方法文章

一种体外批次培养模型用于评估干预方案对人类粪便菌群的影响

DOI：

10.3791/59524

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2019年7月31日

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1Department of Internal Medicine- Molecular Medicine, Wake Forest School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Wake Forest School of Medicine, 3Department of Food Science and Technology, Isfahan University of Technology, 4Research Institute for Biotechnology and Bioengineering, College of Agriculture, Isfahan University of Technology, 5Department of Geriatrics and Gerontology, Wake Forest School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本方案描述了一种体外批次培养发酵系统，用于研究人类粪便微生物群。通过使用菊粉（一种广为人知的益生元，也是研究最广泛的微生物群调节剂之一），展示该系统在评估特定干预措施对粪便微生物群组成及代谢活性影响中的应用。

摘要

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肠道微生物组在多种人类疾病中的新兴作用迫切需要在新工具、新技术和新方法上取得突破。这些改进对于解析微生物组调节剂在促进人类健康方面的应用至关重要。然而，由于需要大量动物和/或人类受试者，对调节剂进行大规模筛选和优化以验证其对微生物组的调节作用并预测相关健康益处，在实践中可能十分困难。为此，体外（in vitro）或离体（ex vivo）模型可有助于对微生物组调节剂进行初步筛选。本文优化并展示了一种可用于评估多种干预措施（包括益生菌、益生元、其他食品成分、营养补充剂及药物等微生物组调节剂）对人类肠道微生物组多样性和组成影响的离体粪便微生物群培养系统。以菊粉为例——这是研究最广泛的益生元化合物和微生物组调节剂之一——用于考察其对健康个体粪便微生物群组成及其代谢活性（如粪便pH值以及乳酸和短链脂肪酸（SCFAs）等有机酸水平）的影响。本方案可为旨在评估不同调节剂干预对粪便微生物群谱影响并预测其健康效应的研究提供参考。

引言

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人体微生物群是一个复杂的群落，由细菌、古菌、病毒和真核微生物1组成，存在于人体内外。近年来的研究证据已确立肠道微生物群以及肠道微生物组（指存在于人体胃肠道中的全部微生物及其基因的集合）在多种人类疾病中的重要作用，包括肥胖、糖尿病、心血管疾病和癌症1,2,3。此外，生活在我们肠道中的微生物会产生广泛多样的代谢产物，这些代谢物显著影响我们的健康，并可能参与多种疾病的病理生理过程以及各种代谢功能4,5。该肠道微生物群落在组成和功能上的异常变化（扰动）通常被称为"肠道菌群失调"。菌群失调通常与宿主的不健康状态相关，因此可区别于健康宿主对照状态下所对应的正常（稳态）微生物群落。在多种不同疾病中，常可观察到特定模式的肠道微生物组失调1,2,3,6,7。

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方案

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警告：请查阅相应的材料安全数据表，并遵循适当的生物安全二级（BSL-2）培训的说明和指南。所有培养操作均须按照标准生物安全规范进行，并在符合生物安全二级（BSL-2）要求的生物安全柜中以无菌条件操作。此外，来自不同模型及人类受试者的粪便样本可能存在传播微生物源性疾病的潜在风险。如发生任何伤害或感染，应立即寻求医疗救助。同时，使用人类和动物粪便样本须经机构伦理委员会批准，并严格遵守样本及受试者信息使用的相关规程。

1. 培养基的制备

  1. 培养基的制备，配制九种储备液
    1. 溶液A（1,000 mL）：溶解5.4 g氯化钠（NaCl）、2.7 g磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)，0.16 g 二水合氯化钙（CaCl2·2H2O)，0.12 g 六水合氯化镁（MgCl2·6H2O)，0.06 g 四水合氯化锰（MnCl2·4H2O)，0.06 g 六水合氯化钴（CoCl2·6H2O)，以及5.4 g硫酸铵（NH₄）₂SO₄4)2SO4，用去离子水定容至 1,000 mL。
    2. 溶液B（1,000 mL）：将2....

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结果

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本方案用于演示特定益生元（即菊粉）对健康人受试者粪便微生物群组成及其代谢活性的影响，具体指标包括不同时间点粪便pH值以及粪便中乳酸和短链脂肪酸（SCFAs）浓度的变化（经菊粉处理后）。在加入或不加菊粉孵育0（基线）、9和24小时时，分别测定粪便pH值、粪便中乳酸和SCFAs的水平（图1），以及微生物群组成（图2 和 图3）。结果展示了在体外发酵过程中，添加或不添加菊粉处理对粪便微生物群组成及其代谢活性的调节作用。

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讨论

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本文介绍的体外粪便悬液发酵模型是一种简单的单批次模型，用于近似评估不同底物和微生物菌株（如益生元和益生菌）对人类粪便微生物群组成及其代谢活性（以粪便pH值和短链脂肪酸SCFAs水平为指标）的影响。本文结果表明，接种菊粉后，与未处理的粪便微生物群培养物相比，菊粉处理组的粪便pH值降低，且SCFAs和乳酸水平显著升高（图1）。此外，菊粉处理组与未处理组之间的肠道微生物群特征也存在差异（图2 和 图3）。这些数据展示了该系统如何反映菊粉对粪便微生物组多样性、组成及其代谢活性的影响。此外，根据具体的实验目标和假设，该系统还可用于测定多种其他因素。进一步地，除16S rRNA基因测序外，还可开展其他分析方法，例如全微生物宏基因组测序（使用全基因组测序仪）、针对特定单个或多个属、种及菌株（如双歧杆菌、乳杆菌、Akkermansia、Enterobacteriaceae、梭菌等）的qPCR和培养法。此外，根据实验需求和设备条件，还可采用不.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者衷心感谢来自糖尿病、肥胖与代谢研究中心、临床与转化科学中心、维克森林医学院、美国国防部资助（资助号：W81XWH-18-1-0118）、Kermit Glenn Phillips II 心血管医学讲席、美国国立卫生研究院资助的 Claude D. Pepper 老年美国人中心（资助号：P30AG12232）；R01AG18915；R01DK114224 以及临床与转化科学中心（临床研究单元，资助号：UL1TR001420）提供的经费支持。我们还感谢志愿者提供粪便样本，以及其他实验室成员在本实验过程中提供的技术协助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
碳酸氢铵 (NH4HCO3)Sigma-Aldrich217255
硫酸铵 (NH4)2SO4 TGIC2388有毒
二水氯化钙 (CaCl2•2H2O)Sigma-AldrichC3306有刺激性
六水氯化钴 (CoCl2•6H2O)Sigma-Aldrich255599
二水氯化铜 (CuCl2•2H2O)Acros organics2063450000有毒，有刺激性
半胱氨酸盐酸盐Sigma-AldrichC121800
D-生物素Sigma-AldrichB4501
D-泛酸Alfa AesarA16609
二水乙二胺四乙酸二钠 (Na2EDTA)Biorad1610729
DL-α-甲基丁酸Sigma-AldrichW271918
七水硫酸亚铁 (FeSO4•7H2O)Sigma-AldrichF8263有毒
叶酸Alfa AesarJ62937
葡萄糖Sigma-AldrichG8270
血红素Sigma-AldrichH9039
HEPESAlfa AesarA14777
异丁酸Alfa AesarL04038
异戊酸Alfa AesarA18642
六水氯化镁 (MgCl2•6H2O)Sigma-AldrichM8266
四水氯化锰 (MnCl2•4H2O)Sigma-Aldrich221279
烟酸（尼克酸）Sigma-AldrichN4126
六水氯化镍(II) (NiCl2•6H2O)Alfa AesarA14366有毒
正戊酸Sigma-Aldrich240370
对氨基苯甲酸MP China102569有毒，有刺激性
磷酸 (H3PO4)Sigma-AldrichP5811
磷酸二氢钾 (KH2PO4)Sigma-AldrichP5504
磷酸氢二钾 (K2HPO4)Sigma-Aldrich1551128
吡哆醇Alfa AesarA12041
刃天青Sigma-AldrichR7017
核黄素Alfa AesarA11764
碳酸钠 (Na2CO3)Sigma-Aldrich1613757
氯化钠 (NaCl)Fisher BioReagents7647-14-5
氢氧化钠 (NaOH)Fisher ChemicalsS320
二水钼酸钠 (Na2MoO4•2H2O)Acros organics206375000
盐酸硫胺（硫胺盐酸盐）Acros organics148991000
胰蛋白胨BD Biosciences211921
维生素B12Sigma-AldrichV2876
酵母提取物Sigma-Aldrich70161
七水硫酸锌 (ZnSO4•7H2O)Sigma-AldrichZ0251
0.22 µm 微孔滤膜
AMPure 磁性纯化珠Agencourt
带培养箱的厌氧室Forma 厌氧系统，Thermo Scientific，美国
瓶式滤器Corning
纱布
Illumina MiSeq 测序仪MiSeq 试剂盒 v3
pH 计
Qiagen PowerFecal 试剂盒Qiagen
微生物生态学定量分析软件 (QIIME)
Qubit-3 荧光计InVitrogen
涡旋振荡器Thermoscientific
Waters-2695 Alliance 高效液相色谱系统Waters Corporation

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
  2. Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (....

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