在小鼠中诱导根尖周炎

摘要

本文介绍了一种在小鼠中局部诱导根尖周炎的实验方案。我们展示了如何在小鼠牙齿上钻孔并暴露其牙髓，以引发局部炎症。同时演示了用于研究该炎症性质的分析方法，如显微CT和组织学分析。

摘要

局部诱导性炎症所涉及的机制可通过多种现有的动物模型进行研究，其中之一是诱导根尖周炎（AP）。根尖周炎是一种常见炎症性病理，发生于牙根周围牙周组织中。为了更好地理解该疾病的性质与机制，在小鼠体内实施该操作具有显著优势。这种牙源性炎症的诱导方法是通过钻开小鼠牙齿直至暴露牙髓。随后，牙髓保持开放状态，随时间推移被口腔天然菌群污染，从而引发根尖周炎。经过一定时间后，处死动物，可对牙齿及下颌骨进行多种方式的分析。典型分析方法包括显微CT成像（用于评估骨吸收）、组织学染色、免疫组织化学以及RNA表达分析。该实验方案对于口腔生物学领域的研究具有重要价值，可在条件一致的活体实验环境中更深入地理解这一炎症过程。该操作需要对小鼠及分离的下颌骨进行精细处理，而对该技术的可视化演示尤为有益。本文全面展示了在小鼠模型中诱导根尖周炎及其表征的全部技术操作步骤。

引言

本方法的目的是通过用天然微生物群污染小鼠根尖，诱导根尖周炎，并进一步研究该病理过程的多种特征。

根尖周炎（AP）是一种发生于牙根周围牙周组织的常见炎症性病变。这种牙科疾病可引起剧烈疼痛，必须由牙医进行治疗。治疗方案包括根管治疗（初次或再次）、牙髓外科手术、拔牙或根据临床和影像学检查结果以及临床医生的判断进行随访观察。尽管该炎症过程已研究数十年^1,2,3，但其机制仍未被全面阐明。鉴于该疾病的严重性，显然有必要开展针对其基本性质的研究。因此，能够用于研究AP的系统具有重要的科学意义。

由于根尖周炎（AP）是一种涉及局部组织和免疫系统的复杂病理过程，体外研究不足以全面理解该疾病的发生机制。临床样本的研究也存在困难，主要受限于伦理问题以及不同个体和不同临床阶段之间的显著差异^4,5，因此需要建立体内模型。这些模型基于将牙髓暴露于污染环境，并观察机体在根尖周组织对该刺激产生的炎症反应这一理念^6,7。常用的体内模型包括....

方案

本研究所述所有方法均已获得希伯来大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准（伦理编号：MD-17-15093-5）。

1. 动物麻醉与体位固定

1. 按以下说明制备无菌溶液。
   1. 配制5 mL浓度为7 mg/mL的氯胺酮和0.09 mg/mL的美托咪定，用磷酸盐缓冲液（PBS）/生理盐水稀释。 
   2. 在 PBS/生理盐水 中稀释阿替美唑，配制浓度为 0.4 mg/mL 的无菌溶液（建议配制 5 mL 量）。
   3. 用 PBS/生理盐水稀释甲哌卡因（7.5 mg/mL）制备无菌溶液，用于局部麻醉（一支提供的甲哌卡因试剂足以配制 7.2 mL 储存液）。
2. 使用6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠进行实验。将动物饲养于特定病原体阴性（SPF）级动物房，由实验设施提供标准饲料和饮水，自由进食和饮水。
3. 称重小鼠，并按每克体重10 µL的体积进行腹腔注射。例如，对于一只体重20克的小鼠，
   注射200 µL的氯胺酮/美托咪啶溶液，终浓度为（70 mg/kg）氯胺酮和（0.9 mg/kg）美托咪啶
   每只动物。
4. 为防止实验过程中因干燥导致动物角膜溃疡，应在动物麻醉期间将其眼睛涂抹含氯霉素（5%）的眼膏。使用光源保持麻醉状态下动物的体温。通过检查足底反射（用力捏压脚趾）来评估麻醉深度。
....

结果

实验步骤的流程图见图1。如实验方案所述，对小鼠进行麻醉后，将其一侧下颌第一磨牙钻开至牙髓暴露，而对侧牙齿则作为对照保留。随后，牙齿暴露于口腔菌群污染环境中42天，在此期间对小鼠进行监测并给予镇痛药物。42天后，处死小鼠，取牙齿及邻近颌骨组织用于分析。

图2展示了小鼠右侧第一磨牙牙髓暴露后下颌的临床图像。图2A显示了整个下颌骨，而图2B的插图则放大显示了经处理的右侧第一磨牙。左侧第一磨牙作为对照。在图2B中可见近中和远中牙髓角以及根管入口均暴露。请注意，为了减轻疼痛，该牙齿已通过机械方式降低至咬合下位置。

讨论

本文介绍了一种在小鼠中诱导根尖周炎的方法。该方法的目的是利用根尖周炎这一病理状态，研究此炎症过程的机制及其后果。实验在6-8周龄的小鼠中诱导根尖周炎，此年龄段小鼠的牙根已完全发育²⁴。为在该模型中诱发根尖周炎，需使用牙科钻暴露小鼠下颌磨牙的牙髓。来自小鼠口腔菌群（在SPF条件下）的细菌侵入牙髓及根管，导致牙髓坏死，并向根尖组织释放脂多糖（LPS），从而引发根尖部位的炎症反应。

进行该操作时，需注意以下几个关键步骤。在牙髓暴露过程中，动物体位的正确放置对该操作的成功至关重要。一个关键步骤是牙髓的充分暴露。根管暴露不足可能导致修复性牙本质桥的形成，从而导致操作失败，并无法成功建立牙髓穿孔（AP）。在牙髓暴露过程中，应注意尽量减少对软组织的损伤，以避免在其他区域引起不必要的疼痛和炎症，进而产生副作用。在微计算机断层扫描（micro-CT）分析软件中对样本进行正确对齐，对于获得可解读的结果至关重要。在准备颌骨组织进行组织学处理时，建议剥离骨组织周围附着的软组织，以便在制备组织学包埋模具时实现正确的取向。在整个操作过程.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸阿替美唑	Eurovet Animal Health	CAS 104075-48-1
ATR	dentsply	tecnika
包埋机	Leica	EG1150H
布托啡诺	vetmarket	163451
临床显微镜/双目	Olympus	Sz61
牙科车针	Komet dental	ZR8801L 315 008
牙科刮匙	Premier	1003737
EDTA	J.T Baker	8993
Entelan	mercury	1.07961
伊红Y醇溶液	SIGMA	HT110116
迈耶氏苏木精溶液	SIGMA	MHS 16
盐酸氯胺酮	Vetoquinol	CAS 1867-669
盐酸美托咪啶（Cepetor）	CP-pharma GmbH	CAS 86347-15-1
3% 盐酸甲哌卡因	Teva	CAS 96-88-8
微刷—可调节精密涂布器	PARKELL	S379
微型CT扫描仪	scanco	uCT 40
石蜡	Leica	39602004
PBS	SIGMA	D8537
PFA	EMS	15710
氯霉素眼膏（5%）	Rekah pharmaceutical	CAS 56-75-7
镊子	WAM	Ref-CT
赛拉嗪	Eurovet Animal Health	CAS 7361-61-7
二甲苯	Gadot	CAS 1330-20-7