多发性硬化症患者全面尸检项目

摘要

多发性硬化症是一种炎性脱髓鞘疾病，目前尚无治愈方法。对脑组织的分析为理解该疾病的发病机制提供了重要线索。本文讨论了通过克利夫兰诊所特有的快速尸检项目所采集的多发性硬化症脑组织样本的研究方法及其后续分析。

摘要

我们介绍了一项针对多发性硬化症（MS）患者的快速组织捐献项目，该项目要求科研人员和技术人员全年365天、每天24小时待命。参与者同意捐献其脑组织和脊髓组织。大多数患者由克利夫兰诊所Mellen多发性硬化治疗与研究中心的神经科医生进行长期随访，其临床病程和神经功能障碍情况记录详尽。患者去世后，遗体迅速转运至MS影像中心，利用3 T磁共振成像（MRI）对脑组织进行原位扫描。随后，遗体被转移至解剖室，进行脑和脊髓的摘取。脑组织被分为两个半球：其中一个半球立即放入切片盒中，交替切成1 cm厚的切片，其中部分切片用4%多聚甲醛固定两天，另一部分则在干冰和2-甲基丁烷中快速冷冻。短时间固定的脑切片保存于冷冻保护液中，用于组织学分析及敏感抗原的免疫细胞化学检测；冷冻切片则储存在-80 °C环境中，用于分子生物学、免疫细胞化学以及原位杂交/RNA scope研究。另一个脑半球则在4%多聚甲醛中固定数月后，再放入切片盒，重新在3 T磁共振（MR）扫描仪中进行扫描，并切成1 cm厚的切片。死后原位MR图像（MRIs）与1 cm厚脑切片进行共配准，以促进MRI与病理学之间的关联分析。所有脑切片均进行拍照，脑白质病变区域被识别标记。脊髓被切成2 cm长的节段，交替进行4%多聚甲醛固定或快速冷冻处理。这种快速获取的死后MS组织样本，使得对MS脑和脊髓的病理学与分子生物学分析以及脑MRI异常的病理相关性研究成为可能。这些快速处理的死后组织样本（通常在死亡后6小时内完成处理）质量极高，对多发性硬化研究具有重要价值，并已促成多项高影响力的研究发现。

引言

研究疾病的最佳方法之一是直接检查病变组织本身。这对于研究中枢神经系统（CNS）疾病的研究人员而言带来了诸多挑战。病变脑组织和脊髓的活检极为罕见，通常仅见于非典型病例。近年来，中枢神经系统疾病患者的尸检率显著下降，而即便进行尸检，也往往无法实现组织的快速获取。这些困难促使建立了以疾病为中心的脑组织库，其中多个组织库专注于收集多发性硬化症（MS）患者的组织样本。多发性硬化症是一种由炎症介导的中枢神经系统疾病，可破坏髓鞘、少突胶质细胞（形成髓鞘的细胞）、神经元以及轴突。大多数多发性硬化症患者呈现双相病程，初期表现为反复发作的神经功能障碍，伴有不同程度的功能恢复，最终演变为一种可能具有神经退行性特征的渐进性病程¹。对于大多数捐赠的多发性硬化症脑组织而言，死亡至组织处理之间的死后间隔（PMI）超过24小时。尽管这些组织为了解多发性硬化症脑组织的病理改变提供了宝贵信息，但并不适用于更高级的分子研究，而后者能够深入揭示疾病的病理生理机制。基因表达谱分析尤其如此，这类研究需要完整的RNA。

为克服上述局限性，我们建立了一项快速组织捐献计划，以实现磁共振成像（MRI）与病理学的关联分析。本方案可获得保存良好的组织样本，适用于现代分子生物学研究，并允许对多发性硬化（MS）脑组织的病理改变与MRI异常进行直接比较。克利夫兰诊所多发性硬化组织捐献计划已运行超过20年。该快速组织捐献计划从多发性硬化及其他相关自身免疫性神经系统疾病患者中获取脑组织和脊髓组织。本项目的目标是在死亡后6小时内完成原位MRI扫描，随后取出脑和脊髓组织进行后续处理。

招募
捐献通过两种方式获得：一种是患者生前直接签署的知情同意（预先同意），另一种是在患者去世后由其近亲签署同意。预先同意的患者通常来自俄亥俄州克利夫兰市Mellen多发性硬化症治疗与研究中心的临床患者群体。尽管快速组织捐献项目在招募时优先考虑那些已参与长期纵向研究的患者，但该项目对所有在该中心就诊的患者开放。在去世前登记的参与者会收到相关说明，指导其家属或护理人员在患者死亡或被认为即将死亡时联系研究团队。个体进入组织捐献项目的第二种方式是在死亡后由近亲签署同意书。根据俄亥俄州的规定，所有死亡案例必须上报给一个联邦授权的器官获取组织——LifeBanc，该组织负责俄亥俄州东北部20个县的器官捐献工作。LifeBanc会对所有死亡病例进行多发性硬化症（MS）诊断筛查，而MS是器官捐献的排除标准。因此，已安排LifeBanc向MS组织捐献项目的研究人员通报所有发生在克利夫兰诊所75英里半径范围内的、伴有MS诊断的死亡病例。随后，组织捐献项目工作人员将联系近亲和医院工作人员，并获取其同意捐献脑组织和脊髓组织。通过生前和死后（经由LifeBanc）这两种招募方式，每年大约可获得10至12例脑组织捐献。为控制来自LifeBanc的转介数量，会对允许捐献的最高死亡年龄上限进行相应调整。

组织捐献的获取
该计划每年365天、每天24小时均需由组织捐献项目成员负责组织获取工作。临床团队通过集中式的组织捐献通知电子邮件/传呼机/移动设备短信通知系统接收捐献信息。LifeBanc机构掌握可联系的组织捐献项目值班人员电话号码。项目成员通过医院提供者或亲属（已预先同意）或通过LifeBanc及其他转介来源获知死亡信息。首先需确认死亡时间并评估是否适合进行组织捐献。随后对死亡病例进行筛查，排除可能影响组织质量的情况，包括：临终前长时间缺氧、严重的破坏性脑组织损伤（如大范围颅内出血、广泛性双侧半球卒中、肿瘤负荷大）、死亡前长时间使用呼吸机（>3天）以及长时间使用血管活性药物（>3天）。当死亡案件涉及法医时，研究神经科医生可与法医沟通，探讨在不损害法医职责的前提下及时获取组织的可行性。若判断存在可用的组织，则需获取书面知情同意（如生前未取得），并开始安排遗体转运。随后联系事先签约的遗体转运服务机构，将遗体运送至克利夫兰诊所的MRI设施。转运过程中需确保遗体保持在室温状态，不得冷藏，因为较低的体温会影响MRI信号特征。

临床病史
临床病史包括多发性硬化（MS）的诊断详情、症状起始时间、所采用的治疗方案、临床及辅助检查结果（诱发电位、脑脊液检查结果、光学相干断层扫描）、多发性硬化功能复合评分以及扩展残疾状态量表（EDSS；实际值或估计值）。上述信息来源于病历记录（如可获取）及对近亲属的直接访谈。同时收集死亡前的磁共振成像（MRI）资料。

方案

本方案已获得克利夫兰诊所机构审查委员会的批准，并遵循克利夫兰诊所人类研究伦理委员会的指南。

1. 原位 MRI

1. 将供体遗体送至磁共振成像室，在MS成像中心进行为期2小时的MRI成像方案。使用3 T或7 T成像仪进行MRI扫描。
   注意：优先使用3 T设备，因为大部分历史数据均在3 T设备上完成；但在3 T不可用时，则采用7 T设备进行成像。所有病例均需完成指定的核心序列（表1），若时间允许（需确保在死亡后12小时内完成组织固定），还可根据当前研究兴趣增加其他序列。表1描述了核心成像序列。

2. 尸检

注意：原位 MRI 检查完成后，遗体将被运送至太平间，由尸检技术员提取脑和脊髓组织，随后由实验室成员进行组织处理。

1. 在遗体到达太平间之前完成以下步骤。提前两小时配制3 L的4%多聚甲醛（PFA），并标记用于组织储存的容器和袋子。配制3 L的8% PFA，并将1.5 L的8% PFA稀释为4% PFA。将剩余的8% PFA置于4 °C环境中，留待第二天使用。
2. 前往太平间之前，准备两个运输用冷藏箱，各装入50%容量的干冰（大块干冰敲碎后填入，并加入小颗粒干冰）。
3. 在太平间内，取一个不锈钢容器，加入约一半体积的2-甲基丁烷和干冰混合物，并盖上盖子，以备组织快速冷冻使用。
4. 由尸检技术员取出大脑后，称重并拍照记录。
5. 将任何附着的硬脑膜放入盛有PFA的容器中。
6. 将小脑和脑干与大脑半球分离，并对大脑半球进行拍照。
7. 辨认视神经、视交叉和视束，使用探针和镊子将其分离，并用手术刀切除该结构。
   注意：使用Higgins墨水标记一侧视神经的远端部分以供识别。
8. 沿纵向分离大脑半球，并分别对每个半球进行拍照。
9. 对左侧大脑半球的初级运动皮层（PMC）进行墨汁标记，重新拍照后，将其放入3.3 L的容器中进行长期固定。记录大脑固定的开始时间。
10. 右侧大脑半球的初级运动皮层可选择进行墨汁标记或切除。
    1. 如需切除，首先去除覆盖的脑膜。
    2. 对已标记或已切除的PMC重新拍照。
    3. 若PMC被切除，则将其切成6个等大的片段。
    4. 对每个片段的头端进行墨汁标记。
    5. 将奇数编号的片段放入盛有PFA的容器中进行短期固定。
    6. 将偶数编号的片段进行速冻处理，装入密封冷冻袋后放入冷藏箱#1中。
11. 将右侧大脑半球从前向后切成厚度为1 cm的冠状切片。
    1. 记录肉眼可见的异常情况（如切割伪影、出血、病灶等）。
    2. 将奇数编号的切片放入盛有PFA的容器中进行短期固定。
    3. 将偶数编号的切片进行速冻处理，装入密封冷冻袋中。
    4. 记录大脑固定完成的结束时间。
12. 将脑干从小脑上分离，并放入盛有PFA的容器中进行短期固定。
    1. 沿纵向分离小脑半球。
    2. 将每个小脑半球切成4个厚度相等的矢状切片。
    3. 拍摄内侧和外侧视图照片。
    4. 将左侧小脑半球的切片放入盛有PFA的容器中进行短期固定。
    5. 将右侧小脑半球的切片进行速冻处理，装入密封冷冻袋后放入冷藏箱#1中。
13. 向尸检技术员获取带有神经根的脊髓。
    1. 去除脊髓的硬脊膜，并将硬脊膜存放在盛有PFA的容器中。
    2. 分离左右侧的前根和后根神经。将左侧的前后根神经从脊髓上切断，放入盛有PFA的容器中进行短期固定。
    3. 将右侧的前后根神经从脊髓上切断，进行速冻处理，装入密封冷冻袋后放入冷藏箱#2中。
    4. 拍摄脊髓最尾端20 cm部分的照片。记录腰膨大的位置。
    5. 从尾端向头端方向，将脊髓切成2 cm厚的横断面切片。
    6. 对每一片切片的头端进行墨汁标记。
    7. 将奇数编号的切片放入盛有PFA的容器中进行短期固定。
    8. 将偶数编号的切片进行速冻处理，装入密封冷冻袋后放入冷藏箱#2中。
    9. 记录脊髓固定的开始时间及任何肉眼可见的异常情况。
    10. 拍摄剩余头端部分脊髓的照片。
    11. 记录颈膨大的位置。对剩余脊髓部分重复执行步骤2.13.5–2.13.8。
14. 完成太平间操作后，将冷冻组织放入贴好标签的盒子中，储存于-80 °C冰箱。将固定后的组织 保存在4 °C环境中。
15. 尸检后24小时（第2天），将剩余的8% PFA稀释为4% PFA。
16. 用新稀释的4% PFA更换固定容器中的旧4% PFA溶液。
17. 尸检后60小时，使用戊二醛、PFA、dH₂O和Sorenson缓冲液配制含2.5%戊二醛的4% PFA溶液（配制顺序：0.2 M磷酸盐缓冲液pH 7.4、1% w/v聚乙烯吡咯烷酮、30% w/v蔗糖、30% v/v乙二醇）。
18. 从短期固定容器中移除已使用的4% PFA溶液。
19. 用Sorenson缓冲液冲洗组织，然后将其置于冷冻保护液中（含20%甘油、20% 0.4 M Sorenson缓冲液和0.02%叠氮化钠的dH₂O溶液）。
20. 对短期固定的脑切片、小脑、脑干和运动皮层（如适用）进行拍照。
21. 使用刀片从每个2 cm长的短期固定脊髓切片中切取2 mm厚的横断面切片。
22. 将切片放入2 mL闪烁小瓶中，并加入含2.5%戊二醛的4% PFA溶液至满。
23. 将剩余的大块组织放回原来的20 mL闪烁小瓶中。用Sorenson缓冲液冲洗组织，然后更换为冷冻保护液。

3. 病理学

注意：右半脑的短时间固定切片以及左半脑的长时间固定切片（置于4% PFA中数月）可被切成30 µm厚的切片（称为游离漂浮切片），或包埋于石蜡中并切成12–14 µm厚的切片（称为石蜡包埋切片）。这些切片通常采用蛋白脂质蛋白（PLP）染色以检测脱髓鞘病变，并使用二氨基联苯胺（DAB）法检测主要组织相容性复合物II类（MHC-II）以评估免疫活性。这些实验方案已实现标准化，并已在多项研究中应用^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}。

1. 游离漂浮法（30 µm）DAB-亲和素-生物素复合物（ABC）组织染色
   1. 从冷冻保存液中取出切片，转移至六孔板中，用2 mL 1×磷酸盐缓冲液（pH 7.0，PBS）洗涤3次，每次5分钟。将切片转移至六孔板下一孔时，注意避免撕裂组织。每次洗涤和孵育步骤中，将六孔板置于摇床上，使组织轻轻振荡。
      注意： 在较小体积溶液中孵育并置于较大孔板（即12孔板和24孔板）中的组织切片容易出现表面和边缘撕裂。
   2. 将切片置于含有约30 mL 10 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）的玻璃烧杯中，通过微波加热进行抗原修复。使用画笔轻轻操作，确保组织切片不折叠，微波加热2–3分钟，或直至柠檬酸盐缓冲液开始沸腾。随后让切片冷却至室温（约20分钟）。
   3. 将切片转移回六孔板中，用 2 mL PBS/0.3% Triton X-100 洗涤 3 次，每次 5 分钟。通过将切片在 2 mL 3% H₂O₂ 的甲醇溶液中孵育 30 分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。₂O₂0.3% Triton X-100/PBS，室温（RT）孵育30分钟。
   4. 用 2 mL PBS/0.3% Triton X-100 洗涤切片，每次 5 分钟，共洗 3 次。在 2 mL 3% 正常山羊血清/0.3% Triton X-100/1x PBS 中于室温下封闭切片 1 小时。
   5. 将切片在针对小胶质细胞和髓鞘表位的一抗中孵育过夜至5天（根据抗体而定），以检测炎症（MHCII）和脱髓鞘（PLP）（参见 材料表4 °C下
      注意： 确保在本步骤及后续步骤的孵育过程中切片不发生折叠，否则会导致切片内部某些区域无法着色。
   6. 用 2 mL 1×PBS 洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。随后将切片置于生物素标记的二抗中孵育（参见 材料表室温下孵育1小时。在孵育期间，于下一次洗涤步骤前约45分钟配制亲和素-生物素复合物（ABC）溶液，以使ABC复合物充分形成。
   7. 将切片在2 mL 1×PBS中洗涤3次，每次5分钟。随后在室温下用ABC孵育切片1小时。
   8. 用 2 mL 1×PBS 洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤三次。将切片在含有 H 的过滤 DAB（2 mL/孔/切片）中孵育₂O₂ （30% H₂O₂ 的 1:500 稀释液）₂O₂ 在DAB中显色至适当程度（约3–8分钟）。
   9. 将切片在 2 mL 1x PBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。为增强信号（可选步骤），使用 0.04% OsO₄ 进行锇酸处理₄ （约30秒）。
   10. 将切片在1×PBS中清洗三次，每次5分钟。分别将每个切片从六孔板转移至盛有1×PBS的小容器中，然后将组织切片置于载玻片上 尽可能平整。
   11. 轻轻将载玻片从PBS中取出，同时确保组织切片尽可能保持平整。使用两把画笔轻轻将组织在载玻片上展平并拉直，并用纸巾吸去多余的水分。用甘油（或等效的封片介质）封片，并用透明指甲油密封盖玻片。

4. 石蜡包埋半脑切片：DAB染色

1. 将切片置于 60 °C 烤箱中熔化石蜡 5–10 分钟。
2. 将切片浸入二甲苯中，每次 5 分钟，重复 3 次，以脱蜡。
3. 依次用梯度乙醇（100% 两次，每次 5 分钟；95% 两次，每次 5 分钟；70% 两次，每次 5 分钟；50% 一次，每次 5 分钟）对组织进行水化。用 PBS 覆盖切片。
4. 将切片置于盛有 10 mM 枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）的烧杯中，微波加热进行抗原修复。
5. 待切片冷却至室温后，用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。通过在含 3% H₂O₂/1% Triton-X 100 的 PBS 中孵育 30 分钟，阻断内源性过氧化物酶活性。
6. 用 1× PBS 洗涤组织 3 次，每次 5 分钟。在 PBS 中加入 6% 正常山羊血清，于室温孵育 1 小时以封闭组织。
7. 将切片与一抗（参见材料表）在 PBS 中于室温孵育过夜（最长 20 小时）。
8. 用 1× PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。随后在 PBS 中加入相应二抗（参见材料表），于室温孵育 1 小时。
9. 在下一次洗涤步骤前约 45 分钟，配制 ABC 溶液。
10. 用 1× PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟，然后在 ABC 溶液中于室温孵育 1 小时。
11. 用 1× PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
12. 将切片浸入经滤膜（0.45 µm 滤孔）过滤的 DAB 溶液（含 H₂O₂，即 30% H₂O₂ 按 1:500 比例稀释于 DAB 中），孵育至显色充分（约 3–8 分钟）。
13. 用 1× PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。为增强信号，可使用 0.04% 四氧化锇（OsO₄）处理约 30 秒。
14. 用 1× PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
15. 依次用梯度乙醇脱水：50%（1 次，5 分钟）、70%（1 次，5 分钟）、95%（2 次，每次 5 分钟）、100%（2 次，每次 5 分钟），最后用 100% 二甲苯（1 次，5 分钟）。让二甲苯自然挥发。
16. 使用含甲苯的快速干燥封片介质封片。建议选用含抗氧化剂的封片剂配方，以防止染色褪色。用刀片清除载玻片边缘多余的封片介质，以便后续保存。

5. MRI/病理学相关性

注意：为了将磁共振成像（MRI）与病理学结果进行关联，我们首先对长期固定且完整的脑半球（如上文步骤2.9所述）在可调节的容器中进行离体MRI扫描，容器内含有可被MRI识别的标记物，用于指示切片位置。随后，我们将脑组织进行切片，并对每1 cm的切片进行拍照，以便将原位MRI图像与各脑切片进行共配准。接下来可开展MRI引导下的分析，即在MRI图像上确定感兴趣区域（ROI），以指导后续组织学分析；也可进行组织病理学引导下的分析，即在组织切片上识别感兴趣区域（例如白质病变区、无脱髓鞘的正常白质等），再通过对应位置的MRI测量指标对其进行特征描述 （表1）。

1. 基于 MRI 的感兴趣区域（ROI）识别
   注意：在先前的研究中，我们已在白质^{11,12,13,14,15}和灰质^16,17,18中识别出感兴趣区域。以下示例针对白质分析。
   1. 在原位 MRI（来自步骤 1.1）上分割 T2 高信号病灶，首先由自动算法进行初步处理，随后由经验丰富的操作者手动校正。
   2. 在 T2 病灶内分割 T1 低信号病灶，定义为信号强度小于或等于周围正常表现脑组织信号强度 80% 的体素。
   3. 在磁化转移率（MTR）图上以 80% 阈值分割低信号区域。
   4. 利用上述分割结果创建三类区域：(a) 仅 T2 异常病灶，即在 T2 加权/FLAIR 扫描中异常但在 T1 加权或 MTR 扫描中正常的区域；(b) T2T1MTR 病灶，即在 T2 加权/FLAIR、T1 加权和 MTR 扫描中均异常的区域；(c) 正常表现白质（NAWM），即在 T2 加权/FLAIR、T1 加权和 MTR 扫描中均正常的区域。
      注意：我们选择切片的依据是同一层切片上同时存在三种类型的感兴趣区域（仅 T2、T2T1MTR 和 NAWM）。
   5. 计算每个 ROI 的归一化强度，以最小化因不同大脑及不同脑区位置引起的变异性。
2. 原位 MRI 与脑切片的共配准
   1. 将固定后的大脑半球置于定制切片盒中进行扫描，该切片盒包含四排 MRI 敏感标记物，用于定位可用于插入刀片以切割大脑的槽位。对固定后的大脑及所有标记物进行 1 mm 各向同性分辨率的 T1 加权 3D MPRAGE 成像。
      注意：此步骤称为固定后 MRI，仅作为将原位 MRI 与脑切片进行共配准的中间步骤。
   2. 扫描完成后立即在相距 1 cm 的槽位处切割大脑半球，获得约 15 片脑切片。
   3. 对脑切片的前侧和后侧均进行拍照。
   4. 通过以下步骤将原位 MRI 与脑切片照片进行共配准。
      1. 对固定后和原位 MPRAGE 图像进行分割，首先对固定后和原位 MPRAGE MRI 进行强度非均匀性预处理¹⁹。
         1. 从预处理后的固定后 MPRAGE 图像中分割出大脑和四排标记物。
         2. 从预处理后的原位 MPRAGE 图像中分割出与固定后 MRI 对应的大脑半球^20,21。
      2. 使用 FSL FLIRT²²，通过一系列最多 12 自由度的线性配准过程（仿射配准），对提取出大脑区域的原位和固定后 MRI 进行共配准。其中缩放和剪切分量用于校正固定引起的组织收缩效应。
      3. 利用已分割的标记物，通过最小化最大投影强度之和的方法确定切片平面的法线方向。这些重新定向的角度将被整合到上一步获得的变换矩阵中。
      4. 使用内部开发的图像查看器，通过调整法向量的深度和方向，将 MRI 图像与固定后脑切片的照片进行视觉匹配。由于脑切片过程存在不完美，需进行微小调整。
      5. 对每一片应用 AFFINE 图像变换¹³，将原位 MRI 转换至与脑切片照片相同的切片位置。

结果

如上所述，大脑半球几乎有一半被冷冻保存，可用于DNA、RNA或蛋白质的分子学研究。以往研究表明，使用尸检脑组织的研究结果可能受到生前状况、年龄、性别、组织pH值、mRNA完整性（RIN）、死后间隔时间（PMI）、诊断确定性、合并的物质使用情况以及既往用药治疗状态等因素的影响²³。根据利用脑组织开展的研究，相较于RNA，DNA和蛋白质受这些因素的影响较小。然而根据我们的经验，RNA的提取及其后续分析最受脑组织生前状况和死后间隔时间的影响。因此，我们在此讨论使用尸检获得的多发性硬化（MS）组织进行RNA相关分析时应遵循的一些条件。

在所有研究中，死后采集脑组织后，将其切成1厘米厚的片状，随后一部分用4%多聚甲醛固定以进行形态学研究，另一部分则迅速冷冻用于生化分析。所有组织块均通过上述PLP免疫染色法对脱髓鞘情况进行表征。代表性分析流程见图1。组织切片用于检测白质病变的存在（图1A）。选择特定区域进行免疫活性（图1B）和脱髓鞘（图1C）染色。冷冻组织被置于冷冻切片机上（图1D），切取30 µm厚的冷冻切片。随后收集连续的3至4张切片，与邻近组织分离，并储存用于DNA、RNA或蛋白质的提取。利用该方案，我们已成功分离出DNA^{24, 25}、RNA^5,6,7,8,9以及蛋白质²⁶。尽管本文讨论了部分基于多发性硬化症脑组织RNA分析所得的主要发现，但以下是一些与死后多发性硬化症脑组织RNA分析相关的问题。

图1：用于mRNA分析的样本采集。（A）选择尸检组织进行分析。选定组织区域并切除部分组织。所有切片均使用（B）MHC-II（主要组织相容性复合体II类HLA-DR CR3/43）抗体染色以检测炎症活性，并使用（C）蛋白脂质蛋白（PLP）染色以根据已发表的方案确定髓鞘状态。根据髓鞘状态，用手术刀对组织块进行标记（D）。切割切片（60 µm）（E），将先前标记的区域取出，分装至管中并标记（F）。每切5片后重复进行PLP和MHC-II染色，以确保组织采集准确。正常外观白质（NAWM）被标注，白质病变（WML）以红色标出。请点击此处查看该图的放大版本。

多发性硬化症病灶中的轴突横断¹⁰。本项目最初的研究重点是脱髓鞘白质病灶中细胞成分的特征分析。在定位的抗原中，包括非磷酸化的神经丝蛋白（neurofilaments, NFs）。在有髓鞘的轴突中，大多数神经丝蛋白处于磷酸化状态；而在脱髓鞘发生后，轴突中的神经丝蛋白发生去磷酸化。我们在脱髓鞘轴突中检测到了预期的非磷酸化神经丝蛋白的表达。在急性多发性硬化症病灶中，许多此类脱髓鞘轴突以轴突回缩球（图2A）的形式终止，这反映了被横断轴突的近端。与邻近正常区域相比，急性病灶中横断的轴突数量超过11,000 mm³¹⁰。这些观察结果推动了多发性硬化症研究领域的范式转变，促使学界将神经退行性变视为导致多发性硬化症患者永久性神经功能障碍的主要原因。

图2：炎症性脱髓鞘过程中的轴突横断。 轴突横断发生在炎症性脱髓鞘过程中（A，箭头所示），并导致轴突末端卵圆形结构的形成（A，箭头所示）。定量分析（B）显示，在多发性硬化（MS）病变中横断的轴突数量较多，且似乎与病变的炎性活动程度相关。图A经Trapp等¹⁰许可转载。红色：蛋白脂质蛋白，绿色：抗非磷酸化神经丝蛋白抗体。 请点击此处查看该图的放大版本。

慢性 MS 患者脑组织中的再髓鞘化³。在多发性硬化（MS）的早期阶段，再髓鞘化过程可能较为显著。然而，许多慢性 MS 病灶并未发生再髓鞘化。我们研究了少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的存在或新少突胶质细胞的生成是否限制了慢性脱髓鞘白质病灶的再髓鞘化。尽管 OPC 密度常有所降低，但它们仍存在于所有慢性脱髓鞘病灶中³。在许多慢性 MS 病灶中也检测到新生成的少突胶质细胞。这些少突胶质细胞的突起虽与脱髓鞘的轴突相关联，但并未对其形成髓鞘（图 3）。这些研究表明，OPCs 及其生成新少突胶质细胞的能力并非限制慢性白质病灶再髓鞘化的因素。我们推测，这些长期处于脱髓鞘状态、常表现为营养不良的轴突，对新生成的少突胶质细胞不具备接受性。

图3：与轴突相关的前髓鞘少突胶质细胞的突起过程。 显示了用PLP抗体（图A、B中红色）和神经丝抗体（图A、B中绿色）染色的多发性硬化（MS）病灶的共聚焦显微图像。在慢性MS病灶中，一个位于侧脑室下区（SVZ）的前髓鞘少突胶质细胞（图A中红色）将其突起延伸至脱髓鞘轴突区域（图A中绿色）。这些突起中的许多（图A中箭头所示）围绕轴突呈螺旋状缠绕，高倍放大图像中可见此结构（图B）。标尺分别为20 µm（A）和5 µm（B）。经许可转载自Chang等³。 请点击此处查看该图的放大版本。

多发性硬化症中的线粒体功能障碍⁶。我们对慢性多发性硬化症患者获取的快速冷冻运动皮层组织进行了无偏倚的神经元基因变化筛查（图4A）。对该数据集的无偏倚分析发现，多发性硬化症患者中23种由细胞核编码的线粒体mRNA显著减少（图4B）。通过免疫细胞化学和原位杂交进行的验证研究表明，这些基因在皮层投射神经元中高度富集（图4C），且从投射轴突中分离出的线粒体表现出糖酵解能力下降（图4D）。该论文推动了将线粒体功能障碍和ATP生成减少视为多发性硬化症中轴突变性主要因素的研究方向。

图 4：在多发性硬化症运动皮层中进行的微阵列数据分析及下游验证技术。 （A）对照组（C1–C6）和继发进展型多发性硬化症（SPMS）（MS1–MS6）运动皮层样本中显著改变的转录本的层次聚类分析，分别支持与疾病相关的基因表达模式。在多发性硬化症运动皮层中下调的转录本中，有26个属于电子传递链（B）。与对照组（CI）相比，多发性硬化症运动皮层神经元中的线粒体复合物I（NDUFA6）mRNA水平降低（n = 55–130）（CII），而对照组（CIII）与多发性硬化症（CIV）大脑皮层之间的PLP mRNA密度相似。多发性硬化症患者（n = 3）运动皮层线粒体富集组分中电子传递链复合物I和III的活性降低（D）。经Dutta等⁶许可转载。误差条表示标准误（SEM）；CI–IV中的比例尺为25 µm。* p < 0.05，采用Student's t-检验。 请点击此处查看该图的放大版本。

多发性硬化症中认知功能障碍的发病机制⁸。40%至60%的多发性硬化症患者出现认知功能下降和执行功能减退。我们发现海马体（记忆和学习的功能区域）是多发性硬化症中脱髓鞘的常见部位。随后，我们比较了髓鞘化与脱髓鞘海马体中的神经元基因表达，发现编码与记忆/学习相关蛋白的神经元mRNA显著减少。我们进一步发现脱髓鞘海马体中某些microRNA表达升高，并且这些microRNA可降低谷氨酸受体的表达，从而扩展了上述结果。我们在啮齿类动物模型中重现并拓展了这些观察结果。接着，我们再次比较了髓鞘化与脱髓鞘海马体中的神经元基因表达，发现编码与记忆/学习相关蛋白的神经元mRNA显著减少。

图 5：多发性硬化症患者海马组织的采集、组织学分析及基因表达研究。 在尸检过程中选取包含海马的脑切片（A），并切除海马及其邻近区域（红框），用于进一步分析。PLP 免疫染色显示，所有对照组（B）以及 40% 的多发性硬化症（MS）海马组织（C）中髓鞘得以保留。约 60% 的 MS 海马组织中检测到广泛的脱髓鞘现象（D）。与对照组海马组织（E、G、I）相比，在脱髓鞘的 MS 海马组织的 CA1、CA3 和 CA4 区域中未检测到明显的神经元丢失（F、H、J），此结果由 HuR 免疫组织化学染色证实。髓鞘（髓鞘碱性蛋白（MBP），绿色）与轴突（SMI32，红色）的双标免疫荧光染色显示，在 MS 脱髓鞘海马组织中，髓鞘明显丢失（L），而轴突相对保留（N），相比之下，对照组海马组织中 MBP（K）和 SMI32（M）染色均完整。基于髓鞘状态（有髓鞘与脱髓鞘）和解剖位置（海马 vs. 运动皮层）对 mRNA 表达水平进行双重聚类分析，将样本划分为不同的聚类群（O）。高 mRNA 表达水平以红色表示，蓝色表示低表达水平。图 C-O 改编自 Dutta 等人⁸，经许可使用。B-D：2 mm；E-J：100 µm；K-N：50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

MRI变化的病理学相关性¹²。尽管MRI是多发性硬化（MS）诊断、治疗反应评估以及疾病进展预测的重要指标，但MRI变化所对应的病理学基础仍不明确。我们的尸检MRI研究聚焦于两个MRI感兴趣区域（ROI）：仅表现为T2高信号（T2 only）的脑白质ROI，以及同时具有T1低信号、T2高信号和磁化转移率（MTR）降低（T2T1MTR）的ROI。约45%的脑白质T2-only ROI区域仍存在髓鞘，证实其非特异性本质。相比之下，83%的T2T1MTR ROI区域表现为慢性脱髓鞘，并呈现为“黑洞”样改变。T1和MTR值为半定量指标，在T2T1MTR ROI中其数值存在广泛变异。如果髓鞘丢失是导致这些MRI变化的唯一因素，则这些数值应保持恒定。肿胀的脱髓鞘轴突与T1和MTR值均存在相关性。

图6：磁化转移比（MTR）和T1对比度比值与慢性MS病灶中Na⁺/K⁺ ATP酶阳性轴突百分比呈线性相关。慢性脱髓鞘病灶经Na⁺/K⁺ ATP酶染色（绿色）显示，其在神经丝蛋白（红色）中的阳性比例从接近100%（A）到零（B）不等。许多缺乏Na⁺/K⁺ ATP酶的轴突直径增大（B）。在慢性脱髓鞘MS病灶中，Na⁺/K⁺ ATP酶阳性轴突百分比与死后定量MTR值（p < 0.0001，C）和T1对比度比值（p < 0.0006，D）呈显著相关。每个数据点来自单个病灶，每种独特的颜色-符号组合代表一个被研究的大脑。比例尺 = 5 µm。经许可转载自Young等¹²。 请点击此处查看该图的放大版本。

与脱髓鞘无关的神经变性¹¹。传统上认为，多发性硬化症（MS）中的神经变性是由脱髓鞘引起的。然而，脑成像研究提出了神经变性与脱髓鞘可能为独立事件的可能性。我们近期鉴定出一类MS患者亚群，其脊髓和大脑皮层存在脱髓鞘，但脑白质未发生脱髓鞘。我们将这种MS亚型命名为髓皮质型MS（myelocortical MS, MCMS）。MCMS病例为研究脑白质脱髓鞘与皮层神经元丢失之间的关系提供了平台。与对照组皮层相比，MCMS皮层的神经元丢失程度显著高于典型MS皮层。对照脑组织来自克利夫兰诊所病理科。本研究首次提供了在无脱髓鞘情况下发生神经变性的病理学证据。

图7：在无脑白质脱髓鞘的情况下出现的神经元丢失。 来自被归类为典型多发性硬化症（MS）个体的一个焦油紫（cresyl violet）染色的半球冠状切面（A）。在标记的五个区域中，分别比较了皮层第III、V和VI层的神经元密度。面积大于60 µm²的神经元（黄色）在颞上皮层的一个代表性图像中显示（B）。典型MS个体（C）和髓皮质型MS个体（D）半球切面中PLP染色及脱髓鞘病灶分布情况（白质脱髓鞘以蓝色高亮显示；软脑膜下脱髓鞘以粉色高亮显示）也一并展示。在典型MS中发现皮层神经元密度降低与脑白质病灶体积增加之间存在显著相关性，但在髓皮质型MS中未发现此相关性（E）；虚线表示95%置信区间（CI）。IFG = 额下回。STG = 颞上回。INi = 岛叶下部。INs = 岛叶上部。CG = 扣带回。经许可转载自Trapp等¹¹。 请点击此处查看该图的放大版本。

序列时长	序列描述	序列用途
0:09	定位像	为后续序列提供定位参考
9:14	三维磁化准备快速梯度回波（MPRAGE）	结构成像，用于脑结构的体积估算
5:14	三维液体衰减反转恢复（FLAIR）	病灶识别、病灶分割、病灶体积评估
2:35	二维T2加权成像	病灶识别、病灶分割、病灶体积评估
5:12	带磁化传递预脉冲的三维梯度回波成像（MT-ON）	用于评估正常表现脑组织及病灶组织中髓鞘含量的指标
5:12	不带磁化传递预脉冲的三维梯度回波成像（MT-OFF）
0:27	弥散张量成像（DTI）场图	反映脑组织完整性的水分子弥散测量指标
10:27	弥散张量成像（DTI）多壳层成像
1:18	弥散张量成像（DTI）多壳层成像
39:48:00	小计：核心序列

表1：死后影像学检查方案。

讨论

我们描述了一种已用于快速获取和处理超过150名多发性硬化（MS）患者组织的实验方案。该方案的一个重要特点是，使用组织的研究人员同时负责制定方案并执行组织采集工作，从而为满足各个研究项目的科学需求提供了灵活性。本方案的多个方面增强了其应用价值：患者在死亡前通常已得到充分的临床表征，其中许多人长期由本中心的神经科医生随访观察。关键步骤是在患者死亡后尽快处理组织捐献样本，这使得冷冻组织的质量优于其他一些脑组织库。高质量的组织样本支持开展具有重要价值的分子生物学研究，用于描述转录和翻译水平基因产物的变化，这对于证实组织学和免疫细胞化学观察结果至关重要。通过在多个病例中整合形态学/免疫细胞化学数据与分子数据，可显著提高研究结论的可靠性。这一点在我们对大脑皮层线粒体基因变化以及脱髓鞘海马区神经元基因变化的研究描述中得到了充分体现。目前，新型基因表达谱分析技术正在迅速发展，而本组织库中保存的冷冻组织应能为组织水平及单细胞水平的分析提供高质量的RNA。

本方案的另一个重要优势在于制备短固定脑切片。这些组织被切成30 µm厚的游离切片。此类切片非常适合利用共聚焦显微镜对三维空间中的两种或多种抗原进行分析。典型的例子包括慢性多发性硬化（MS）病灶中前髓鞘少突胶质细胞突起与营养不良性轴突之间的相互作用，以及单根轴突与横断轴突回缩球之间的连接关系的鉴定。这与常规使用的7 µm厚石蜡切片形成鲜明对比，后者无法实现三维成像。然而，石蜡包埋组织在某些研究问题上具有重要价值，特别是用于半脑7 µm厚切片中神经元密度的定量分析。因此，我们的组织处理方案具有多样性，能够灵活确保获得固定良好且快速冷冻的组织样本。

本方案的另一个独特之处在于死后原位脑部磁共振成像（MRI）。脑部MRI是多发性硬化症（MS）疾病不可替代的生物标志物。因此，明确异常MRI信号所对应的病理学基础至关重要。我们的研究证实，仅在T2加权像上显示异常的区域（T2 only）以及在T2、T1和磁化传递率（MTR）上均显示异常的区域（T2T1MTR ROI）常常仍存在髓鞘。该发现提示，亟需开发更为特异的影像学方法，以可靠地区分脑白质中髓鞘化与脱髓鞘区域。MRI对髓鞘的检测具有较高的敏感性，但我们的研究表明，即使联合使用T1、T2和MTR成像，仍不足以特异性识别髓鞘化状态。我们的死后研究方案为评估新型影像技术区分脑白质髓鞘化与脱髓鞘的能力提供了理想平台。此外，鉴于MRI在转化研究中的应用及其在活体患者中的广泛临床使用，MRI也为基础科学研究成果向临床实践的转化提供了理想途径。

尽管制备短期和长期固定的以及冷冻的脑片有助于以多种模式处理组织以用于不同的研究，但该方法仍存在一些局限性。由于相邻切片上的组织部分可能经过不同的处理，因此对某一结构整体的评估可能会受到限制。然而，庞大的组织库容量使得能够在多个受试者中对感兴趣结构进行研究，从而改善取样。另一个使用尸检组织的研究普遍存在的局限性是其横断面性质。关于变化的时间和进展的结论必须在此背景下加以解释。捐献组织的患者可能存在选择偏倚，这可能限制研究结果向所有多发性硬化（MS）患者群体的推广。由于大多数捐献者死于晚期MS的并发症，因此将这些患者的发现外推至MS早期阶段的患者可能并不恰当。尽管如此，我们已收到来自因非MS相关原因死亡的较年轻患者的组织（例如急性心肌梗死、药物过量、自杀）。本方案的范围不包括已被证实与MS相关的其他器官（如胃肠道和骨髓）的取样。我们认为，该项目的优势远超过其局限性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体
生物素标记的山羊抗小鼠IgG	Vector Laboratories	BA-9200	半脑切片稀释比例为1:500；30µm游离切片稀释比例为1:1,000。 RRID: AB_2336171
生物素标记的山羊抗兔IgG	Vector Laboratories	BA-1000	稀释比例为1:500。
生物素标记的山羊抗大鼠IgG	Vector Laboratories	BA-9400	半脑切片稀释比例为1:500；30µm游离切片稀释比例为1:1,000。 RRID: AB_2336208
胶质纤维酸性蛋白（GFAP）	Dako	Z0334	半脑切片稀释比例为1:700。 RRID: AB_10013382
HuR，小鼠IgG，3A2克隆	Santa Cruz	SC-5261	30µm游离切片稀释比例为1:500。 RRID: AB_627770
主要组织相容性复合体（MHC）II类HLA-DR CR3/43	Dako	Mo746	半脑切片稀释比例为1:250；30 µm游离切片稀释比例为1:500。 RRID: AB_2313661
非磷酸化神经丝蛋白（SMI32）	Biolegend	801701	半脑切片稀释比例为1:5,000；30 µm游离切片稀释比例为1:2,500。 RRID: AB_2564642
磷酸化神经丝蛋白（SMI31）	Biolegend	801601	半脑切片稀释比例为1:5,000；30 µm游离切片稀释比例为1:2,500。 RRID: AB_2564641
蛋白脂质蛋白（PLP）	由Wendy Macklin惠赠		免疫组化稀释比例为1:250；亦可使用市售的其他抗PLP抗体。
试剂
125 mm滤纸	Whatman	1452-125	用于过滤PFA溶液。
50% 戊二醛	Electron Microscopy Sciences	16320	电子显微镜级。
Cytoseal	ThermoScientific	8310-16
乙二醇	Fisher Chemical	BP230-4
甘油	Sigma-Aldrich	G7893	400 mL/2 L 冷冻保护液。
Millex-HV 注射器滤器，0.45 µm，PVDF，33 mm，γ射线灭菌	Millipore-Sigma	SLHV033RB
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	19200	颗粒状。
聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）	Fisher Chemical	BP220-212
叠氮化钠	Fisher Chemical	S227I	2 g/2 L Sorenson缓冲液。
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S0876	98.8 g/2 L Sorenson缓冲液。
磷酸二氢钠一水合物	Sigma-Aldrich	S9638	14.352 g/2 L Sorenson缓冲液。
蔗糖	Sigma-Aldrich	PVP40-500G
VectaStain ABC试剂盒	Vector Laboratories	PK-6100	A液和B液均稀释1:1,000。 RRID: AB_2336819
防水绘图黑色墨水	Higgins	44201
二甲苯	Fisher Chemical	X3S	组织学级。
设备
3T MRI Magnetom Prisma	Siemens Healthineers
7T MRI Agilent 830AS	Siemens Healthineers