将 10 条野生型斑马鱼胚胎（48 hpf）放入 12 孔板的每个孔中。
    2. 在每个孔中加入不同浓度的吉西他滨或 Navitoclax，并在 32 °C 下孵育两天。
    3. 两天后，计算吉西他滨和 Navitoclax 的最大耐受剂量（MTD），即斑马鱼幼鱼未出现明显畸形和异常行为时的剂量，并将工作浓度设定在 MTD 以下。
  2. 使用吉西他滨/Navitoclax 处理 zPDX 模型。
    1. 将 10 条移植了肿瘤的斑马鱼幼鱼放入 12 孔板的每个孔中。
    2. 将幼鱼分为四组，对照组使用含 0.1% DMSO 的 E3 培养基处理，其余各组分别用 5 μg/mL 吉西他滨和/或 50 μM Navitoclax 处理，并在 32 °C 下孵育两天。
  3. 评估 zPDX 模型中的细胞活力与细胞组成。
    1. 处理后对移植了肿瘤的幼鱼进行麻醉，并将其置于 3% 甲基纤维素中。
    2. 使用荧光显微镜或共聚焦显微镜从侧视角度对幼鱼进行成像。
    3. 使用 ImageJ 和 GraphPad 软件定量分析红色和绿色荧光信号的强度。

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结果

该实验流程的示意图如图1所示。简言之，将原发性癌组织细胞经消化后接种于完全培养基中，部分培养基中添加胰腺癌成纤维细胞抑制剂，部分不添加。癌细胞与成纤维细胞富集为两个不同的细胞群体：未加抑制剂时以成纤维细胞为主，加入抑制剂后则以癌细胞生长占优势（图2）。构建了两种慢病毒包装载体，分别表达绿色或红色荧光蛋白以及BCL2L1，如图3所示。基于病毒的荧光标记还可反映细胞的存活状态。将混合的癌细胞与成纤维细胞注射至48小时受精龄（hpf）斑马鱼的卵黄囊中，并用吉西他滨和/或 navitoclax 处理两天。不同细胞群体的存活率及异种移植瘤的细胞组成随药物处理而发生变化（图4）。

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讨论

PDX 和 CDX 模型在肿瘤生物学领域都是重要的研究平台22，而成功实现跨物种移植的关键步骤是提高异种移植物的存活率。 最近一些研究表明，在小鼠宿主体内，短暂表达BCL2L1 (BCL-XL) 或 BCL2 可显著提高人胚胎干细胞的存活能力，同时不影响细胞的身份和命运23,24,25。在本研究中，我们利用慢病毒对细胞进行标记，使其持续表达抗凋亡基因BCL2L1 (BCL-XL)以及荧光蛋白。BCL2L1的引入显著延长了人源细胞在斑马鱼体内的存活时间，从而延长了研究的观察窗口；而荧光信号不仅可用于标记细胞，还可反映细胞的存活状态，因为我们发现细胞死亡后荧光会迅速减弱。 同时，我们目前正在对斑马鱼进行改造，以使其成为更适合人源异种移植物的宿主。一方面，我们正利用 CRISPR/Cas9 技术敲除

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披露

未披露任何潜在的利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金 81402582、上海市自然科学基金 12DZ2295100、14YF1400600 和 18ZR1404500 的支持

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMGIBCOC11995500BT
FBSHyclonesv30087.03
Y-27632CliniscienceY0503Rho 激酶抑制剂
Primocininvivogenant-pm-1用于原代细胞培养的抗生素
腐胺二盐酸盐SigmaP5780
烟酰胺SigmaN3376
青霉素-链霉素GIBCO15140122.00
磷酸盐缓冲液（PBS）GIBCOC10010500CP
HBSSGIBCO14170112.00
IV 型胶原酶GIBCO17104019.00
透明质酸酶SigmaH3884
DNase ISigmaD5025
胰岛素SigmaI9278
b-FGFGIBCOPHG0264
EGFGIBCOPHG0314
胰腺癌成纤维细胞抑制剂CHI ScientificFibrOUT
0.45 μm 无菌滤器MilliporeSLHV033RB
浓缩柱MilliporeMillipore UFC910008用于病毒浓缩
聚凝胺SigmaH9268
透明质酸钠盐SigmaH7630
L-谷氨酰胺GIBCO21051024.00
吉西他滨Gemzan
甲基纤维素SigmaM0262
Navitoclax(ABT-263)SelleckS1001Bcl-xL 抑制剂
仪器
显微注射仪NARISHIGE
体视显微镜OLYMPUSMVX10
共聚焦显微镜LEICASP80.00

参考文献

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