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方法文章

在小鼠中诱导根尖周炎

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⸱

DOI：

10.3791/59521

⸱

2019年8月6日

 ,  ,  , 
1Institute of Dental Sciences, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Endodontics, Hadassah Ein Kerem Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在小鼠中局部诱导根尖周炎的实验方案。我们展示了如何在小鼠牙齿上钻孔并暴露其牙髓，以引发局部炎症。同时演示了用于研究该炎症性质的分析方法，如显微CT和组织学分析。

摘要

局部诱导性炎症所涉及的机制可通过多种现有的动物模型进行研究，其中之一是诱导根尖周炎（AP）。根尖周炎是一种常见炎症性病理，发生于牙根周围牙周组织中。为了更好地理解该疾病的性质与机制，在小鼠体内实施该操作具有显著优势。这种牙源性炎症的诱导方法是通过钻开小鼠牙齿直至暴露牙髓。随后，牙髓保持开放状态，随时间推移被口腔天然菌群污染，从而引发根尖周炎。经过一定时间后，处死动物，可对牙齿及下颌骨进行多种方式的分析。典型分析方法包括显微CT成像（用于评估骨吸收）、组织学染色、免疫组织化学以及RNA表达分析。该实验方案对于口腔生物学领域的研究具有重要价值，可在条件一致的活体实验环境中更深入地理解这一炎症过程。该操作需要对小鼠及分离的下颌骨进行精细处理，而对该技术的可视化演示尤为有益。本文全面展示了在小鼠模型中诱导根尖周炎及其表征的全部技术操作步骤。

引言

本方法的目的是通过用天然微生物群污染小鼠根尖，诱导根尖周炎，并进一步研究该病理过程的多种特征。

根尖周炎（AP）是一种发生于牙根周围牙周组织的常见炎症性病变。这种牙科疾病可引起剧烈疼痛，必须由牙医进行治疗。治疗方案包括根管治疗（初次或再次）、牙髓外科手术、拔牙或根据临床和影像学检查结果以及临床医生的判断进行随访观察。尽管该炎症过程已研究数十年1,2,3，但其机制仍未被全面阐明。鉴于该疾病的严重性，显然有必要开展针对其基本性质的研究。因此，能够用于研究AP的系统具有重要的科学意义。

由于根尖周炎（AP）是一种涉及局部组织和免疫系统的复杂病理过程，体外研究不足以全面理解该疾病的发生机制。临床样本的研究也存在困难，主要受限于伦理问题以及不同个体和不同临床阶段之间的显著差异4,5，因此需要建立体内模型。这些模型基于将牙髓暴露于污染环境，并观察机体在根尖周组织对该刺激产生的炎症反应这一理念6,7。常用的体内模型包括啮齿类动物或狗等较大的动物。尽管小鼠体型极小、牙齿微小，给临床操作带来挑战，但小鼠模型具有显著优势：在实践上，小鼠实验在设施条件和技术操作方面较为简便，且成本最低；在科学层面，小鼠是被广泛研究的动物模型，拥有丰富的遗传与分子研究工具以及已被深入解析的基因组。事实上，已有研究利用小鼠模型探讨了根尖周炎中涉及的炎症反应和骨吸收相关的信号通路及细胞类型8,9,10,11。因此，亟需一套明确的小鼠模型用于AP研究的操作流程。本文中，我们描述了这样一套标准化实验方案。

本文所述方案具有显著优势，适用于研究基因敲除（KO）小鼠，并揭示特定基因缺失对牙源性炎症的影响7,12。该方案的其他重要应用包括：研究药物和全身状况对根尖周炎发生发展的影响13、根尖周炎对颌骨骨坏死发展的影响14,15，以及用于骨组织再生的干细胞治疗研究16。

该方案还可作为研究局部炎症的通用模型。为了研究炎症过程，已开发出多种小鼠模型，例如诱导性结肠炎或关节炎17,18。这些模型具有全身性效应，且在同一动物体内缺乏内置对照。而诱导性根尖周炎模型则包含一个无炎症的对侧对照，具有克服上述局限性的优势14,19。

因此，本方案适用于对局部炎症过程感兴趣的研究人员。这种炎症具有可控性，且局限于特定部位，同时可利用对侧牙齿作为对照，这些特点均使其成为研究该过程相关机制的有价值方案。此外，本方案也适用于关注根尖周炎症临床特征的研究人员。小鼠模型是研究该疾病多种变量的理想选择，此外还可方便地对小鼠模型进行遗传操作，以探究特定基因在根尖周炎症中的作用。

从技术上讲，由于小鼠牙齿尺寸较小，该临床操作在实施上具有较大挑战性。通过可视化方式展示该操作过程，将有助于学习其定位方法、所需设备及具体操作步骤。

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方案

本研究所述所有方法均已获得希伯来大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准（伦理编号：MD-17-15093-5）。

1. 动物麻醉与体位固定

  1. 按以下说明制备无菌溶液。
    1. 配制5 mL浓度为7 mg/mL的氯胺酮和0.09 mg/mL的美托咪定，用磷酸盐缓冲液（PBS）/生理盐水稀释。 
    2. 在 PBS/生理盐水 中稀释阿替美唑，配制浓度为 0.4 mg/mL 的无菌溶液（建议配制 5 mL 量）。
    3. 用 PBS/生理盐水稀释甲哌卡因（7.5 mg/mL）制备无菌溶液，用于局部麻醉（一支提供的甲哌卡因试剂足以配制 7.2 mL 储存液）。
  2. 使用6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠进行实验。将动物饲养于特定病原体阴性（SPF）级动物房，由实验设施提供标准饲料和饮水，自由进食和饮水。
  3. 称重小鼠，并按每克体重10 µL的体积进行腹腔注射。例如，对于一只体重20克的小鼠，
    注射200 µL的氯胺酮/美托咪啶溶液，终浓度为（70 mg/kg）氯胺酮和（0.9 mg/kg）美托咪啶
    每只动物。
  4. 为防止实验过程中因干燥导致动物角膜溃疡，应在动物麻醉期间将其眼睛涂抹含氯霉素（5%）的眼膏。使用光源保持麻醉状态下动物的体温。通过检查足底反射（用力捏压脚趾）来评估麻醉深度。
  5. 小鼠麻醉后，将其置于闭孔挤塑聚苯乙烯泡沫表面，右侧卧位（适用于右手操作的研究人员），并用胶带将四肢固定在泡沫表面。
  6. 使用小橡胶圈套在切牙上（上切牙1个，下切牙1个），并通过长针固定于闭孔挤塑聚苯乙烯泡沫表面，以张开口腔。
  7. 用胶带固定在表面的镊子向后牵拉右侧颊部。使用处于闭合稳定状态的镊子。
  8. 将带有小鼠的台面置于便于操作的舒适工作位置，以便接触下颌磨牙，并使用适当的放大设备（双目显微镜或临床显微镜）和光源。
  9. 使用镊子或牙用拉钩向后牵拉舌头，用27号针头将局部麻醉剂注射至下颌第一磨牙附近的颊黏膜皱襞处，注射量为25–50 µL即可。应观察到注射部位周围组织出现肿胀。

2. 牙髓暴露

  1. 使用1/4圆形牙科裂钻或相同尺寸的金刚砂钻针（建议使用长柄钻针），连接至任意合适的牙科电机（例如自动转矩降低（ATR）电机），转速设为每分钟800转（rpm）。
  2. 在右侧下颌第一磨牙的咬合面进行钻孔，直至通过牙本质可见牙髓角。使用电机短时点动操作，以防止局部过热。
  3. 使用8号或10号K锉或H锉刺穿牙髓，并通过破坏覆盖牙髓角（近中和远中）的牙本质，将锉针插入牙髓角中。锉针通过高压灭菌器灭菌。
  4. 尽可能深入地在牙髓腔内使用锉针操作，同时用锉针扩大开口。通常可见牙髓出血。
  5. 务必用钻针修整牙齿的锐利边缘，并使牙齿脱离咬合接触，以减少实验过程中的疼痛。操作过程中使用微型刷清洁碎屑。
  6. 将对侧牙齿（左侧下颌第一磨牙）保留作为对照。

3. 临床操作结束

  1. 解除小鼠的固定状态，腹腔注射阿替美唑（每克体重10 µL，最终剂量为4 mg/kg）。
  2. 腹腔注射用PBS/生理盐水稀释的布托啡诺（0.05 mg/kg）（建议在手术当天准备3 mL的用量）。有关为何需要镇痛的解释，请参见讨论部分。
  3. 确保动物在离开前已从麻醉中恢复。提供软质食物，因为它们可能因牙痛而无法进食硬质食物。

4. 术后随访（42 天）

  1. 术后前3天，每天称量动物体重，并通过腹腔注射给予丁丙诺啡（0.1 mg/kg），每日一次（建议配制6 mL剂量）。
  2. 在实验期间（炎症形成期，共42天），每周2-3次通过体重和一般行为学评估对动物进行监测。
  3. 在随访期间为动物提供软质食物。将食物用水浸湿后置于培养皿中，放在笼子底部。

5. 实验终止与分析

  1. 42天时11 完成随访后，通过腹腔注射以每公斤体重106.25 mg氯胺酮和75 mg赛拉嗪的剂量对动物进行麻醉（建议使用总体积为2 mL的储备液，其中含42.5 mg/mL氯胺酮和1.5 mg/mL赛拉嗪），随后实施颈椎脱位处死。
    注意：为评估炎症，存在多种可能的分析方法可供选择20,21本文将描述通过显微CT和组织学染色对组织进行的分析。
  2. 安乐死后，使用手术剪和镊子切除包含3颗磨牙的下颌部分（分别取治疗侧和未治疗对照侧）。用镊子尽可能剥离软组织，使样本主要保留骨组织和牙齿。
  3. 用 PBS 快速冲洗组织，然后将其置于4%多聚甲醛（PFA，用 PBS 稀释）中固定24–48小时。
    警告：使用PFA时应在化学通风橱中操作，并遵循其材料安全数据表（MSDS）的指导。
  4. 24-48 小时后，用 PBS 清洗 3 次，以洗去 PFA。
  5. 微型计算机断层扫描
    1. 对于显微CT分析，取收获的组织（包含3颗磨牙的下颌骨部分，尺寸约为4 mm × 5 mm × 1 mm），置于显微CT扫描仪中，将其放入直径为12 mm的管内，管中加入1.5 mL PBS，并调整组织方向，使牙齿及牙根的颊侧或舌侧表面与管底平行。样品之间用海绵隔开，并用柔性薄膜封住管口。
    2. 打开扫描面板并选择测量编号。选择控制文件，参数设置如下：能量 70 kV，电流 114 µA，分辨率 6 µm3 体素大小。
    3. 点击 定位像，当图像出现时，单击 参考线 标记样品的扫描区域。每个样品扫描后单击 添加扫描标记完样本后，前往 任务列表 并选择 开始交互任务.
      注意：相同的样本随后可用于组织学分析。在CT扫描过程中，必须确保样本不会干燥。
  6. 使用合适的计算机程序进行显微CT图像配准与分析。
    1. 在微计算机断层扫描（micro-CT）评估中，于XY平面打开样本。在每个样本上选择三个点用于对齐：
      近中根尖缩窄处——定义坐标系的原点。
      近中根管的冠方部分——定义Z轴上的一个点。
      ​远端顶端收缩——定义了XZ平面上的一个点。
    2. 使用左侧面板上的测量工具，画线连接至每个点。通过 X、Y 定义这三个点 & Z值，如右侧面板所示。
    3. 通过选择来定义样本中的感兴趣区域 任务 在……下方 µCT评估，然后点击 三维评估屏幕上将出现一个矩形和一个显示各轴尺寸的窗口。通过使用鼠标中键点击矩形的角点，调整矩形尺寸以匹配 XY 轴上的目标区域。通过在 Z 轴方框中输入感兴趣的起始切片编号，选择 Z 轴的尺寸 VOI 开始，以及在Z方格中从第一个到感兴趣的最后一个切片之间的切片数量 暗度.
    4. 点击 应用 在……下方 会话管理器，并选择 DECterm等待几秒钟，待窗口打开后，按照以下说明在横线之间输入下方所述的斜体字五个步骤（点击横线之间） 进入):
      ipl
      isq_to_aim
      aim1
    5. 复制 isq（目标文件）名称：选择 观看次数 在……下方 会话管理器 并点击 microCT数据找到正在处理的文件，用鼠标中键点击该文件，然后用鼠标中键在DECterm窗口内单击返回。
    6. 输入 X、Y & Z 值（两者之间用空格分隔），在以下条件下测定 感兴趣区域 选择感兴趣区域时。
    7. 输入 X、Y & Z 值（两者之间用空格分隔），在以下条件下测定 暗淡 选择感兴趣区域时。
    8. 等待收到消息： isq 以实现目标完成.
      （第二步——比对）：
      对齐 z
      aim1
      aim2
    9. 输入 X、Y & Z 值（以空格分隔），用于确定坐标系原点。
    10. 输入 X、Y & Z 值（以空格分隔），表示在 z 轴上该点所确定的数值。
    11. 输入 X、Y & Z 值（两者之间有一个空格），表示在 XZ 平面上该点所确定的数值。
    12. 等待收到消息： "align_Z 完成"
      （步骤 III - 标题）：
      页眉
      aim2
      0 0 0
      0 0 0
    13. 点击 进入.
      (步骤 IV- 将文件从 aim 格式转换回 isq):
      toisq
      aim2
    14. 复制 isq（感兴趣文件）的名称：选择 观看次数 在……下方 会话管理器 并点击 microCT 数据. 找到您正在处理的文件，中键单击该文件，然后中键单击返回 DECterm 窗口。擦除（使用 "退格"）的 ".ISQ" 在文件末尾，并写下："_new.ISQ" 以识别对齐的文件。
    15. 点击 进入 | 进入.
    16. 等待收到消息： "toisq_from_aim 完成"
      （第五步 V-翻转）：
      isq
      a
    17. 复制新的 isq（目标文件）名称：选择 观看次数 在……下方 环节 经理 并点击 microCT 数据找到正在处理的文件，用鼠标中键点击该文件，然后用鼠标中键在DECterm窗口中单击返回。
    18. 点击 输入 | 进入等待接收消息： "isq_to_aim 完成"
      翻转
      a
      aa
      zx
      等待接收消息： "flip_aim 完成"
      从
      aa
    19. 复制新的 isq 名称：选择 观看次数 在……下方 会话管理器 并点击 microCT 数据. 找到正在处理的文件，中键点击该文件。然后中键点击回到 DECterm 窗口。擦除（使用 "退格"）的 ".ISQ" 在文件末尾，并撰写： "_flip.ISQ" 以识别对齐的文件。
    20. 等待收到消息： "从 aim 到 isq 完成"
  7. 勾画
    1. 选择能够大致代表牙齿中段的切片，该切片应显示冠髓、两个根管的根髓以及两个根尖孔。
    2. 在中间层面的左上轮廓面板上手动标记感兴趣区域的轮廓——从远中根尖的远端点开始，沿冠方方向标记至远中根尖的阻射根尖区域，然后沿近中根尖的近中边缘，经过近中根的远中边缘和远中根的近中边缘，穿过根分叉区域 （参见 图3 II, IV)
    3. 复制此轮廓（Ctrl+C，Ctrl+V），并相应调整至中间切片两侧各5个切片。
    4. 要计算每个样本所标记轮廓的组织体积，请选择 任务 在……下方 µCT评估，然后点击 3D评估在三维评估窗口中点击 选择 接近 任务 并选择一个滤波器来计算组织体积（TV）。
  8. 组织学
    1. 组织从显微CT扫描仪中取出后，将每个样本置于含1 mL 0.5 M pH 8.0乙二胺四乙酸（EDTA）的微量离心管中，进行脱钙处理，持续10天。每3天更换一次EDTA溶液。
    2. 脱水：将样品放入组织学包埋盒中，依次置于浓度递增的乙醇中，每步各1小时，具体如下：70%乙醇（此步骤可暂停数周，只要样品保存在乙醇中即可）、90%乙醇两次、100%乙醇两次、二甲苯两次（注意：使用二甲苯时应在化学通风橱中操作，并遵循其材料安全数据表（MSDS）的指导）。
      1. 将包埋盒转移至液体石蜡（60 °C）中，置于化学通风橱内过夜，使二甲苯挥发。
    3. 包埋：使用组织学包埋机将样本包埋于石蜡中。注意将样本正确放置（即牙冠与牙根应与模具底部平行，使牙齿处于 "平躺"以获得矢状切面。样品现已准备好用切片机进行切片。
    4. 切片：首先切取约20 µm的厚片，直至到达目标组织区域。一旦观察到牙齿的任何部分（牙冠或牙根），即改为切取6 µm的切片，并根据前一切片情况调整切片角度。
      1. 例如，如果前一个切片包含了牙冠但未包含牙根，则应调整切片机中样本块的角度，使牙根更靠近刀刃，而牙冠向后移动（牙体各部分可在样本块上用肉眼识别）。
      2. 继续调整角度，直至获得包含冠部和根部牙髓以及根尖孔的矢状切面。按此方向尽可能多地切片，直至相关组织全部切完。
    5. 染色方案（例如，苏木精和伊红染色（H&E)，Brown & Brenn染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、免疫组织化学），参见20,21.

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结果

实验步骤的流程图见图1。如实验方案所述，对小鼠进行麻醉后，将其一侧下颌第一磨牙钻开至牙髓暴露，而对侧牙齿则作为对照保留。随后，牙齿暴露于口腔菌群污染环境中42天，在此期间对小鼠进行监测并给予镇痛药物。42天后，处死小鼠，取牙齿及邻近颌骨组织用于分析。

图2展示了小鼠右侧第一磨牙牙髓暴露后下颌的临床图像。图2A显示了整个下颌骨，而图2B的插图则放大显示了经处理的右侧第一磨牙。左侧第一磨牙作为对照。在图2B中可见近中和远中牙髓角以及根管入口均暴露。请注意，为了减轻疼痛，该牙齿已通过机械方式降低至咬合下位置。

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讨论

本文介绍了一种在小鼠中诱导根尖周炎的方法。该方法的目的是利用根尖周炎这一病理状态，研究此炎症过程的机制及其后果。实验在6-8周龄的小鼠中诱导根尖周炎，此年龄段小鼠的牙根已完全发育24。为在该模型中诱发根尖周炎，需使用牙科钻暴露小鼠下颌磨牙的牙髓。来自小鼠口腔菌群（在SPF条件下）的细菌侵入牙髓及根管，导致牙髓坏死，并向根尖组织释放脂多糖（LPS），从而引发根尖部位的炎症反应。

进行该操作时，需注意以下几个关键步骤。在牙髓暴露过程中，动物体位的正确放置对该操作的成功至关重要。一个关键步骤是牙髓的充分暴露。根管暴露不足可能导致修复性牙本质桥的形成，从而导致操作失败，并无法成功建立牙髓穿孔（AP）。在牙髓暴露过程中，应注意尽量减少对软组织的损伤，以避免在其他区域引起不必要的疼痛和炎症，进而产生副作用。在微计算机断层扫描（micro-CT）分析软件中对样本进行正确对齐，对于获得可解读的结果至关重要。在准备颌骨组织进行组织学处理时，建议剥离骨组织周围附着的软组织，以便在制备组织学包埋模具时实现正确的取向。在整个操作过程...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

我们感谢 Oded Heyman 博士在动物体位摆放方面的帮助，Raphael Lieber 在微计算机断层扫描分析方面的协助，以及 Andiara De Rossi Daldegan 教授在实验实施方面的建议。我们还要感谢 Sidney Cohen 博士对文稿的审阅和修改。

本工作获得了MK和IA的Dr. Izador I. Cabakoff研究捐赠基金资助，以及EG获得的以色列科学与技术部Yitzhak Navon博士后奖学金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
盐酸阿替美唑Eurovet Animal HealthCAS 104075-48-1
ATRdentsplytecnika
包埋机LeicaEG1150H
布托啡诺vetmarket163451
临床显微镜/双目OlympusSz61
牙科车针Komet dentalZR8801L 315 008
牙科刮匙Premier1003737
EDTAJ.T Baker8993
Entelanmercury1.07961
伊红Y醇溶液SIGMAHT110116
迈耶氏苏木精溶液SIGMAMHS 16
盐酸氯胺酮VetoquinolCAS 1867-669
盐酸美托咪啶（Cepetor）CP-pharma GmbHCAS 86347-15-1
3% 盐酸甲哌卡因TevaCAS 96-88-8
微刷—可调节精密涂布器PARKELLS379
微型CT扫描仪scancouCT 40
石蜡Leica39602004
PBSSIGMAD8537
PFAEMS15710
氯霉素眼膏（5%）Rekah pharmaceuticalCAS 56-75-7
镊子WAMRef-CT
赛拉嗪Eurovet Animal HealthCAS 7361-61-7
二甲苯GadotCAS 1330-20-7

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在小鼠中诱导根尖周炎
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