方法文章

一种体外批次培养模型用于评估干预方案对人类粪便菌群的影响

DOI：

10.3791/59524

⸱

2019年7月31日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine- Molecular Medicine, Wake Forest School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Wake Forest School of Medicine, 3Department of Food Science and Technology, Isfahan University of Technology, 4Research Institute for Biotechnology and Bioengineering, College of Agriculture, Isfahan University of Technology, 5Department of Geriatrics and Gerontology, Wake Forest School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种体外批次培养发酵系统，用于研究人类粪便微生物群。通过使用菊粉（一种广为人知的益生元，也是研究最广泛的微生物群调节剂之一），展示该系统在评估特定干预措施对粪便微生物群组成及代谢活性影响中的应用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肠道微生物组在多种人类疾病中的新兴作用迫切需要在新工具、新技术和新方法上取得突破。这些改进对于解析微生物组调节剂在促进人类健康方面的应用至关重要。然而，由于需要大量动物和/或人类受试者，对调节剂进行大规模筛选和优化以验证其对微生物组的调节作用并预测相关健康益处，在实践中可能十分困难。为此，体外（in vitro）或离体（ex vivo）模型可有助于对微生物组调节剂进行初步筛选。本文优化并展示了一种可用于评估多种干预措施（包括益生菌、益生元、其他食品成分、营养补充剂及药物等微生物组调节剂）对人类肠道微生物组多样性和组成影响的离体粪便微生物群培养系统。以菊粉为例——这是研究最广泛的益生元化合物和微生物组调节剂之一——用于考察其对健康个体粪便微生物群组成及其代谢活性（如粪便pH值以及乳酸和短链脂肪酸（SCFAs）等有机酸水平）的影响。本方案可为旨在评估不同调节剂干预对粪便微生物群谱影响并预测其健康效应的研究提供参考。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人体微生物群是一个复杂的群落，由细菌、古菌、病毒和真核微生物1组成，存在于人体内外。近年来的研究证据已确立肠道微生物群以及肠道微生物组（指存在于人体胃肠道中的全部微生物及其基因的集合）在多种人类疾病中的重要作用，包括肥胖、糖尿病、心血管疾病和癌症1,2,3。此外，生活在我们肠道中的微生物会产生广泛多样的代谢产物，这些代谢物显著影响我们的健康，并可能参与多种疾病的病理生理过程以及各种代谢功能4,5。该肠道微生物群落在组成和功能上的异常变化（扰动）通常被称为"肠道菌群失调"。菌群失调通常与宿主的不健康状态相关，因此可区别于健康宿主对照状态下所对应的正常（稳态）微生物群落。在多种不同疾病中，常可观察到特定模式的肠道微生物组失调1,2,3,6,7。

肠道微生物群对未消化食物（尤其是可发酵碳水化合物/纤维）的发酵不仅能够产生能量，还会生成多种代谢产物，包括短链脂肪酸（SCFAs）、乳酸、甲酸、二氧化碳、甲烷、氢气和乙醇6此外，肠道微生物群还能产生多种其他生物活性物质，如叶酸、生物素、三甲胺N氧化物、血清素、色氨酸、γ-氨基丁酸、多巴胺、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、组胺、脱氧胆酸和4-乙基苯基硫酸盐。这一过程主要通过利用宿主-微生物生态位内的内在代谢通量实现，参与多种生理过程、代谢功能及表观遗传学改变。1,8,9,10然而，由于缺乏简便、高效且可重复的实验方案，各种干预措施对这些微生物产物的影响仍不明确或尚不清楚。人类肠道微生物群的组成是一个极为复杂且多样化的生态系统，因此，关于其在人类健康与疾病病理中所起作用的许多问题仍未得到解答。许多常见的肠道微生物组调节剂（如益生菌、益生元、抗生素、粪便移植及感染）对肠道微生物群组成及其代谢功能的影响在很大程度上仍不清楚。此外，体内验证这些影响十分困难，特别是因为肠道微生物群产生的大多数营养物质和代谢物在肠道内被同时且迅速地吸收或清除；因此，体内检测这些代谢物（如短链脂肪酸，SCFAs）的生成量及其代谢过程仍面临实际挑战。尽管动物模型和人体受试者等生理模型对于确定肠道微生物组及其调控在宿主健康中的作用至关重要，但由于伦理、经济或时间上的限制，这些模型可能并不适用于大规模筛选不同类型的微生物组调节剂。为此，体外（in vitro）和/或离体（ex vivo）模型，例如在体外培养肠道微生物群后施加不同的微生物组调节剂，可节省时间和成本，从而为初步或大规模筛选各类成分（如益生菌、益生元及其他干预性化合物）提供可能，以评估或预测其对粪便微生物群多样性、组成及代谢谱的影响。利用此类肠道微生物组的体外和离体系统开展的研究，有助于进一步理解影响宿主健康与疾病的宿主-微生物组相互作用，并可能推动开发以微生物组为靶点、改善宿主健康并预防和治疗多种疾病的新疗法。1.

尽管体外肠道微生物群培养系统无法真实再现实际的肠道环境，但已有多个实验室致力于开发此类模型，其中一些模型在一定程度上已被证明具有可行性，并已成功用于不同目的。近期的一种肠道模型是人体肠道微生物生态系统模拟器（Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem），该模型可模拟整个人体消化道，包括胃、小肠以及结肠的不同区域。然而，这类技术上较为复杂的模型可能难以被全球其他研究机构广泛采用。因此，目前仍迫切需要开发新的替代模型，这些模型应相对简单、经济且实用，适用于研究微生物组调节剂及其对肠道微生物群和宿主健康影响的实验室。因此，使用体外（或离体）粪便微生物群培养系统有助于研究此类干预措施的效果11,12。具体而言，可通过该系统研究不同益生元对微生物群发酵能力的影响，包括肠道微生物群多样性与组成的周期性变化、粪便pH值，以及微生物代谢产物（如短链脂肪酸和乳酸）水平的变化13。本文以菊粉（研究最广泛的益生元成分之一）作为微生物组调节剂的示例，详细描述这一简单的离体微生物群批次培养系统的逐步操作流程，以展示其在评估微生物组调节剂干预后粪便微生物群及微生物代谢产物变化中的应用。

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方案

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警告：请查阅相应的材料安全数据表，并遵循适当的生物安全二级（BSL-2）培训的说明和指南。所有培养操作均须按照标准生物安全规范进行，并在符合生物安全二级（BSL-2）要求的生物安全柜中以无菌条件操作。此外，来自不同模型及人类受试者的粪便样本可能存在传播微生物源性疾病的潜在风险。如发生任何伤害或感染，应立即寻求医疗救助。同时，使用人类和动物粪便样本须经机构伦理委员会批准，并严格遵守样本及受试者信息使用的相关规程。

1. 培养基的制备

  1. 培养基的制备，配制九种储备液
    1. 溶液A（1,000 mL）：溶解5.4 g氯化钠（NaCl）、2.7 g磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)，0.16 g 二水合氯化钙（CaCl2·2H2O)，0.12 g 六水合氯化镁（MgCl2·6H2O)，0.06 g 四水合氯化锰（MnCl2·4H2O)，0.06 g 六水合氯化钴（CoCl2·6H2O)，以及5.4 g硫酸铵（NH₄）₂SO₄4)2SO4，用去离子水定容至 1,000 mL。
    2. 溶液B（1,000 mL）：将2.7 g磷酸氢二钾（K2HPO4）溶于去离子水中，定容至1,000 mL。
    3. 微量元素溶液（1,000 mL）：将500 mg乙二胺四乙酸二钠二水合物（Na₂EDTA·2H₂O）、4.36 mg七水合硫酸亚铁（FeSO₄·7H₂O）、1.01 mg七水合硫酸锰（MnSO₄·7H₂O）、0.15 mg七水合硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）、0.05 mg五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）、0.02 mg六水合氯化钴（CoCl₂·6H₂O）、0.02 mg二水合钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）和0.02 mg四水合氯化镍（NiCl₂·4H₂O）溶于去离子水中。2EDTA)，200 mg 七水合硫酸亚铁（FeSO₄·7H₂O）4·7H2O)，10 mg 硫酸锌七水合物（ZnSO₄·7H₂O）4·7H2O)，3 mg 四水合氯化锰(II)（MnCl2·4H2O)，30 mg 磷酸（H3PO4），20 mg 的 CoCl2·6H2O，1 mg 氯化铜二水合物（CuCl₂·2H₂O）2·2H2O)，2 mg 六水合氯化镍(II)（NiCl2·6H2O) 和 3 mg 钼酸钠二水合物（Na2MoO4·2H2将去离子水定容至 1,000 mL。
      注意： 该溶液对光敏感，因此需保存在避光/黑色或铝箔包裹的试管/瓶子中。
    4. 水溶性维生素溶液（1,000 mL）：将100 mg盐酸硫胺（Thiamin-HCl）、100 mg D-泛酸（D-pantothenic acid）、100 mg烟酸（Niacin）、100 mg吡哆醇（pyridoxine）、5 mg对氨基苯甲酸（P-aminobenzoic acid）和0.25 mg维生素B12溶于去离子水中，定容至1,000 mL。
    5. 叶酸：生物素溶液（1,000 mL）：溶解10 mg叶酸、2 mg D-生物素和100 mg碳酸氢铵（NH₄HCO₃）于水中4HCO3) 加去离子水至总体积 1,000 mL。
    6. 核黄素溶液（1,000 mL）：将10 mg核黄素溶解于5 mM HEPES（1.19 g/L）溶液中，定容至1,000 mL。
    7. 血红素溶液（10 mL）：将5,000 mg血红素溶解于10 mM氢氧化钠（NaOH）（0.4 g/L）溶液中，定容至10 mL。
    8. 短链脂肪酸混合物（10 mL）：取2.5 mL正戊酸、2.5 mL异戊酸、2.5 mL异丁酸和2.5 mL DL-α-甲基丁酸，混合均匀。
      注意： 建议在通风橱中使用该溶液，以避免气味和烟雾。
    9. 刃天青（1,000 mL）：将1 g刃天青溶解于去离子水中，定容至1,000 mL。
  2. 用于体外厌氧发酵的培养基
    1. 配制该培养基时，混合330 mL溶液A、330 mL溶液B、10 mL微量元素溶液、20 mL水溶性维生素溶液、5 mL叶酸-生物素溶液、5 mL核黄素溶液、2.5 mL血红素溶液、0.4 mL短链脂肪酸混合物、1 mL刃天青、0.5 g酵母提取物、4 g碳酸钠（Na₂CO₃），并用蒸馏水定容至3.6 L。调节pH至7.0。2CO3），0.5 g 盐酸半胱氨酸（Cysteine HCl-H2O，以及0.5 g胰蛋白胨，并加入296.1 mL蒸馏水。
    2. 检查pH值，确保其约为7.0；若不符合，用1 N HCl或1 N NaOH调节pH。在无菌工作台中，使用瓶式滤器对培养基进行真空过滤灭菌。
    3. 或者，将所有组分（维生素和血红素溶液除外）混合后，在121 °C下高压灭菌20分钟，并冷却至室温。同时，使用0.22 µm膜滤器对维生素和血红素溶液进行过滤除菌，并在分装前将其加入已灭菌并冷却的培养基中。

2. 厌氧培养箱及所需材料的准备

  1. 在开始发酵实验前至少48小时，将实验所需的所有材料、溶液和工具放置于厌氧工作站内，以确保与工具相关的残留氧气以及缓冲液/溶液中的溶解氧被完全去除，并使所有材料适应设定的厌氧条件。
    注意：需提前48小时放入厌氧工作站内的材料包括：(i) 发酵培养基；(ii) 厌氧溶液（按第4.1节所述方法配制）；(iii) 涡旋振荡器；(iv) 电子天平；(v) 棉质 cheesecloth（纱布）；(vi) 剪刀；(vii) 漏斗；(viii) 1.5、2.0、15、50 mL离心管；(ix) 移液器（2、20、200 和 1,000 µL）及配套的移液器吸头；(x) 刻度移液管及移液管（5 和 10 mL）；(xi) 纸巾；(xii) 记号笔；(xiii) 各类离心管管架；(xiv) 废物盒；(xv) O2 指示剂；(xvi) 70%乙醇喷雾瓶（消毒剂）。

3. 管材与纤维的制备

  1. 称取300 mg菊粉，转移至50 mL离心管中，随后在厌氧环境中无菌加入26 mL已预先配制并保存在厌氧工作站内的发酵培养基。每种粪便样本类型及实验管（根据待测化合物数量确定）均需设置一个空白对照管，并设三个重复。
  2. 将这些离心管置于厌氧工作站内约24小时，以使样品充分水合，再开始发酵实验。接种时确保离心管温度为37 °C，因此需将离心管放置于厌氧工作站内的培养箱中预热。

4. 接种物的制备

  1. 厌氧稀释液（发酵实验前至少48 h制备）：将5 g NaCl、2 g葡萄糖和0.3 g盐酸半胱氨酸溶解于去离子水中，定容至1,000 mL。121°C高压灭菌15 min，随后置于厌氧培养箱中至少保存48 h后使用。
  2. 粪便接种物制备（发酵实验当天）：称取5 g新鲜粪便样本于50 mL锥形管中，加入厌氧稀释液至终体积50 mL（1:10 w/v），涡旋振荡15 min或直至完全均质化。将均质后的混合液通过4层无菌纱布（已高压灭菌）过滤，立即用于含培养基试管的接种。
    注意： 若实验目的是比较特定化合物/成分对总体健康人群与疾病人群粪便微生物群的影响，可将一组受试者的粪便样本混合使用。

5. 发酵与取样

  1. 按照第4.2节准备试管，并向空白/对照管和实验管中分别接种4 mL稀释并过滤后的粪便接种物。将接种后的试管置于厌氧培养箱内37 °C培养。每隔一小时轻轻倒置振荡试管一次，以重新悬浮纤维和接种物。
  2. 根据需要尽可能频繁地采集样品，例如在发酵过程中于0、3、6、9和24小时时，从相应的发酵管中取出2 mL等分试样至2 mL离心管中。
  3. 使用实验室pH计（将pH电极直接插入样品中）测定等分试样的pH值；将剩余样品在4 °C下以14,000 x g离心10分钟。立即用液氮速冻上清液和沉淀，速冻后将上清液于-80 °C保存用于短链脂肪酸（SCFAs）分析，沉淀于-80 °C保存用于微生物组分析。

6. 短链脂肪酸（SCFAs）和乳酸定量

注意：微生物组培养上清液中的短链脂肪酸（SCFAs）和乳酸可严格按照 elsewhere13,14,15,16 中详述的方法进行精确测定。

  1. 简而言之，将第5节中获得的对照组和处理组样本的速冻上清液在冰上解冻，并将所有后续操作步骤均在冰上进行。使用0.45 µm膜过滤器过滤上清液，收集无细胞样品，利用配备HPX-87H色谱柱和DAD检测器的高效液相色谱系统在210 nm处测定短链脂肪酸（SCFAs）和乳酸的浓度。每个样品进样体积为10 μL，使用H2SO4（0.005 N）以0.6 mL/min的流速在35 °C条件下洗脱色谱柱。

7. 粪便微生物组分析

注意：按照 elsewhere7,13,14,17 中详细描述的方法和流程进行微生物组分析。

  1. 简而言之，从约200 使用粪便DNA提取试剂盒从粪便浆液颗粒中提取mg级样本13.
  2. 使用带条形码的引物，按照 elsewhere 描述的方法扩增细菌 16S rRNA 基因的高变区13，使用地球微生物组计划方案中所述的引物序列18.
  3. 使用磁性纯化 beads 纯化所得扩增子，并通过 Picogreen 或等效方法进行定量。将纯化后的 PCR 产物按等摩尔浓度混合，随后在测序仪上进行测序13.
  4. 使用 Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) 软件，按照 Caporaso 等人所述方法，对所得序列进行去多重化、质量过滤与聚类、分类学分配和稀疏化，以及后续分析。19.

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结果

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本方案用于演示特定益生元（即菊粉）对健康人受试者粪便微生物群组成及其代谢活性的影响，具体指标包括不同时间点粪便pH值以及粪便中乳酸和短链脂肪酸（SCFAs）浓度的变化（经菊粉处理后）。在加入或不加菊粉孵育0（基线）、9和24小时时，分别测定粪便pH值、粪便中乳酸和SCFAs的水平（图1），以及微生物群组成（图2 和 图3）。结果展示了在体外发酵过程中，添加或不添加菊粉处理对粪便微生物群组成及其代谢活性的调节作用。

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讨论

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本文介绍的体外粪便悬液发酵模型是一种简单的单批次模型，用于近似评估不同底物和微生物菌株（如益生元和益生菌）对人类粪便微生物群组成及其代谢活性（以粪便pH值和短链脂肪酸SCFAs水平为指标）的影响。本文结果表明，接种菊粉后，与未处理的粪便微生物群培养物相比，菊粉处理组的粪便pH值降低，且SCFAs和乳酸水平显著升高（图1）。此外，菊粉处理组与未处理组之间的肠道微生物群特征也存在差异（图2 和 图3）。这些数据展示了该系统如何反映菊粉对粪便微生物组多样性、组成及其代谢活性的影响。此外，根据具体的实验目标和假设，该系统还可用于测定多种其他因素。进一步地，除16S rRNA基因测序外，还可开展其他分析方法，例如全微生物宏基因组测序（使用全基因组测序仪）、针对特定单个或多个属、种及菌株（如双歧杆菌、乳杆菌、Akkermansia、Enterobacteriaceae、梭菌等）的qPCR和培养法。此外，根据实验需求和设备条件，还可采用不...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者衷心感谢来自糖尿病、肥胖与代谢研究中心、临床与转化科学中心、维克森林医学院、美国国防部资助（资助号：W81XWH-18-1-0118）、Kermit Glenn Phillips II 心血管医学讲席、美国国立卫生研究院资助的 Claude D. Pepper 老年美国人中心（资助号：P30AG12232）；R01AG18915；R01DK114224 以及临床与转化科学中心（临床研究单元，资助号：UL1TR001420）提供的经费支持。我们还感谢志愿者提供粪便样本，以及其他实验室成员在本实验过程中提供的技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
碳酸氢铵 (NH4HCO3)Sigma-Aldrich217255
硫酸铵 (NH4)2SO4 TGIC2388有毒
二水氯化钙 (CaCl2•2H2O)Sigma-AldrichC3306有刺激性
六水氯化钴 (CoCl2•6H2O)Sigma-Aldrich255599
二水氯化铜 (CuCl2•2H2O)Acros organics2063450000有毒，有刺激性
半胱氨酸盐酸盐Sigma-AldrichC121800
D-生物素Sigma-AldrichB4501
D-泛酸Alfa AesarA16609
二水乙二胺四乙酸二钠 (Na2EDTA)Biorad1610729
DL-α-甲基丁酸Sigma-AldrichW271918
七水硫酸亚铁 (FeSO4•7H2O)Sigma-AldrichF8263有毒
叶酸Alfa AesarJ62937
葡萄糖Sigma-AldrichG8270
血红素Sigma-AldrichH9039
HEPESAlfa AesarA14777
异丁酸Alfa AesarL04038
异戊酸Alfa AesarA18642
六水氯化镁 (MgCl2•6H2O)Sigma-AldrichM8266
四水氯化锰 (MnCl2•4H2O)Sigma-Aldrich221279
烟酸（尼克酸）Sigma-AldrichN4126
六水氯化镍(II) (NiCl2•6H2O)Alfa AesarA14366有毒
正戊酸Sigma-Aldrich240370
对氨基苯甲酸MP China102569有毒，有刺激性
磷酸 (H3PO4)Sigma-AldrichP5811
磷酸二氢钾 (KH2PO4)Sigma-AldrichP5504
磷酸氢二钾 (K2HPO4)Sigma-Aldrich1551128
吡哆醇Alfa AesarA12041
刃天青Sigma-AldrichR7017
核黄素Alfa AesarA11764
碳酸钠 (Na2CO3)Sigma-Aldrich1613757
氯化钠 (NaCl)Fisher BioReagents7647-14-5
氢氧化钠 (NaOH)Fisher ChemicalsS320
二水钼酸钠 (Na2MoO4•2H2O)Acros organics206375000
盐酸硫胺（硫胺盐酸盐）Acros organics148991000
胰蛋白胨BD Biosciences211921
维生素B12Sigma-AldrichV2876
酵母提取物Sigma-Aldrich70161
七水硫酸锌 (ZnSO4•7H2O)Sigma-AldrichZ0251
0.22 µm 微孔滤膜
AMPure 磁性纯化珠Agencourt
带培养箱的厌氧室Forma 厌氧系统，Thermo Scientific，美国
瓶式滤器Corning
纱布
Illumina MiSeq 测序仪MiSeq 试剂盒 v3
pH 计
Qiagen PowerFecal 试剂盒Qiagen
微生物生态学定量分析软件 (QIIME)
Qubit-3 荧光计InVitrogen
涡旋振荡器Thermoscientific
Waters-2695 Alliance 高效液相色谱系统Waters Corporation

参考文献

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