诱导小鼠的牙周炎

摘要

在这里,我们提出一个协议,本地诱导小鼠的牙周炎。我们展示如何在老鼠的牙齿上钻一个洞,并暴露它的果肉,以引起局部炎症。研究这种炎症性质的分析方法,如微CT和成体学,也进行了演示。

摘要

局部诱发炎症的机制可以使用几种可用的动物模型进行研究。其中之一是诱导性牙周炎(AP)。牙周炎是牙根周围牙周组织中炎症性的常见病理学。为了更好地了解这种病理学的性质和机制,在小鼠身上进行手术是有利的。这种牙原性炎症的诱导是通过钻入小鼠牙齿,直到牙髓暴露。其次,牙髓仍然暴露在自然口腔菌群污染随着时间的推移,导致牙周炎。在此时间段之后,动物被牺牲,牙齿和颌骨可以以各种方式进行分析。典型分析包括微CT成像(评估骨吸收)、组织染色、免疫组织化学和RNA表达。该协议可用于口腔生物学领域的研究,以更好地了解在具有统一条件的体内实验环境中的炎症过程。该过程需要仔细处理小鼠和孤立的下颚,并且该技术的视觉演示是有用的。演示了导致诱发性牙周炎的程序的所有技术方面及其在小鼠模型中的特性。

引言

该方法的目的是通过污染自然微生物群的顶点来诱导小鼠的牙周炎,然后研究这种病理过程的各种特征。

牙周炎 (AP) 是牙根周围牙周组织中炎症性质的常见病理学。这种牙科疾病可引起剧烈疼痛,必须由牙医治疗。治疗方案包括根管治疗(初级或二级),内淋手术,牙齿提取,或后续取决于临床和放射学发现,以及临床医生的意见。这个炎症过程的机制,虽然研究了几十年1,2,3,仍然没有全面理解。考虑到这种病理学的严重性,因此显然需要研究解决其基本性质的问题。因此,研究AP的系统具有极大的科学意义。

由于AP是一个复杂的病理过程,涉及局部组织和免疫系统,体外研究不足以完全理解过程。由于不同人和不同临床阶段4、5之间的伦理限制和显著变异性,以及因此体内模型的必要性,对这种疾病的临床样本的研究也是有问题的。这些模型是基于将牙髓暴露在污染中的概念,并观察身体对围周组织6、7中这种刺激的炎症反应。常见的体内模型包括啮齿动物或较大的动物,如狗。尽管在治疗具有微型牙齿的非常小的动物小鼠方面面临临床挑战,但小鼠模型的优势是显著的:实际上,与小鼠合作在技术上是简单的设施,而且最具成本效益,在科学上,小鼠是一个研究良好的动物模型,具有现成的遗传和分子工具以及经过深入研究的基因组。事实上,以前的研究使用小鼠模型来研究炎症和骨吸收信号和细胞参与的性月经炎8,9,10,11。因此,需要一个明确的协议,如何使用鼠标模型来研究AP。在这里,我们描述这样的协议。

这里描述的方案有一个很大的优势,是适当的研究淘汰(KO)小鼠,并了解缺乏特定基因如何影响牙齿炎症7,12。该协议的其他有用应用包括研究药物和系统条件对杏齿性牙周炎13的发展的影响,杏齿性牙周炎对下颌骨瘤发展^{的影响14,15}和干细胞治疗骨^再生16。

该协议也可以概括为研究局部炎症的模型。为了研究炎症过程,已经开发出几种小鼠模型,其中包括例如诱发结肠炎或关节炎17,18。这些模型具有系统效应,并且在同一动物中没有内置控制。诱导性牙周炎的模型,包括无炎症的反向控制,具有克服这些限制^{的优势14,19。}

因此,下面描述的协议对于对局部炎症过程感兴趣的研究人员很有用。这种炎症的控制性质,其限制在一个特定的位置,和反向控制牙齿,都使得这个协议有价值的研究在这个过程中所涉及的机制。此外,该协议对对围周炎症的临床方面感兴趣的研究人员是有用的。小鼠模型是研究疾病的不同变量的理想选择,此外,在小鼠模型中能够轻松执行基因操作,以研究特定基因在围周炎症中的活性。

从技术上讲,由于小鼠牙齿尺寸小,临床程序难以进行。将此过程可视化,以便了解定位、所需设备和性能,将是有益的。

方案

此处描述的所有方法均已获得希伯来大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准(伦理 No.MD-17-15093-5)。

1. 动物麻醉和定位

1. 准备无菌溶液,如下所述。
   1. 在磷酸盐缓冲液(PBS)/盐碱中稀释5mL7mg/mL氯胺酮和0.09mg/mL麦地明。
   2. 在PBS/盐水中制备无菌的阿提帕美酮(0.4mg/mL)溶液(建议制备5 mL)。
   3. 准备在PBS/盐水中稀释的米皮瓦辛(7.5mg/mL)无菌溶液,用于局部麻醉(一个供应的米皮瓦辛小瓶足以储存7.2 mL)。
2. 在实验中使用6-8周大的雌性C57BL/6小鼠。将动物保存在特定的无病原体 (SPF) 动物单元中,并配备设施提供的标准水和食物,以及动物喂养设施。
3. 称量小鼠,并在腹内(IP)中注入每克重量的体积为10μL。例如,对于重 20 克的鼠标,
   注射200μL的氯胺酮/麦地明溶液。这将给出最终浓度(70毫克/千克)氯胺酮和(0.9毫克/千克)麦地明
   每只动物。
4. 为了防止手术过程中因干燥导致眼溃疡,应用含有氯霉素的眼膏(5%)在动物的眼睛,而他们在麻醉。麻醉时用灯使动物保持温暖。通过检查踏板反射(执行坚定的脚趾捏合)检查麻醉深度。
5. 对鼠标进行麻醉后,将鼠标放在右侧(对于右手研究人员)上闭合细胞挤出的聚苯乙烯泡沫表面,并使用胶带将脚固定在表面。
6. 在切口周围使用小橡皮筋(1个用于上切口,1个用于下切口)打开嘴,用固定在闭合细胞挤出聚苯乙烯泡沫表面的长针固定到位。
7. 使用贴在表面上的钳子缩回右脸颊。使用处于稳定状态的钳子。
8. 使用适当的放大倍率(双目显微镜或临床显微镜)和光线,将鼠标放在舒适的工作位置,以便进入软膜摩尔。
9. 使用钳子或牙铲缩回舌头,用27量计针将局部麻醉注射到粘膜褶皱中,靠近第一个眼膜。25-50 μL 就足够了。注射部位周围组织的肿胀应可视化。

2. 纸浆暴露

1. 以每分钟 800 发的速度 (rpm) 使用 1/4 圆形齿毛刺或相同尺寸的金刚石毛刺(建议使用长柄),并连接到任何合适的牙科电机(例如自动扭矩降低 (ATR) 电机)。
2. 钻到第一个右颌面摩尔的咬合部分,直到纸浆角通过牙本质可见。使用电机的短爆裂,以防止区域过热。
3. 使用 K-文件或 H 文件#8或#10通过打破覆盖它们的牙本质来刺穿纸浆并将文件插入纸浆角(中端和远端)。文件通过高压灭菌器消毒。
4. 继续尽可能深入地处理纸浆内的文件,同时扩大文件的开口。通常会有从纸浆可见的出血。
5. 确保用毛刺将牙齿的锋利边缘圆润,并将牙齿从遮挡中去除,以减少实验期间的疼痛。在手术过程中用微刷清洁碎屑。
6. 将反向牙齿(左第一个颌面摩尔)作为对照。

3. 临床程序结束

1. 将鼠标从固定状态释放,并注射阿提帕美酮 IP(每克体重为 10 μL)。这将给最终剂量(4毫克/千克)阿提帕美酮。
2. 在PBS/盐水(0.05毫克/千克)IP中注射丁丙诺啡稀释剂(建议在手术当天制备3 mL)。有关为什么需要缓解疼痛,请参阅讨论。
3. 在离开它们之前,确保动物从麻醉中恢复过来。给他们软的食物,因为他们可能无法吃硬的食物,由于牙齿疼痛。

4. 后程序跟进(42天)

1. 在手术后的前3天,称量动物,每天注射一次布丙诺啡(0.1毫克/千克)IP(建议准备6mL)。
2. 在实验期间(炎症积累42天)每周2-3次,按体重和一般行为评估监测动物。
3. 在后续期间,向动物提供软食物。用水把食物弄湿,放在笼子地板上的培养皿里。

5. 实验终止和分析

1. 当42^天11次随访完成时,用氯胺酮/乙酰胺对动物IP进行麻醉,浓度为106.25毫克/千克氯胺酮,75毫克/千克西拉津(A种溶液42.5毫克/mL氯胺酮,1.5毫克/mL西拉辛,总体积为2 mL推荐)和预制宫颈脱位。
   注:有不同的可能分析选项,以评估炎症20,21。本文将介绍通过微CT组织分析和组织染色。
2. 安乐死后,使用手术剪刀和钳子切出部分下巴,包括3摩尔(分别用于每侧处理和未经治疗的对照)。通过使用钳子剥离尽可能多的软组织,留下大部分骨头和牙齿的样品。
3. 在PBS中短暂冲洗组织,然后将其放入甲醛(PFA)4%(在PBS中稀释)24-48小时进行固定。
   注意:在化学罩中使用 PFA,并根据其材料安全数据表 (MSDS) 指南。
4. 24-48 小时后,用 PBS 3x 冲洗,以冲洗 PFA。
5. 微型CT
   1. 对于微型CT分析,将收获的纸巾(包括3个摩尔的一部分,尺寸约为4毫米x5毫米x1毫米)放入微型CT扫描仪,将它们放入一个直径为12毫米的管子中,填充1.5 mL的PBS,使薄片或语言表面 牙齿和根部平行于管底。用海绵在样品之间分离,用柔性薄膜盖住管的顶部。
   2. 打开扫描面板并选择测量编号。选择具有以下参数的控制文件:能量为 70 kV、强度为 114 μA、分辨率为 6 μm³体素大小。
   3. 单击Scout视图,当图像出现时,单击参考线并标记样本区域以进行扫描。每次示例单击后添加扫描。标记完示例后,转到任务列表并选择开始交互任务。
      注:相同的样本随后可用于动物学。重要的是,在CT扫描期间,它们不要干燥。
6. 使用适当的计算机程序进行微型 CT 校准和分析。
   1. 在微CT评估中打开XY平面上的样本。在每个样本上选择三个点进行对齐:
      微锥形收缩 - 定义坐标系的原点。
      美的运河的日冕部分 - 定义 Z 轴上的点。
      远端锥形收缩 - 定义 XZ 平面上的点。
   2. 使用左侧面板上的测量工具,并绘制一条到达每个点的线。用 X、Y 和 Z 值定义三个点中的每一个点,因为它出现在右侧面板中。
   3. 通过在_CT 评估下选择任务来定义样本中感兴趣的区域,然后单击3D评估。屏幕上将显示一个矩形和一个窗口,每个轴的尺寸。通过单击鼠标的中间按钮在角中单击,匹配矩形的尺寸以适合 XY 轴上的兴趣区域。通过在VOI 开始下的 Z 方块中插入第一个感兴趣切片数,以及从第一个切片到"Dim "下 Z 平方中最后一个感兴趣切片数的切片数,选择 Z 轴中的维度。
   4. 单击会话管理器下的应用程序,然后选择DECterm。等待几秒钟,打开窗口,然后键入以下说明描述的倾斜脚本的五个步骤(在行之间单击输入):
      Ipl
      isq_to_aim
      目的1
   5. 复制 isq(感兴趣的文件)名称:在会话管理器下选择视图,然后单击microCTdata。查找正在处理的文件,中间单击该文件。然后,中间单击 DECterm 的窗口。
   6. 输入在选择感兴趣区域时在VOI下确定的 X、Y 和 Z 值(它们之间有一个空格)。
   7. 输入 X、Y 和 Z 值(它们之间有一个空格),这些值在选择感兴趣区域时在暗点下确定。
   8. 等待,直到收到消息:isq目标完成。
      (步骤二- 对齐):
      对齐 z
      目的1
      目的2
   9. 输入为坐标系原点确定的 X、Y 和 Z 值(它们之间有一个空格)。
   10. 输入为 z 轴上的点确定的 X、Y 和 Z 值(它们之间有一个空格)。
   11. 输入为 XZ 平面上的点确定的 X、Y 和 Z 值(它们之间有一个空格)。
   12. 等待,直到收到消息:"对齐_Z 已完成"
       (步骤三- 标题):
       头
       目的2
       0 0 0
       0 0 0
   13. 单击"输入"。
       (步骤四- 将文件从目标转换回isq):
       托isq
       目的2
   14. 复制 isq(感兴趣的文件)名称:在会话管理器下选择视图,然后单击microCT 数据。找到正在处理的文件,中间单击该文件。然后,中间单击 DECterm 的窗口。擦除(使用"回用空间")的".ISQ"在文件末尾,并写:"\new。ISQ"以识别对齐的文件。
   15. 单击"输入|输入。
   16. 等待,直到收到消息:"toisq_从_aim完成"
       (步骤 V- 翻转):
       Isq
       a
   17. 复制新的 isq(感兴趣的文件)名称:在会话管理器下选择视图,然后单击microCT 数据。查找正在处理的文件,中间单击该文件。然后,中间单击 DECterm 的窗口。
   18. 单击"输入|输入。等待接收消息:"isq_to_aim 已完成"
       翻转
       a
       机 管 局
       Zx
       等待接收消息:"翻转完成"
       从
       机 管 局
   19. 复制新的 isq 名称:在会话管理器下选择视图,然后单击microCT 数据。查找正在处理的文件,中间单击该文件。然后,中间单击 DECterm 的窗口。擦除(使用"回用空间")的".ISQ"在文件末尾,并写:"_翻转。ISQ"以识别对齐的文件。
   20. 等待,直到收到消息:"从 _aim_to_isq 完成"
7. 轮廓
   1. 选择代表牙齿中间的切片,其中呈现了两个通道的日冕浆、放射浆和两个牙周长。
   2. 通过单击左上左上等高线面板手动标记中间切片上感兴趣的轮廓 - 从远端根顶点的远端点开始,通过中间根顶点的位点,以可分词的邻点为圆角边界,通过中间根顶点的位点标记尖点边框。遵循微部根的远端边界和远端根的西端边界,穿过毛皮区域(见图3 II,IV)。
   3. 复制此轮廓(Ctrl+C、Ctrl+V),并将其相应地调整到位于中间切片两侧的 5 个切片。
   4. 要计算每个样本标记的轮廓的组织体积,请在_CT评估下选择任务,然后单击3D评估。在 3D 评估窗口中,单击"选择任务附近"并选择一个筛选器来计算组织体积 (TV)。
8. 组织学
   1. 从微型CT扫描仪中取出组织后,将每个样品放入微离心管中,用1 mL的乙烯二甲醚乙酸(EDTA)0.5M pH 8.0进行10天,使组织脱氧。每 3 天更改一次 EDTA 解决方案。
   2. 脱水:将样品放入组织学盒中,并加入增加乙醇浓度,每次一小时,如下所示:70%乙醇(此时,只要样品保存在乙醇中,即可停止数周),90%乙醇2倍,100%乙醇2x,二甲苯2x(注意:在化学罩中使用二甲苯,并根据其MSDS指南)。
      1. 将盒子转移到液体石蜡(60°C)中,在化学罩中过夜,使二甲苯蒸发。
   3. 阻止:使用组织阻止机将样品嵌入石蜡中。小心将它们嵌入到正确的位置(即,牙冠和根部应平行于模具的底部,以齿"向下"的方式)进行放置,以便获得下垂部分。样品现在准备用微缩子切割。
   4. 切割部分:首先切割±20 μm厚的切片,直到到达组织的相关部分。识别牙齿的任何部分(牙冠或根)后,将变为 6 μm 的截面,并根据上一节更改切割角度。
      1. 例如,如果上一节包括牙冠,但不包括根,则更改缩体中块的角度,使根更接近刀,并且牙冠返回(牙齿的部分可以通过肉眼在方块本身识别)。
      2. 继续调整角度,直到获得包括冠状和径向浆在内的下垂部分,以及腹腔前体。切在这个方向尽可能多的切片,直到相关组织全部切割。
   5. 有关染色方案(例如,海莫氧林和Eosin染色(H&E),布朗和布伦染色,抗酸磷酸酶(TRAP)染色,免疫组织化学),见20,21。

结果

图1显示了实验步骤的流程图。如协议所述,小鼠被麻醉,其第一个颌面摩尔在一侧被钻孔,直到纸浆暴露,而反向牙齿则作为对照。接下来,牙齿被口腔菌群污染42天,在此期间,他们被监测并接受止痛药。42天后,小鼠被安乐死,牙齿和相邻的下颌被采取进行分析。

图2显示了小鼠在第一次右摩尔纸浆暴露后可下颌的临床图像。在图 2A中,显示了整个下颌,而图 2B中的内示显示了经过处理的第一右摩尔的放大。左首摩尔用作控件。在图2B中可以看到美感和远端纸浆角和运河入口的暴露。请注意,为了减轻疼痛,牙齿被机械地降低到亚闭塞。

讨论

本文介绍了一种在小鼠中诱导牙周炎的方法。该方法的目的是利用牙周炎条件来研究这种炎症过程的机制和后果。在6-8周大的小鼠中诱导牙周炎,这个年龄的根完全^发育24岁。为了引起本模型中的牙周炎,使用牙毛刺暴露小鼠颌面的牙髓。来自小鼠的口腔菌群的细菌(在SPF条件下)侵入牙齿的果肉和根管,导致牙髓坏死,并将LPS分泌到皮质组织,从而引发牙周炎。

执行此过程时,请注意以下关键步骤。在纸浆暴露过程中正确定位动物对于手术的成功至关重要。关键步骤是正确接触纸浆。运河暴露不足可能导致丹丁桥的形成,这可能导致程序失败和无法创建 AP。在纸浆暴露期间,需要注意在纸浆接触过程中尽量减少软组织损伤,以避免在其他可能导致副作用的区域出现不必要的疼痛和炎症。在微CT分析软件中正确对齐样品对于获得可解释的结果至关重要。在为组织学准备颌骨组织时,建议剥离骨骼周围的软组织,以便在为组织学准备模具时达到正确的方向。在整个过程中(从收获阶段到微CT,直到组织学块过程),样品必须保存在湿介质中。在微托姆中切割组织时,应固定样品的角度,以实现牙齿的囊化切...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸阿替美唑	Eurovet Animal Health	CAS 104075-48-1
ATR	dentsply	tecnika
封闭机	Leica	EG1150H
buprenorphine	vetmarket	163451
临床显微镜/双目	Olympus	Sz61
牙科车针	Komet 牙科	ZR8801L 315 008
牙科刮刀	Premier	1003737
EDTA	J.T Baker	8993
entelan	汞	1.07961
伊红 Y 溶液，酒精	SIGMA	HT110116
苏木精溶液，Mayer's	SIGMA	MHS 16
盐	酸氯胺酮维托喹醇	CAS 1867-669
盐酸美托咪定（头孢托）	CP-pharma GmbH	CAS 86347-15-1
盐酸甲哌卡因 3%	Teva	CAS 96-88-8
微刷 - 可调精密涂抹器	PARKELL	S379
微 CT 扫描仪	scanco	uCT 40
石蜡	徕卡	39602004
PBS	SIGMA	D8537
PFA	EMS	15710
氯霉素眼膏 （5%）	Rekah 制药	CAS 56-75-7
镊子	WAM	Ref-CT
甲苯噻嗪	Eurovet 动物保健	CAS 7361-61-7
二甲苯	加多	CAS 1330-20-7