11C标记SNAP-7941的自动化合成与实时动力学评价的技术要点

摘要

本文介绍了一种全自动放射性标记[¹¹C]SNAP-7941的实验方案，以及对该PET示踪剂在P-糖蛋白表达与非表达细胞中实时动力学的分析方法。

摘要

正电子发射断层扫描（PET）是一种重要的分子成像技术，可通过使用特异性靶向放射性配体进行体内研究，从而揭示生物通路的活动情况。本实验方案描述了一种稳定且可靠的远程控制放射性合成方法，用于合成 [¹¹C]SNAP-7941，该化合物为黑素浓集激素受体1（melanin-concentrating hormone receptor 1）的拮抗剂。放射性合成起始于回旋加速器产生的 [¹¹C]CO₂，随后通过气相转化进一步反应生成 [¹¹C]CH₃OTf。然后将该活性中间体引入前体溶液中，生成相应的放射性示踪剂。化学纯度和放射化学纯度均通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）进行测定，该方法常规应用于放射性药物的质量控制过程。此外，还需计算摩尔活度，因其是后续实时动力学研究的必要参数。进一步地，将 [¹¹C]SNAP-7941 应用于 MDCKII-WT 和 MDCKII-hMDR1 细胞，以评估P-糖蛋白（P-gp）表达对细胞摄取的影响。为此，使用表达P-糖蛋白的细胞系（MDCKII-hMDR1），在实验前不加或加入P-糖蛋白底物（±）-维拉帕米进行阻断处理，并将结果与野生型细胞的实验结果进行比较。整个实验设计凸显了精确时间管理的重要性，这对于所有使用短半衰期核素（如碳-11，半衰期：20分钟）标记的PET示踪剂开展的临床前和临床研究均至关重要。

引言

[¹¹C]SNAP-7941 被开发为首个靶向黑色素浓集激素受体1（MCHR1）的正电子发射断层扫描（PET）示踪剂——该受体主要参与食欲和摄食行为的中枢调控¹碳-11标记的SNAP-7941是一种特性明确的MCHR1拮抗剂，由此获得了真正的PET示踪剂^2,3,4,5然而，由于短寿命放射性核素碳-11的半衰期仅为20分钟，其实现完全自动化的放射性合成在时间效率和可重复性方面均面临极大挑战。⁶总合成时间应尽可能缩短，一般不应超过2-3个半衰期（对于碳-11而言，约为40-60分钟）。⁷特别是，针对表达密度较低的受体系统的放射性示踪剂的合成工艺必须经过充分优化，以获得足够的产率，进而实现高摩尔活性⁸. 合成策略通常是在回旋加速器内产生放射性核素并释放[¹¹C]CO₂ 到合成器。在那里，[¹¹C]CO₂ 首先被还原为[¹¹C]CH₄ 随后与碘反应生成[¹¹C]CH₃我 通过 气相法^9,10。进一步用三氟甲磺酸银处理得到[¹¹C]CH₃将OTf直接在线引入。随后，将这种具有放射性碳-11标记的活性中间体加入含有前体分子的溶液中。自动化放射性合成还包括使用半制备型反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，以及后续制备适用于临床前和临床研究的终产物。

无论放射性核素的半衰期长短或放射性合成所需时间如何，放射性药物的药代动力学都是PET示踪剂研发过程中最关键的评价环节。在神经影像学领域，PET示踪剂进入大脑是主要前提。然而，血脑屏障（BBB）作为一种 "安全边界" 脑组织高表达外排转运蛋白，可将小分子（如PET示踪剂）排出，从而有效限制其应用。

在临床前评价过程中，一个巨大的缺陷是这些外排转运蛋白的意外相互作用，这些相互作用通常在体外实验中未被识别，导致PET示踪剂在体内的失败，如[¹¹C]SNAP-7941所观察到的情况。在大鼠中进行的µPET成像显示脑内摄取量较低，而在给予P-糖蛋白（P-gp）抑制剂他利喹达后，脑内摄取显著增加¹¹。这些数据表明，[¹¹C]SNAP-7941是该外排转运系统的一种底物，从而阻碍了配体与中枢MCHR1的结合。遗憾的是，目前仍然缺乏能够在示踪剂开发早期阶段预测血脑屏障（BBB）穿透能力的合适体外模型。

本文介绍了使用碳-11甲基化合成仪实现[¹¹C]SNAP-7941的自动化合成。本研究的重点是概述如何组织一系列连续的实验流程，包括自动化合成、质量控制以及利用半衰期极短的碳-11核素进行后续的体外评价。

首先，介绍实现成功放射性合成的关键步骤，以最小的时间消耗获得最大的产率。然后，建立可靠的质控程序，使放射性示踪剂可用于潜在的临床研究，并满足《欧洲药典》¹²的要求。摩尔浓度的定量及相应比活度的计算，是后续动力学测量的基本要求。

最后，本文介绍了一种新的、简便的体外方法，用于评估 [¹¹C]SNAP-7941 与外排转运蛋白 P-糖蛋白（P-gp，hMDR1）之间的相互作用。所提出的动力学模型采用一种易于操作的装置，可实现数据的即时解读，且所需的细胞培养工作量极小¹³。

方案

警告：以下方案包含多个涉及放射性物质操作和处理的步骤。所有步骤必须符合研究所辐射安全部门及相应国家法律法规的要求。必须遵循ALARA（“合理可行尽量低”）原则，最大限度地减少操作人员受到的电离辐射暴露。

1. 实验的时间管理与规划

注意：碳-11的半衰期较短，因此需要精确的时间管理以尽量减少放射性损失（图1）。所有参与人员必须明确各自的职责以及相应操作的时间节点。为顺利开展[¹¹C]SNAP-7941的实时动力学实验，大约需要四名人员协同工作。

1. 安排一名生产人员负责 [¹¹C]SNAP-7941 的制备。
2. 通知质量控制操作人员，使其在合成开始时进行质量标准评估，并计算质量浓度和摩尔活度。
3. 安排实时动力学实验人员准备进行稀释计算并执行实验。
4. 指示传递人员在指定时间点将放射性物质转移至相应位置。

2. 用于临床前研究的 [¹¹C]SNAP-7941 的自动化合成

1. 合成仪的准备（图2）。
   1. 打开合成仪，开启所需的技术气体（氦气和氢气），并启动合成仪控制软件 Tracerlab. 选择相应的合成序列 快照.
   2. 用纯水洗涤 V1-V3 一次，再用丙酮洗涤两次 通过 将反应器和HPLC阀置于上样或进样位置，使液体流入环路废液瓶。
   3. 干燥反应器的所有进出管道 通过 带有持续氦气流的注射阀 通过 V18.
   4. 加热[¹¹C]CH₃我捕获以及[¹¹C]CH₃在100 mL·min⁻¹的氦气流中使用OTf陷阱^-1 高达 200 °C 通过 V24、V25、V29、V15、V9、V17 和带分离反应器的 V32/V33
   5. 用100 mL·min的氦气流检查相同路径（带连接反应器）是否存在泄漏^-1当流速降至4 mL·min以下时，可确保密封性^-1.
   6. 打开高效液相色谱泵（5-10 mL·min⁻¹）^-1）用乙腈/水（50/50，v/v）冲洗HPLC管路和进样阀，并用HPLC溶剂冲洗HPLC管路 通过 V14 注入灯泡中。
   7. 排空球囊 通过 将V11和V12用氦气流吹入废液瓶中 通过 V19. 再次使用来自 V6 的水洗涤相应的线路 通过 V11 和 V12 用氦气流 通过 V18.
   8. 用乙醇洗涤 V5，用水洗涤 V4 通过 将V11和V12通过氦气流导入产物收集瓶（PCV） 通过 V18，然后排空PCV 通过 V13 通入氦气流至废液瓶 通过 V20.
   9. 关闭高效液相色谱泵，切换至合成所用溶剂（2.5 g·L⁻¹乙酸铵水溶液）^-1)/乙酸 97.5/2.5 v/v；pH 3.5)/乙腈 75/25 v/v），连接半制备型高效液相色谱柱并平衡色谱柱（流速为 5 mL·min⁻¹）^-1).
   10. 加入用于合成和纯化的试剂：1.5 mL 水（V2）、4.5 mL 0.9% NaCl（V4）、0.5 mL 96% 乙醇（V5）、10 mL 水（V6）以及 90 mL 水（ bulb）。
   11. 连接新的废液环路收集管；将产品收集管（已标记并装有通气针）连接至 V13 和液氮。
   12. 使用10 mL 96%乙醇和20 mL水预处理固相萃取（SPE）小柱，并将其连接在V11和V12之间。
   13. 在开始合成前20分钟启动预运行程序，包括加热[¹¹C]CO₂ 升温至400 °C，并以50 mL·min⁻¹的氦气流冲洗捕集阱^-1 通过 V27（2 分钟）。然后，预冲洗 [¹¹C]CO₂ 用氢气（120 mL·min⁻¹）捕获3分钟^-1) 最后冷却至 40 °C 以下。
   14. 将1 mg前体溶解于400 µL乙腈中（用于DNA合成， < 10 H₂O)，将溶液转移至反应体系中，并加入5.5 µL TBAH（264 mg·mL⁻¹）^-1 在甲醇中）。将反应器连接至相应位置。
   15. 关闭热室并启动热室的负压系统。
   16. 确认 CH 冷却过程的开始₄ 用液氮冷冻至 -75 °C。
   17. 当达到温度时，释放放射性物质。
2. 回旋加速器生产[¹¹C]CO₂
   注意：步骤 2.2.1–2.2.4 与放射合成模块的准备工作同时进行（另见 图1).
   1. 打开回旋加速器的磁体。
   2. 选择目标 ¹¹C-CO₂ 并启动光束 65 µA.
   3. 通过按下按钮确认辐照开始 开始照射
   4. 停止射束，并通过按下按钮确认放射性物质已释放至合成仪中 递送在达到所需的放射性活度后（约30分钟内达到120 GBq）。
3. 全自动放射性合成的执行
   1. 确认系统已准备就绪，可以接收放射性物质，并启动自动化流程
   2. 监控以下自动化流程。
      1. 检查 [¹¹C]CO₂ 从回旋加速器自动转移至合成单元 通过 V26（约 4 分钟），且 [¹¹C]CO₂ 被截留在浸渍有镍作为催化剂的分子筛上（[¹¹C]CO₂ 室温下捕获）
      2. 追踪是否 [¹¹C]CO₂ trap 首先用氦气自动冲洗（50 mL·min⁻¹）^-1）随后用氢气（120 mL·min⁻¹）^-1）。然后观察到 V27 和 V25 处于关闭状态，且被截留的[¹¹C]CO₂ 包括将氢气加热至 400 °C 以及所形成的 [¹¹C]CH₄ 被进一步转运至预冷的[¹¹C]CH₄ 捕获并困于其中。
      3. 监测 V10 是否关闭，V9 是否打开（朝向碘柱）以及 [¹¹C]CH₄ 再次通过加热释放[¹¹C]CH₄ 以氦气流缓慢加热至80 °C，并输送至循环单元 通过 V10（排气出口）。并进一步检查是否[¹¹C]CH₄ 转化为[¹¹C]CH₃在循环单元内，持续约3 min，形成的[¹¹C]CH₃I 被持续捕获在[¹¹C]CH₃我捕获。
      4. 确保排气阀 V16 已打开且 [¹¹C]CH₃I型捕集阱用氦气（20 mL·min⁻¹）流在90 °C下加热^-1通过V24去除可能的副产物，然后关闭V16。
   3. 确认 [¹¹C]CH₃I 已准备就绪，可释放至反应器中。
   4. 监控以下自动化流程：检查 [¹¹C]CH₃I型陷阱加热至190 °C，生成的[¹¹C]CH₃I 被释放到反应器中 通过 [¹¹C]CH₃OTf捕获阱（V32和V33，仍保持在200 °C）、V7和V8，在持续氦气流（10–25 mL·min⁻¹）下^-1在此过程中，V21 和 V23（排气出口）必须保持开启。
   5. 确认放射性物质已到达反应器，当反应器内放射性活度不再升高时。
   6. 监控以下自动化流程，并在必要时准备进行人工干预
      1. 检查 V23、V21 和 V8 是否自动关闭，并将反应混合物加热至 75 °C。3 分钟后，观察反应器是否用液氮冷却至温度低于 35 °C。随后，确保用 1.5 mL 水淬灭反应混合物。 通过 V2。在此过程中，V21 和 V23（排气出口）必须打开。
      2. 记录 V21 和 V23 是否关闭，反应混合物是否通过流体检测器进入 HPLC 进样阀并转移至 HPLC 进样环（5 mL）。记录反应混合物是否被自动注入 HPLC 色谱柱。
   7. 观察色谱图，并手动切割产物峰 通过 按钮 峰起始点. 按压 峰值-末端法则 当产物峰信号在约8-10分钟保留时间后降至约400 cps以下时（流速：5 mL·min⁻¹）^-1, 图3).
   8. 打开额外的氦气流以加速灯泡排空。
   9. 监测球囊是否排空并观察废液瓶：检查球囊是否已排空 通过 V11、固相萃取小柱和V12中的物质通过V19及额外的氦气管路，用氦气流排入废液，前提是产物保留在固相萃取小柱上。
   10. 确认灯泡已完全排空。
   11. 监测固相萃取纯化与产物转移的自动化过程
       1. 检查SPE小柱是否已用10 mL水洗涤 通过 将V6、V11和V12收集至废液管中，若乙醇将产物洗脱至PCV中 通过 V5、V11 和 V12。最后，观察是否将 0.9% NaCl 加入 PCV 通过 V4、V11 和 V12 用于稀释产物。
       2. 确保将产物溶液转移 通过 V13 和一个无菌滤器通过氦气流注入最终产品小瓶中 通过 V20.
   12. 确认产物已完全转移。

3. 质量控制（QC）

注意：放射性药物的质量控制包括测量以下参数：

• 放射化学纯度和摩尔活度（RP-HPLC）
• 残留溶剂（气相色谱法，GC）
• 渗透压（蒸气压渗透压计）
• pH值（pH计）
• γ能谱/放射性核素纯度（γ能谱仪）
• 半衰期/放射性核素纯度（活度计）

所有理化参数均需在产品放行前进行测定，且其数值必须处于规定的质量参数范围内。

1. 质量控制设备的准备
   1. 在合成结束前30分钟开始准备。
   2. 在铅屏蔽容器中准备一个锥形小瓶，并准备一支带针头的屏蔽1 mL注射器。
   3. 为高效液相色谱（HPLC）制备SNAP-7941的水溶液参考标准品（10 µg·mL^-1）。
   4. 开启pH计、气相色谱仪及其所用气体、渗透压仪以及高效液相色谱系统的全部组件。
   5. 启动HPLC控制软件，选择用于[¹¹C]SNAP-7941分析的专用色谱柱及相应方法（流动相：(水/乙酸 97.5/2.5 v/v；2.5 g·L^-1 醋酸铵；pH 3.5)/乙腈 70/30 v/v；流速：1 mL·min^-1），并编写包含两次进样的样品列表（标准品和产品）。启动方法以平衡色谱柱。
   6. 在平衡10分钟后，使用Hamilton注射器注入20 µL SNAP-7941参考溶液，并开始分析运行。
   7. 进样后用乙腈和水各清洗Hamilton注射器两次。
   8. 启动GC控制软件并编写样品列表。
2. 执行质量控制
   1. 合成结束后测量产品的绝对放射性产额，并使用已准备好的铅屏蔽注射器将100 µL产品转移至反应小瓶中用于质量控制。
      注：所有从质量控制中获得的数据必须按照国家法规进行记录。
   2. 分析型HPLC：测定产品的放射化学纯度和化学纯度，并立即将结果通知负责细胞培养实验的人员。
      1. 吸取40 µL质量控制样品并注入HPLC系统。通过将进样阀的手柄从Load位置移动到Inject位置来启动运行（图3）。
         注：在运行期间（8分钟），可同时进行本方案中的其他检测项目，以尽量减少放射性衰变损失。
      2. 打开色谱图，在放射性信号通道中对所有峰进行积分。将产品峰的保留时间（5.0–7.0分钟）与参考标准品的保留时间进行比较。比较各积分峰面积占总面积的百分比。产品峰面积应占总积分面积（放射性通道）的95%以上（即放射化学纯度）。
      3. 对紫外（UV）通道信号进行积分以确定化学纯度。主要杂质通常为前体SNAP酸，其保留时间为2.8–3.5分钟。根据积分结果和标准曲线计算[^natC]SNAP-7941的浓度。计算SNAP-7941的浓度（单位：µmol·mL^-1），并通过以下公式确定摩尔活度：
         
   3. 气相色谱分析：将20 µL质量控制样品转移至专用玻璃小瓶中，放入自动进样器并启动测量。测量完成后，打开色谱图并记录自动积分所得的峰数值。样品中乙腈含量不得超过410 ppm，乙醇含量不得超过10%。
   4. 渗透压：将纸样圆片置于专用凹槽中，加入10 µL样品。按下Close按钮开始测量渗透压。3分钟后，仪器显示渗透压值，其应在190–500 mosm·kg^-1范围内。
   5. pH值：用水清洗电极，将电极浸入样品中测量pH值。pH值应在5.0–8.5范围内。测量后再次清洗电极，并将电极置于标准pH参比溶液中保存。
   6. γ能谱：将质量控制样品放入γ能谱仪中，打开控制软件并开始测量。测量结束后停止采集，记录测得的能量值，应为511 keV（范围420–520 keV）。打开文件菜单，以相应的批号保存文件。在专用软件中调取已保存的能谱图并打印输出。
   7. 半衰期：使用活度计对质量控制样品进行两次活度测量，记录每次测量的时间，通过指数衰变公式计算半衰期。
3. 放行
   1. 在所有参数检测完成且结果符合奥地利监管机构指南后，方可放行该放射性示踪剂。操作人员须签署确认数据的准确性。

4. P-糖蛋白转运体相互作用的评估

1. 细胞培养
   1. 启动工作台的层流空气系统（LAF），并在开始操作前至少15分钟对操作台面进行清洁。
   2. 在层流空气系统（LAF）中，于无菌条件下使用无菌移液管和自动移液辅助装置，将细胞培养基与10%胎牛血清（FCS，50 mL）和0.5%抗生素（2.5 mL）混合均匀。
   3. 复苏MDCKII-hMDR1和MDCKII-WT细胞，并在无菌条件（LAF）下提前10至14天于T75或T175细胞培养瓶中进行培养。
   4. 次日更换培养基，以去除所有未贴壁及凋亡的细胞。
   5. 每隔三天更换一次新鲜培养基（T75培养瓶加12 mL，T175培养瓶加23 mL）。
   6. 根据实验时间安排，在细胞融合度达到80%时将细胞按比例传代至新的培养瓶或培养皿中，以避免形成双层生长。
2. 实验前细胞准备
   1. 实验前两天进行细胞传代，以每2 mL 2.5 × 10⁵个细胞的浓度接种于细胞培养皿的斜面位置（图4）。使用自动细胞计数仪或Neubauer计数板对细胞进行计数，并计算合适的传代比例。
   2. 实验前一天移除培养基，用4 mL DPBS清洗培养皿中的细胞，然后加入5 mL新鲜细胞培养基。将培养皿水平放置于培养箱中。
   3. 实验前至少0.5小时用DPBS清洗细胞，并更换为2 mL不含FBS的培养基。使用显微镜检查细胞融合度和形态。
3. 在三种不同设置下进行实验
   1. 按照4.2.3节所述使用培养皿进行实验。
   2. 实验前0.5小时用10 µM (±)-盐酸维拉帕米处理细胞。
   3. 加入0.98 µL维拉帕米储备液（20.4 mM (±)-盐酸维拉帕米溶于DMSO中）。处理期间最终DMSO含量≤0.05%。
   4. 用溶剂对照（DMSO）孵育细胞0.5小时，所用体积与药物处理组相同。
4. 实时检测实验（适用于所有三种设置）
   1. 打开设备和计算机，确保其正确连接，然后启动控制软件。
   2. 选择单目标选项，解锁模板并调整以下设置：
      位置数量：2（两个）
      检测时间（秒）：3（三）
      检测延迟时间（秒）：2（二）
      第一阶段名称：基线
   3. 将细胞培养皿插入设备的倾斜支架中，确保细胞面朝下并被细胞培养基覆盖。
   4. 点击开始按钮启动运行。系统将提示保存文件，请选择文件名和保存路径。控制中心窗口弹出，基线测量开始（细胞培养皿支架开始旋转）。
   5. 在其他选项中选择：
      时间尺度：分钟
      核素校正：碳-11
   6. 勾选图表中的曲线下所有选项（背景信号（红色）、目标信号（蓝色）以及目标减去背景（黑色））。
   7. 获取质量控制参数：合成结束时的摩尔活度[GBq·µmol^-1]和活度浓度[MBq·mL^-1]。
   8. 计算在2 mL反应体系中达到15 nM [^natC]SNAP-7941浓度所需的示踪剂体积。
      
      
   9. 将移液器调节至相应体积，并在铅屏蔽容器中准备一份[¹¹C]SNAP-7941产物的等分试样。
   10. 在控制中心窗口中点击暂停运行。等待培养皿旋转停止，侧边栏显示标题为已暂停并进入下一阶段。
   11. 打开实时动力学设备的盖子。将培养皿支架向左旋转90°，加入计算好的示踪剂体积后恢复至初始位置。关闭设备盖子，并立即点击继续按钮以启动实验。
   12. 20分钟后选择暂停，随后终止运行（在侧边栏中点击结束运行）。
5. 使用统计软件进行数据分析与处理
   1. 打开实时控制软件，点击打开文件以调取所需的动力学数据。动力学曲线将在控制中心窗口中显示。
   2. 在动力学曲线上右键点击，选择导出曲线。保存包含原始数据的文本文件。打开统计分析程序，粘贴实时实验的原始数据文件。
   3. 以放射性示踪剂加入时刻作为时间起点（x轴），排除背景测量部分，并将信号归一化为最大CPS（每秒计数）的百分比。
   4. 将所有归一化后的数据导入一个新的GraphPad Prism文件中。
   5. 计算平均值和标准差。
   6. 以图表形式展示三种实验设置下示踪剂摄取速率（增长变化率）的差异。

结果

完全自动化的[¹¹C]SNAP-7941 的产量为 5.7 ± 2.5 GBq（EOB 时为 4.6 ± 2.0%，基于[¹¹C]CH₃OTf；n = 10）的配制产品。整个合成过程持续约40分钟，其中15分钟用于制备[¹¹C]CH₃OTf 通过 气相法需要额外5分钟完成前体的放射性标记，随后进行10分钟的半制备型反相高效液相色谱纯化，以及10分钟的C18固相萃取和制剂处理。然后，取少量样品（约100–200 µL）送交质量控制负责人，而装有即用型示踪剂的原始小瓶则交由实时动力学分析实验人员使用。

合成结束后10分钟内完成质量控制。摩尔活度为72 ± 41 GBq/µmol（n = 10），放射化学纯度始终> 95%。其他所有参数（pH值、渗透压、残留溶剂）均符合放行标准。实时动力学实验选择了三种不同的实验设置：（A）经处理与未经处理（给予溶媒）的MDCKII-WT细胞，（B）未经处理或经溶媒处理的MDCKII-hMDR1细胞，以及（C）在实时动力学检测转运体功能前，使用(±)-维拉帕米进行阻断的后者细胞系。将[¹¹C]SNAP-7941应用于野生型细胞系MDCKII-WT（不表达P-糖蛋白）和MDCKII-hMDR1（表达P-糖蛋白）时，显示出不同的动力学行为：在野生型细胞系中快速蓄积，而在MDCKII-hMDR1细胞中未观察到蓄积现象。然而，在MDCKII-hMDR1细胞中使用(±)-维拉帕米阻断P-糖蛋白外排转运体后，其实时动力学曲线与野生型细胞系所观察到的结果相似（图5）。

图1：工作流程概览。 [¹¹C]SNAP-7941的放射性合成、质量控制及实时动力学测定的工作流程。黑色箭头表示放射性物质的转运路径。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：自动合成仪的放射合成示意图。 自动合成仪的切换回路，起始于用于 [¹¹C]CH₃I/[¹¹C]CH₃OTf 生产的循环单元，随后进入将放射性引入前体溶液的反应器，以及固相萃取纯化单元（SPE = 固相萃取；PCV = 产物收集瓶）。请点击此处查看此图的放大版本。

图 3：全自动放射性合成 [¹¹C]SNAP-7841 的代表性色谱图。 上图为半制备型反相高效液相色谱（RP-HPLC）色谱图，下图为纯化后的分析型色谱图。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4：实时实验用细胞培养皿的准备。 第一步包括根据细胞类型及其生长速率，接种 2.5 × 10⁵ 至 1 × 10⁶ 个细胞。随后将培养皿置于倾斜位置（约 30–45°）。可在培养箱中使用配套的金属支架或细胞培养皿盖来固定培养皿的倾斜角度。接种后第二天（24 小时），将培养皿调整为水平位置，并加入新鲜细胞培养基，完全覆盖细胞表面。实验当天，检查细胞活力和融合度。根据实验方案，用 DPBS 洗涤细胞，更换为无血清培养基（2 mL），并将培养皿重新置于倾斜位置，直至实验开始。此后，可对细胞施加抑制剂或溶剂处理。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：[¹¹C]SNAP-7941 的实时动力学测量。 显示了在三种不同实验条件下[¹¹C]SNAP-7941 的代表性实时动力学曲线：使用 MDCKII-WT 细胞；使用经 (±)-维拉帕米（P-糖蛋白抑制剂）预处理的 MDCKII-hMDR1 细胞；以及未经阻断处理的 MDCKII-hMDR1 细胞。纵轴表示经预阻断的 MDCKII-hMDR1 细胞和 WT 细胞相对于未经处理或仅给予溶剂处理的 MDCKII-MDR1 细胞的摄取增加速率（无摄取时为 0%）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在商用合成模块上建立了[¹¹C]SNAP-7941的放射性合成方法。由于该方法可完全自动化操作，放射性合成过程被证实具有良好的可靠性，同时在操作人员的辐射防护方面也得到了改进。合成装置的准备工作对放射性示踪剂的质量具有重大影响，尤其是在摩尔活度方面。因此，必须始终在惰性气氛（例如氦气环境）下操作，并对反应容器之前的所有管路（靶线、[¹¹C]CH₃I生成回路及反应器（见图2））进行充分吹扫。此外，在开始合成前对相关捕集阱和加热炉进行预热，以去除水分和环境中的二氧化碳，有利于提高摩尔活度。特别是负载石墨化碳的AgOTf柱对湿度极为敏感，即使微量水分也会干扰[¹¹C]CH₃I向[¹¹C]CH₃OTf的转化。在开始合成前，需将[¹¹C]CO₂捕集阱和[¹¹C]CH₃I捕集阱重新冷却至室温，以确保后续捕集效果。此外，建议在开始合成前短时间内溶解前体化合物，并将碱直接加入前体溶液中。

碳-11放射性示踪剂的质量控制必须合理设计，以实现连续且快速的工作流程。然而，对于细胞培养研究而言，获得有效结果最关键的参数是放射化学纯度和摩尔活性。准确评估摩尔活性需要可靠的高效液相色谱（HPLC）分析方法，且校准曲线必须覆盖终产物的浓度范围。由于放射性合成过程中产生的量较少，放射性示踪剂面临的挑战在于实现高于定量限（LOQ）的浓度。因此，关键在于找到一个平衡点：既要保持较高的摩尔活性以避免受体饱和，又要确保浓度足够高，以便仍能定量检测非放射性信号。

[¹¹C]SNAP-7941 被证实是人 P-糖蛋白（P-gp）转运体的强效底物，因为在未经处理或溶剂处理的 MDCKII-hMDR1 细胞中未观察到其蓄积，这是由于其被快速外排所致。相比之下，两种实验设置（MDCKII-WT 细胞或预先阻断的 MDCKII-hMDR1 细胞）均得到相似的结果（[¹¹C]SNAP-7941 的蓄积），这支持了该体外 检测方法的通用性。MDCKII-hMDR1 细胞因其稳定转染、生长迅速且对旋转培养皿引起的剪切应力具有较强耐受性，因此非常适用于 LigandTracer 实验。因此，[¹¹C]SNAP-7941 在大鼠和小鼠脑组织中缺乏摄取的现象，可能是由于通过 P-gp 转运体外排所致。由于该方法使用表达人多药耐药蛋白 1（hMDR-1, P-gp）的犬肾细胞进行转染，因此在预测人源外排转运体结合方面具有较高的预测价值，这对于未来的临床应用具有积极意义。然而，截至目前，该方法对其他外排转运体的选择性尚未得到验证。因此，可采用表达其他主要外排转运体（如乳腺癌耐药蛋白（BCRP）或多药耐药蛋白-1（MRP-1））的其他细胞系，以研究待测物与这些转运体的相互作用。与传统的蓄积或转运实验相比，该方法操作极为简便，并可立即获得定性结果。此外，该技术最大的优势在于能够实时评估正电子发射断层扫描（PET）示踪剂与靶点之间的直接相互作用，而传统实验通常依赖间接定量方法（主要是竞争置换实验）。同时，实时放射性检测软件提供了较高的实验灵活性（例如，核素衰变校正、测量时间与位置设定等），从而赋予使用者较大的操作自由度。然而，该方法也存在一定的局限性，例如通量较低，因每次仅能测量一个细胞培养皿。此外，还需考虑若干其他技术与操作问题：该技术对背景辐射极为敏感，因此应将辐射源远离检测系统，并在实验前重视背景辐射的测量。另一个问题是当实验温度高于室温时，倾斜支架的加热可能导致培养基蒸发，从而影响探测器性能。建议不采用局部加热，而是将整个装置置于培养箱内。此外，该方法仅适用于贴壁细胞系。由于细胞培养皿的旋转可能引起剪切应力，对剪切应力敏感的细胞可能从培养皿上脱落，从而导致结果无效。

然而，如果实验人员注意到这些微小的缺点，该方法仍可为临床前PET示踪剂动力学行为的分析提供快速且可靠的结果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
表1：全自动放射性合成[11C]SNAP-7941所用材料与仪器列表
Ni催化剂	Shimadzu，京都，日本		Shimalilte Ni还原型，80/100目
碘	Merck，达姆施塔特，德国		1.04761.0100
乙腈	Merck，达姆施塔特，德国		用于DNA合成，< 10 ppm H2O
乙腈	Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国		HPLC级
乙酸铵	Merck，达姆施塔特，德国
乙酸	Merck，达姆施塔特，德国		冰醋酸
乙醇	Merck，达姆施塔特，德国		96%
NaCl	B. Braun，梅尔松根，德国		0.9%
四丁基氢氧化铵	Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国
甲醇	Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国		HPLC级
SPE小柱	Waters，米尔福德，马萨诸塞州，美国		SepPak C18plus
半制备型反相高效液相色谱柱	Merck，达姆施塔特，德国		Chromolith SemiPrep RP-18e，100-10 mm
保护柱	Merck，达姆施塔特，德国		Chromolith Guard RP-18e，5-4.6 mm
前体	奥地利维也纳大学		SNAP-酸
对照品	奥地利维也纳大学		SNAP-7941
三氟甲磺酸银	Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国
Graphpa GC	Alltech，迪尔菲尔德，伊利诺伊州，美国		80/100目
PET trace 860回旋加速器	GE Healthcare，乌普萨拉，瑞典
[11C]CO2高压靶	液化空气公司，维也纳，奥地利
TRACERlabFX2 C	GE Healthcare，乌普萨拉，瑞典
N2 + 1% O2	液化空气公司，维也纳，奥地利		靶气体
名称	公司	货号	备注
表2：[11C]SNAP-7941质量控制所用材料与仪器列表。
Merck Hitachi LaChrom, L-7100	Hitachi Vantara Austria GmbH（维也纳，奥地利）		HPLC泵
Merck Hitachi, L7400	Hitachi Vantara Austria GmbH（东京，日本）		紫外检测器
NaI放射性检测器	Raytest（施特劳宾哈特，德国）		NaI放射性检测器
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm	Merck（达姆施塔特，德国）		HPLC色谱柱
430-GC	Bruker（不来梅，德国）		气相色谱仪
毛细管柱 ID-BP20；12 m × 0.22 mm × 0.25 mm	SGE Ananlytical Science Pty. Ltd.（维多利亚，澳大利亚）		气体毛细管柱
Wesco，Vapro 5600渗透压仪	Sanoya Medical Systems（维也纳，奥地利）		渗透压仪
γ能谱仪			γ能谱仪
气相色谱控制软件	VARIAN（帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国）		Galaxie Version 1.9.302.952
γ能谱仪控制软件	ORTEC（橡树岭，田纳西州，美国）		Maestro for Windows Version 6.06
γ能谱数据回放软件	ORTEC（橡树岭，田纳西州，美国）		Winplots version 3.21
HPLC控制软件	Raytest（施特劳宾哈特，德国）		Gina Star Version 5.9
inolab 740	WTW（魏尔海姆，德国）		pH计
名称	公司	货号	备注
表3：评估[11C]SNAP-7941实时动力学行为所用材料与仪器列表。
Madin-Darby犬肾细胞系（MDCKII-hMDR1）	荷兰癌症研究所（NKI，阿姆斯特丹，荷兰）		表达人P-糖蛋白（hMDR1）
Madin-Darby犬肾细胞系（MDCKII-WT）	荷兰癌症研究所（NKI，阿姆斯特丹，荷兰）		野生型（WT）
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH，维也纳，奥地利		Gibco 61965-026
胎牛血清（FCS）	VWR International GmbH，维也纳，奥地利		Gibco 10270-106
青霉素/链霉素	VWR International GmbH，维也纳，奥地利		Gibco 15140
细胞培养皿	Greiner Bio-One GmbH，弗里肯豪森，德国		Cellstar 100 mm × 20 mm，货号 664160
体外实验
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH，维也纳，奥地利		Gibco 61965-026
（±）-盐酸维拉帕米	Sigma Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）
DMSO	Sigma Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）		276855-100 mL
细胞培养皿	Greiner Bio-One GmbH，弗里肯豪森，德国		Cellstar 100 mm × 20 mm，货号 664160
无菌一次性塑料移液管	VWR International GmbH，维也纳，奥地利		Sterilin，5 mL – 25 mL
无菌移液器吸头	VWR International GmbH，维也纳，奥地利		Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL
细胞培养瓶	Greiner Bio-One GmbH，弗里肯豪森，德国		Cellstar 250 mL，75 cm2 红色滤膜螺旋盖，货号 658175
LigandTracer 控制软件 Version 2.2.2	Ridgeview Instruments AB，乌普萨拉，瑞典。
LigandTracer Yellow	Ridgeview Instruments AB，乌普萨拉，瑞典。
LigandTracer White	Ridgeview Instruments AB，乌普萨拉，瑞典。
GraphPad Prism 6.0	GraphPad Software, Inc.
手持式自动细胞计数仪	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter（货号 PHC00000）
细胞计数传感器	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter Sensor 60 µm（货号 PHCC60050）