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用于增强神经化学检测的金纳米颗粒修饰碳纤维微电极

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DOI：

10.3791/59552

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2019年5月13日

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1Department of Chemistry, American University, 2Center for Behavioral Neuroscience, American University

本文内容

摘要

在本研究中，我们使用金纳米颗粒修饰碳纤维微电极，以提高神经递质检测的灵敏度。

摘要

30 多年来，碳纤维微电极（CFMEs）一直是神经递质检测的标准工具。通常，将碳纤维吸入玻璃毛细管中，拉制成细锥形，然后用环氧树脂密封，制成用于快速扫描循环伏安法检测的电极材料。然而，裸碳纤维微电极的使用存在若干局限性。首先，碳纤维主要由基面碳构成，其表面积相对较小，灵敏度低于其他纳米材料。此外，石墨碳在时间分辨率方面受限，且导电性相对较低。最后，已知神经化学物质和大分子会在碳电极表面发生污染，形成非导电性聚合物，阻碍神经递质的进一步吸附。在本研究中，我们通过在碳纤维微电极表面修饰金纳米颗粒，以增强快速扫描循环伏安法对神经化学物质的检测性能。Au3+通过电沉积或浸涂法从胶体溶液中沉积到CFMEs表面。由于金是一种稳定且相对惰性的金属，因此是神经化学物质分析检测的理想电极材料。金纳米颗粒修饰的电极（AuNP-CFMEs）对多巴胺的响应稳定性超过4小时。此外，与未修饰的裸CFMEs相比，AuNP-CFMEs表现出更高的灵敏度（循环伏安图中更高的氧化峰电流）和更快的电子转移动力学（更低的ΔEP或峰分离）。AuNP-CFMEs的开发为检测多巴胺浓度及其他神经化学物质的快速变化提供了新型电化学传感器，并实现了更低的检测限。该研究对提升神经化学检测技术具有广泛的应用前景。金纳米颗粒修饰CFMEs的制备对于开发新型电极传感器至关重要，可用于在啮齿类及其他动物模型中活体检测神经递质，以研究药物滥用、抑郁症、中风、缺血及其他行为与疾病状态下的神经化学效应。

引言

碳纤维微电极（CFMEs）1 最适合作为生物传感器，用于检测多种重要神经递质的氧化反应2，包括多巴胺3去甲肾上腺素4，5-羟色胺5腺苷6，组胺7以及其他8碳纤维的生物相容性和尺寸使其成为植入的理想选择，与较大的标准电极相比，可显著减少对组织的损伤。9 已知碳纤维微电极（CFMEs）具有优良的电化学特性，当与快速电化学技术（最常用的是快速扫描循环伏安法，FSCV）联用时，能够实现快速测量。10,11FSCV 是一种快速扫描施加电位的技术，可为特定分析物提供特有的循环伏安图。12,13快速扫描产生的大充电电流在碳纤维上是稳定的，可通过背景扣除获得特异的循环伏安图。

由于多巴胺具有理想的电化学性质及其在神经生物学中的重要性，它已被广泛研究。儿茶酚胺类神经递质多巴胺是一种关键的化学信使，在神经系统中对运动、记忆、认知和情绪的调控起着核心作用。多巴胺的过剩或缺乏可导致多种神经和心理障碍，其中包括帕金森病、精神分裂症以及成瘾行为。目前，帕金森病仍是一种常见疾病，其病因是参与多巴胺合成的中脑神经元发生退化14。帕金森病的症状包括震颤、运动迟缓、肌肉僵硬以及平衡障碍。另一方面，可卡因15 和苯丙胺16,17 等兴奋剂会促进多巴胺的过量释放。药物滥用最终会取代多巴胺的正常释放模式，使大脑适应并依赖过量的多巴胺，从而导致成瘾行为。

近年来，人们越来越重视提高电极在神经递质检测中的功能性能18。提高电极灵敏度最广泛使用的方法是通过在纤维表面进行涂层。然而，关于在碳纤维上电沉积金属纳米颗粒的研究却十分有限19。贵金属纳米颗粒（如金）可与其他功能材料一起电沉积到纤维表面20，例如，增加可用于神经递质吸附的电活性表面积。电沉积的金属纳米颗粒形成迅速，可被纯化，并能牢固附着于碳纤维上。电化学方法在贵金属纳米颗粒的沉积以及碳纤维表面性能增强方面仍具有重要意义，因为它能够控制这些纳米颗粒的成核与生长过程。此外，利用金属纳米颗粒进行电分析还具有催化性和导电性增强、传质性能改善等其他优势。

美国大学的高级实验课程（实验生物化学 I 和 II，CHEM 471/671-472/672）综合了分析化学、物理化学和生物化学实验内容。第一学期主要介绍各类实验技术的基本概述；第二学期则由学生主导并开展研究项目21。在以往的项目中，学生曾研究生物分子、蛋白质、多肽及氨基酸介导的金纳米颗粒合成机制22,23。近期工作则聚焦于电极表面金纳米颗粒（AuNP）的形成，以及AuNPs对碳纤维微电极（CFMEs）检测神经递质能力的影响评估。本研究中，实验室应用该技术证明，通过在纤维表面电沉积AuNP，可增强CFMEs检测多巴胺氧化的灵敏度。每个裸露的CFME在检测多巴胺氧化电流时，均通过改变扫描速率、稳定性和多巴胺浓度进行表征，以测量多巴胺在CFME表面的氧化行为。随后，将Au3+电化学还原为Au0，并同时以纳米颗粒形式电沉积至纤维表面，继而进行一系列表征实验。经过直接比较，发现AuNP修饰的CFMEs具有更高的多巴胺检测灵敏度。通过电沉积在纤维表面形成的均匀AuNP涂层增大了电活性表面积，从而增强了多巴胺在修饰电极表面的吸附，导致更高的多巴胺氧化电流。此外，AuNP-CFMEs的多巴胺氧化峰与还原峰之间的电位差（∆Ep）更小，表明其电子转移动力学更快。本研究的后续工作将包括对裸露CFMEs和AuNP-CFMEs在活体条件下检测多巴胺的性能进行测试。

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方案

1. 碳纤维微电极的构建

  1. 碳纤维的制备
    1. 为了制备碳纤维微电极，首先使用手、手套和刮刀逐一分离碳纤维（碳纤维，直径7 μm）。
    2. 从绞合的纱线中拉出一根纤维。
    3. 将分离出的一根碳纤维吸入玻璃毛细管中（单通道硼硅酸盐毛细玻璃管，无内丝，外径1.2 mm，内径0.68 mm）。
    4. 通过裁剪一块长约10 cm、宽约25 cm的纸板，制备用于电极的电极夹持器。
  2. 使用垂直毛细管拉制仪拉制电极。
  3. 打开垂直毛细管拉制仪的滑动门。
  4. 逆时针旋转钻夹头，松开并取下金属夹持杆，留出足够空间以插入玻璃毛细管。
  5. 将玻璃毛细管插入电极夹持器中。手动将玻璃毛细管向上推至垂直毛细管拉制仪的顶部。
  6. 顺时针拧紧钻夹头，固定玻璃毛细管，注意不要折断或破碎玻璃毛细管。
  7. 将加热器1、加热器2和磁铁的设置调节至制造商推荐的水平，以通过加热、压力和重力将玻璃毛细管拉制成适合电极材料的细锥形。
  8. 按下红色启动按钮，加热线圈，利用压力、重力和加热作用拉制电极。
  9. 等待线圈从发红状态冷却。用剪刀从上到下剪断连接两个拉制后电极的碳纤维。采用钻夹头方法，逆时针旋转，将玻璃毛细管从垂直毛细管拉制仪中取出。

2. 碳纤维微电极的制备

  1. 在体视显微镜或显微镜下，使用手术剪刀或锋利的剃刀片将从玻璃毛细管表面伸出的碳纤维切割至约 100–150 μm 的长度。
  2. 取 10 g 环氧树脂与 0.2 mL 固化剂加入 25 mL 小瓶中，用棉签混合均匀，配制环氧溶液。
  3. 将每个电极的尖端浸入环氧树脂与固化剂的混合溶液中约 15 秒。
  4. 将上述碳纤维微电极顶端浸入丙酮中约 3 秒，以洗去电极杆上残留的多余环氧树脂。

3. 电沉积

  1. 使用显微操作器将工作电极（碳纤维微电极）和参比电极（银-氯化银电极，Ag/AgCl）置于含有 0.5 mM HAuCl4 的溶液中。
  2. 将工作电极和参比电极连接至恒电位仪和前置放大器。
  3. 打开 UNC HDCV 软件。在软件中更改设置以施加波形。在计算机设置中输入以下波形参数：在含有 0.5 mM HAuCl4 的 0.1 M KCl 溶液中，以 50 mV/s 的扫描速率，从 0.2 V 扫描至 −1.0 V，共进行 10 个循环。按下绿色箭头以施加波形，然后按下开始按钮以开始记录测量数据。

4. 扫描电子显微镜

注意：使用扫描电子显微镜（SEM）对裸露的和经金纳米颗粒修饰的碳纤维微电极进行成像。将样品加载到黑色导电胶带上，并按照制造商提供的说明进行操作。

  1. 开启仪器
    1. 将钥匙转至 START 位置后松开。
    2. 通过双击打开 InTouchScope 软件。
    3. 松开钥匙，钥匙应自动回到 I 符号位置。
    4. 等待 EVAC 按钮停止闪烁。
    5. 当 EVAC 按钮停止闪烁后，按下 VENT 按钮。
    6. 等待 VENT 按钮停止闪烁。
    7. 确保工作距离（WD）处于 20 mm – 30 mm 范围内。
    8. 等待期间，准备样品。
  2. 扫描
    1. 当 VENT 按钮停止闪烁后，将样品装入仪器中。
    2. 装载样品时，确保样品 holder 的弯曲部分朝向仪器内部。
    3. 样品装载完成后，按下 EVAC 按钮。
    4. 将工作距离调整至 10 mm。
    5. 当 EVAC 按钮停止闪烁后，打开计算机。
    6. 点击桌面上的 In Touch Scope 软件。存在两个 In Touch Scope 软件图标，请点击无绿色和黄色圆圈标识的那一个。
    7. 软件启动后，点击屏幕右上方的 OBSERVE 按钮以开启电子束。在点击 OBSERVE 前，需确认 EVAC 按钮已停止闪烁。
    8. 开始分析样品。
    9. 确保电压、工作距离（WD）和探针电流（PC）设置处于可接受范围内。
    10. 放大倍数较低时（约 50X）应缩小视野，较高倍数时则放大视野。
    11. 将工作距离设定为 10 mm。
    12. 在拍摄样品图像前，确保图像将保存至目标文件夹。
    13. 如需选择目标文件夹，请点击屏幕左上方的设置按钮。
    14. 通过 U 盘将图像从计算机导出。
  3. 关闭仪器
    1. 点击 OBSERVE 按钮以关闭电子束。
    2. 按下 VENT 按钮，并等待其停止闪烁。
    3. 在等待 VENT 按钮停止闪烁的同时，将工作距离调回 20 mm – 30 mm。
    4. 当 VENT 按钮停止闪烁后，从仪器中取出样品。
    5. 按下 EVAC 按钮，并等待其停止闪烁。
    6. 当 EVAC 按钮停止闪烁后，退出软件并关闭计算机。
    7. 将钥匙转至 O 符号位置，彻底关闭仪器。

5. 快速扫描循环伏安法测试

  1. 将碳纤维微电极连接至恒电位仪和前置放大器，并同时连接 Ag/AgCl 参比电极。
  2. 使用显微操作器，通过手动调节 X、Y 和 Z 方向的测量旋钮，将碳纤维微电极缓慢下降至流动池孔中。
  3. 用去离子水配制缓冲液（131.5 mM NaCl、3.25 mM KCl、1.2 mM CaCl2、1.25 mM NaH2PO4、1.2 mM MgCl2 和 2.0 mM Na2SO4，调节 pH 至 7.4）。
  4. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液（pH = 7.4）填充流动池。
  5. 使用装满 60 mL 缓冲液的注射器，以约 1 mL/min 的流速将 PBS 缓冲液注入流动池。
  6. 将电极放入流动池中，按下绿色按钮施加波形。观察示波器，必要时剪短电极或调节增益以防止信号过载。每次电极运行之间需平衡约 10 分钟。
  7. 将默认波形设置为多巴胺检测波形。扫描范围为 –0.4 V 至 1.3 V，频率为 10 Hz，扫描速率为 400 V/s。
  8. 用高氯酸配制 10 mM 的多巴胺、5-羟色胺、去甲肾上腺素及其他物质的储备液。使用移液器将 1 μM 多巴胺储备液加入 10 mL PBS 缓冲液中，稀释神经化学物质至终浓度 1 μM。
  9. 开始测量时，按下记录按钮。10 秒后，向流动池中注入 0.2 mL 的 1 μM 多巴胺溶液，或其他浓度的神经递质。根据需要调整浓度、扫描速率和波形（保持电位或切换电位）。设定总运行时间为 30 秒。
  10. 使用 HDCV 分析软件对运行数据进行分析。根据需要更改参数。
  11. 实验结束后，通过向流动池的缓冲液和进样端口分别注入 3 mL 水和空气，重复三次，以清洗流动池。
  12. 关闭波形输出及仪器电源。

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结果

对于图1，我们展示了一个示意图，其中使用快速扫描循环伏安法（FSCV）检测来体外测量神经递质的浓度。图1显示了所施加的多巴胺伏安波形。该三角波形以400 V/s的扫描速率从-0.4 V扫描至1.3 V。在图的左侧第二部分，展示了多巴胺氧化为多巴胺邻醌（DOQ）的过程，这是一个分析物表面向电极表面发生双电子转移的过程。最后，电流-时间曲线与彩色图谱叠加显示。电流-时间曲线代表了多巴胺的氧化过程：当无多巴胺氧化发生时，曲线呈平坦状态；当多巴胺被氧化为多巴胺邻醌，并随着分析物在电极表面吸附和随后脱附而被还原回多巴胺时，曲线则垂直上升。彩色图谱是电流的三维图示，其中黄色代表背景电流（接近零），绿色代表正向氧化电流（多巴胺氧化为多巴胺邻醌），蓝色代表负向还原电流（多巴胺邻醌还原为多巴胺）。

采用扫描电子显微镜（SEM）对未修饰和修饰后的碳电极表...

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讨论

本研究展示了一种构建金纳米颗粒修饰碳纤维微电极的新方法，用于通过快速扫描循环伏安法检测多巴胺等神经递质。该方法是一种高效、环保且相对经济的手段，可提高生物分子检测的灵敏度。通过控制电沉积时间和电沉积溶液中金的浓度，可调控沉积在碳纤维表面的金层厚度。与未修饰的裸电极相比，金修饰的碳纤维微电极具有显著更大的电活性表面积和更快的电子转移动力学。此外，其灵敏度更高，检测限更低。同时，在流动池中测试至少4小时后，这些电极对多巴胺检测表现出良好的稳定性。对于金修饰碳纤维电极，多巴胺检测的峰值氧化电流在扫描速率和浓度方面均呈现线性响应，表明电极表面的吸附过程起主导控制作用。

该实验方案的关键步骤包括使用垂直毛细管拉制仪拉制碳纤维微电极，以及通过环氧树脂实现玻璃毛细管与碳纤维之间的界面粘附。此外，在碳纤维表面进行金的电沉积具有较大挑战性，关键在于需在电极表面形成一层薄而均匀的金镀层，同时避免金的过度沉积，否则将因噪声和信号过载而影响神经递质的检测。方法的优化与故障排除包括针对电沉积的时间和浓度参数进行条件优化。实验中应尝试使用不同来源的金（如 AuCl3、HAuCl...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢美国大学、教员研究支持资助、NASA DC空间资助以及NSF-MRI#1625977项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
盐酸多巴胺Sigma AldrichH8502-5G
磷酸盐缓冲液Sigma AldrichP5493-1L
Pine WaveNeuro 恒电位仪Pine InstrumentsNEC-WN-BASIC此订单为批量采购，包含所有其他配件，如前置放大器、适配器、线缆及其他电子组件
Pine 流通池与微操纵器Pine InstrumentsNEC-FLOW-1此亦为批量订单，包含微操纵器、流通池、旋钮、管路、连接器等
玻璃毛细管A-M Systems602500
T-650 碳纤维GoodfellowC 005711
Epon 828 环氧树脂Miller-StephensonEPON 828 TDS
二亚乙基三胺Sigma AldrichD93856-5ML
三氯化金Sigma Aldrich254169以 HAuCl4 或 AuCl3 形式提供
pH 计FisherS90528
法拉第屏蔽笼AMETEK TMC81-334-03
注射泵NEW ERA PUMPNE-1000
Eppendorf 移液器及吸头Eppendorf2231000222此亦为包含多种移液器及吸头的批量订单
10 - 1,000 mL 烧杯VWR10536-390
碳纤维GoodfellowC 005711
扫描电子显微镜（SEM）JEOLJSM-IT100

参考文献

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