本文介绍了一种全自动放射性标记[11C]SNAP-7941的实验方案，以及对该PET示踪剂在P-糖蛋白表达与非表达细胞中实时动力学的分析方法。
本文内容
摘要
摘要
正电子发射断层扫描（PET）是一种重要的分子成像技术，可通过使用特异性靶向放射性配体进行体内研究，从而揭示生物通路的活动情况。本实验方案描述了一种稳定且可靠的远程控制放射性合成方法，用于合成 [11C]SNAP-7941，该化合物为黑素浓集激素受体1（melanin-concentrating hormone receptor 1）的拮抗剂。放射性合成起始于回旋加速器产生的 [11C]CO2，随后通过气相转化进一步反应生成 [11C]CH3OTf。然后将该活性中间体引入前体溶液中，生成相应的放射性示踪剂。化学纯度和放射化学纯度均通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）进行测定，该方法常规应用于放射性药物的质量控制过程。此外，还需计算摩尔活度，因其是后续实时动力学研究的必要参数。进一步地，将 [11C]SNAP-7941 应用于 MDCKII-WT 和 MDCKII-hMDR1 细胞，以评估P-糖蛋白（P-gp）表达对细胞摄取的影响。为此，使用表达P-糖蛋白的细胞系（MDCKII-hMDR1），在实验前不加或加入P-糖蛋白底物（±）-维拉帕米进行阻断处理，并将结果与野生型细胞的实验结果进行比较。整个实验设计凸显了精确时间管理的重要性，这对于所有使用短半衰期核素（如碳-11，半衰期：20分钟）标记的PET示踪剂开展的临床前和临床研究均至关重要。
引言
[11C]SNAP-7941 被开发为首个靶向黑色素浓集激素受体1（MCHR1）的正电子发射断层扫描（PET）示踪剂——该受体主要参与食欲和摄食行为的中枢调控1碳-11标记的SNAP-7941是一种特性明确的MCHR1拮抗剂，由此获得了真正的PET示踪剂2,3,4,5然而，由于短寿命放射性核素碳-11的半衰期仅为20分钟，其实现完全自动化的放射性合成在时间效率和可重复性方面均面临极大挑战。6总合成时间应尽可能缩短，一般不应超过2-3个半衰期（对于碳-11而言，约为40-60分钟）。7特别是，针对表达密度较低的受体系统的放射性示踪剂的合成工艺必须经过充分优化，以获得足够的产率，进而实现高摩尔活性8. 合成策略通常是在回旋加速器内产生放射性核素并释放[11C]CO2 到合成器。在那里，[11C]CO2 首先被还原为[11C]CH4 随后与碘反应生成[11C]CH3我 通过 气相法9,10。进一步用三氟甲磺酸银处理得到[11C]CH3将OTf直接在线引入。随后，将这种具有放射性碳-11标记的活性中间体加入含有前体分子的溶液中。自动化放射性合成还包括使用半制备型反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，以及后续制备适用于临床前和临床研究的终产物。
无论放射性核素的半衰期长短或放射性合成所需时间如何，放射性药物的药代动力学都是PET示踪剂研发过程中最关键的评价环节。在神经影像学领域，PET示踪剂进入大脑是主要前提。然而，血脑屏障（BBB）作为一种 "安全边界" 脑组织高表达外排转运蛋白，可将小分子（如PET示踪剂）排出，从而有效限制其应用。
在临床前评价过程中，一个巨大的缺陷是这些外排转运蛋白的意外相互作用，这些相互作用通常在体外实验中未被识别，导致PET示踪剂在体内的失败，如[11C]SNAP-7941所观察到的情况。在大鼠中进行的µPET成像显示脑内摄取量较低，而在给予P-糖蛋白（P-gp）抑制剂他利喹达后，脑内摄取显著增加11。这些数据表明，[11C]SNAP-7941是该外排转运系统的一种底物，从而阻碍了配体与中枢MCHR1的结合。遗憾的是，目前仍然缺乏能够在示踪剂开发早期阶段预测血脑屏障（BBB）穿透能力的合适体外模型。
本文介绍了使用碳-11甲基化合成仪实现[11C]SNAP-7941的自动化合成。本研究的重点是概述如何组织一系列连续的实验流程，包括自动化合成、质量控制以及利用半衰期极短的碳-11核素进行后续的体外评价。
首先，介绍实现成功放射性合成的关键步骤，以最小的时间消耗获得最大的产率。然后，建立可靠的质控程序，使放射性示踪剂可用于潜在的临床研究，并满足《欧洲药典》12的要求。摩尔浓度的定量及相应比活度的计算，是后续动力学测量的基本要求。
最后，本文介绍了一种新的、简便的体外方法，用于评估 [11C]SNAP-7941 与外排转运蛋白 P-糖蛋白（P-gp，hMDR1）之间的相互作用。所提出的动力学模型采用一种易于操作的装置，可实现数据的即时解读，且所需的细胞培养工作量极小13。
方案
警告：以下方案包含多个涉及放射性物质操作与处理的步骤。所有步骤必须符合研究所辐射安全部门及相应国家法律法规的要求。必须遵循ALARA（“合理可行尽量低”）原则，最大限度地减少操作人员受到的电离辐射暴露。
1. 实验的时间管理与规划
注意：碳-11的半衰期较短，因此需要精确的时间管理以尽量减少放射性损失（图1）。所有参与人员必须明确各自的职责以及相应操作的时间节点。为顺利开展[11C]SNAP-7941的实时动力学实验，通常需要约四名人员协同操作。
- 安排一位生产者负责 [11C]SNAP-7941 的制备。
- 通知质量控制操作人员，在合成开始时进行质量标准评估，并计算质量浓度和摩尔活度。
- 安排实时动力学实验操作人员，准备进行稀释计算并执行实验。
- 指示传递人员在指定时间点将放射性物质转移至相应位置。
2. 用于临床前研究的[11C]SNAP-7941的自动化合成
- 合成仪的准备（图2）。
- 打开合成仪、所需的技术气体（氦气和氢气）以及合成仪控制软件 Tracerlab. 选择相应的合成序列 快照.
- 用清水洗涤 V1-V3 一次，再用丙酮洗涤两次 通过 将反应器和HPLC阀置于上样或进样位置，使废液流入环路废液瓶中。
- 干燥反应器的所有进出管道 通过 带有持续氦气流激活的注射阀 通过 V18.
- 加热[11C]CH3我同时捕获以及 [11C]CH3在100 mL·min的氦气流下捕获OTf-1 最多 200 °C 通过 V24、V25、V29、V15、V9、V17 和带分离反应器的 V32/V33。
- 用100 mL·min⁻¹的氦气流检查相同管路（连接反应器）是否存在泄漏-1当流速降至4 mL·min以下时，可确保密封性-1.
- 打开高效液相色谱泵（5-10 mL·min⁻¹）-1）用乙腈/水（50/50，v/v）冲洗HPLC管路和进样阀，并用HPLC溶剂冲洗HPLC管路 通过 V14 注入灯泡中。
- 排空球囊 通过 将V11和V12通过氦气流导入废液瓶中 通过 V19. 用 V6 的水再次冲洗相应的泳道 通过 V11 和 V12 通入氦气流 通过 V18.
- 用乙醇洗涤 V5，用水洗涤 V4 通过 使用氦气流将V11和V12转移至产物收集瓶（PCV）中 通过 V18，然后排空PCV 通过 V13 通入氦气流至废液瓶中 通过 V20.
- 关闭高效液相色谱泵，切换至合成用溶剂（2.5 g·L⁻¹乙酸铵水溶液）-1)/乙酸 97.5/2.5 v/v；pH 3.5)/乙腈 75/25 v/v），连接半制备型高效液相色谱柱并平衡色谱柱（流速为 5 mL·min⁻¹）-1).
- 填写合成与纯化所用试剂：1.5 mL 水（V2）、4.5 mL 0.9% NaCl（V4）、0.5 mL 96% 乙醇（V5）、10 mL 水（V6）以及 90 mL 水（bulb）。
- 连接一个新的环路废液瓶；将一个产品瓶（已标记并配有通气针）连接至 V13 和液氮。
- 使用10 mL 96%乙醇和20 mL水预处理固相萃取（SPE）小柱，并将其连接在V11和V12之间。
- 在开始合成前20分钟启动预运行程序，包括加热[11C]CO2 陷阱至 400 °C 并用50 mL·min⁻¹的氦气流冲洗捕集阱-1 通过 V27（2 分钟）。然后，预冲洗 [11C]CO2 用氢气（120 mL·min⁻¹）捕获 3 分钟-1）并最终冷却至以下 40 °C.
- 将1 mg前体溶解于 400 µL 用于DNA合成的乙腈（ < 10 H2O），将溶液转移至反应体系中，并加入 5.5 µL TBAH（264 mg·mL⁻¹）-1 在甲醇中）。将反应器连接至相应位置。
- 关闭热室并启动热室的负压系统。
- 确认CH冷却过程的开始4 用液氮冷冻至 -75 °C.
- 当达到温度时，释放放射性物质。
- 回旋加速器生产[11C]CO2
注意：步骤 2.2.1–2.2.4 与放射性合成模块的准备工作同时进行（另见 图1).- 打开回旋加速器的磁体。
- 选择目标 11C-CO2 并启动光束 65 µA.
- 通过按下按钮确认辐照开始 开始照射
- 停止射束，并通过按下按钮确认放射性物质已释放至合成器中 递送在达到所需的放射性活度后（约30分钟内达到120 GBq）。
- 全自动放射性合成的执行
- 确认系统已准备就绪，可接收放射性物质，并启动自动化流程
- 监控以下自动化流程。
- 检查是否 [11C]CO2 从回旋加速器自动转移至合成单元 通过 V26（约 4 分钟），以及 [11C]CO2 被截留在浸渍有镍作为催化剂的分子筛上（[11C]CO2 室温下
- 追踪是否 [11C]CO2 首先用氦气自动冲洗陷阱（50 mL·min⁻¹）-1）然后用氢气（120 mL·min⁻¹）-1）。然后观察到 V27 和 V25 处于关闭状态，且被截留的[11C]CO2 包括将氢气加热至 400 °C 且所形成的[11C]CH4 被进一步转运至预冷的[11C]CH4 捕获并困于其中。
- 监测 V10 是否关闭，V9 是否打开（朝向碘柱）以及 [11C]CH4 再次通过加热 [11C]CH4 缓慢捕获 80 °C 并用氦气流输送至循环单元 通过 V10（排气出口）。并进一步检查是否[11C]CH4 转化为[11C]CH3循环单元内的 I，持续约 3 分钟，形成的 [11C]CH3I 被持续捕获在[11C]CH3我捕获。
- 确保排气阀 V16 已打开且 [11C]CH3I型陷阱被加热至 90 °C 以氦气流（20 mL·min⁻¹）-1通过V24去除可能的副产物，然后关闭V16。
- 确认 [11C]CH3I 已准备就绪，可释放至反应器中。
- 监控以下自动化流程：检查 [11C]CH3I型陷阱被加热至 190 °C 且形成的[11C]CH3I 被释放到反应器中 通过 [11C]CH3OTf 捕获阱（V32 和 V33，仍处于 200 °C），V7 和 V8 在持续的氦气流（10–25 mL·min⁻¹）下-1，V24）。在此过程中，V21 和 V23（排气出口）必须保持开启。
- 确认放射性物质已到达反应器，当反应器内放射性活度不再升高时。
- 监控以下自动化流程，并在必要时准备进行人工干预
- 检查 V23、V21 和 V8 是否已自动关闭，反应混合物是否已加热至 75 °C3分钟后，观察反应器是否已用液氮冷却至温度低于 35 °C随后，确保用1.5 mL水淬灭反应混合物 通过 V2。在此过程中，V21 和 V23（排气出口）必须保持打开。
- 记录V21和V23是否关闭，以及反应混合物是否通过流体检测器进入HPLC进样阀（5 mL loop）。记录反应混合物是否被自动注入HPLC色谱柱。
- 观察色谱图，并手动切割产物峰 通过 按钮 峰起始点. 按压 峰值-末端效应 当产物峰信号在约8-10分钟保留时间后降至约400 cps以下时（流速：5 mL·min⁻¹）-1, 图3).
- 打开额外的氦气流以加速灯泡排空。
- 监测球囊是否排空并观察废液瓶：检查球囊是否已排空 通过 V11、SPE 小柱和 V12 通过 V19 及一条额外的氦气管线，利用氦气流排入废液，前提是产物保留在 SPE 小柱上。
- 确认灯泡已完全排空。
- 监测固相萃取纯化与产物转移的自动化过程
- 检查SPE小柱是否已用10 mL水洗涤 通过 将 V6、V11 和 V12 收集至废液容器中，若乙醇将产物洗脱至 PCV 中 通过 V5、V11 和 V12。最后，观察是否将 0.9% NaCl 加入 PCV 通过 V4、V11 和 V12 用于稀释产物。
- 确保将产物溶液转移完全 通过 V13 和一个无菌滤器通过氦气流注入最终产品小瓶中 通过 V20.
- 确认产物已完全转移。
3. 质量控制（QC）
注意：放射性药物的质量控制包括测量以下参数：
- 放射化学纯度和摩尔活度（RP-HPLC）
- 残留溶剂（气相色谱法，GC）
- 渗透压（蒸汽压渗透压计）
- pH值（pH计）
- γ能谱/放射性核素纯度（γ能谱仪）
- 半衰期/放射性核素纯度（活度计）
所有理化参数均需在产品放行前测定，且其数值必须处于规定的质量参数范围内。
- 质量控制设备的准备
- 在合成结束前30分钟开始准备。
- 在铅屏蔽容器中准备一个锥形小瓶，并准备一支带针头的屏蔽1 mL注射器。
- 为高效液相色谱（HPLC）制备SNAP-7941的水溶液参考标准品（10 µg·mL-1）。
- 开启pH计、气相色谱仪及其所用气体、渗透压仪以及HPLC的所有组件。
- 启动HPLC控制软件，选择用于[11C]SNAP-7941分析的专用色谱柱及相应方法（流动相：(水/乙酸 97.5/2.5 v/v；2.5 g·L-1乙酸铵；pH 3.5)/乙腈 70/30 v/v；流速：1 mL·min-1），并编写包含两次进样的样品列表（标准品和产品）。启动方法以平衡色谱柱。
- 在平衡10分钟后，使用Hamilton注射器注入20 µL SNAP-7941参考溶液，并开始分析运行。
- 进样后用乙腈和水各清洗Hamilton注射器两次。
- 启动GC控制软件并编写样品列表。
- 执行质量控制
- 合成结束后测量产品的绝对放射性产额，并使用已准备好的铅屏蔽注射器将100 µL产品转移至反应小瓶中用于质量控制。
注：所有从质量控制中获得的数据必须按照国家法规进行记录。 - 分析型HPLC：测定放射化学纯度和化学纯度，并立即将结果通知负责细胞培养实验的人员。
- 吸取40 µL质量控制样品并注入HPLC。通过将进样阀的手柄从Load移至Inject来启动运行（图3）。
注：在运行期间（8分钟），可同时进行本方案中的其他检测项目，以尽量减少放射性衰变损失。 - 打开色谱图，在放射性通道中对所有峰进行积分。将产品峰的保留时间（5.0–7.0分钟）与参考标准品的保留时间进行比较。比较所有积分峰的峰面积百分比。产品峰面积应占总积分面积（放射性通道）的95%以上（放射化学纯度）。
- 对紫外（UV）通道信号进行积分以确定化学纯度。主要杂质通常为前体SNAP酸，其保留时间为2.8–3.5分钟。根据积分结果和校准曲线计算[natC]SNAP-7941的浓度。计算SNAP-7941的浓度（单位：µmol·mL-1），并通过以下公式确定摩尔活度：
- 吸取40 µL质量控制样品并注入HPLC。通过将进样阀的手柄从Load移至Inject来启动运行（图3）。
- 气相色谱分析：将20 µL质量控制样品转移至专用玻璃小瓶中，放入自动进样器并启动测量。测量完成后，打开色谱图并记录自动积分峰的数值。样品中乙腈含量不得超过410 ppm，乙醇含量不得超过10%。
- 渗透压：将纸样圆片置于专用凹槽中，加入10 µL样品。按下Close按钮开始测量渗透压。3分钟后，仪器显示渗透压值，应在190–500 mosm·kg-1范围内。
- pH值：用水清洗电极。将电极插入样品中测量pH值。pH值应在5.0–8.5范围内。测量后再次清洗电极，并将电极置于标准pH参考溶液中保存。
- γ能谱：将质量控制样品放入γ能谱仪中，打开控制软件并开始测量。测量结束后停止运行，记录测得的能量值，应为511 keV（范围420–520 keV）。打开文件菜单，以相应的批号保存文件。在专用软件中调取已保存的能谱并打印。
- 半衰期：使用活度计对质量控制样品的放射性活度进行两次测量。记录相应时间，并计算指数衰变的半衰期。
- 合成结束后测量产品的绝对放射性产额，并使用已准备好的铅屏蔽注射器将100 µL产品转移至反应小瓶中用于质量控制。
- 放行
- 所有参数检测合格且结果符合奥地利相关机构指南后，方可放行该放射性示踪剂。操作人员须签署确认数据的准确性。
4. P-糖蛋白转运体相互作用的评估
- 细胞培养
- 开启工作台的层流空气系统，并在开始工作前至少清洁台面15分钟。
- 在超净工作台内，使用无菌移液管和自动移液器，将细胞培养基在无菌条件下与10%胎牛血清（50 mL）和0.5%抗生素（2.5 mL）混合。
- 解冻MDCKII-hMDR1和MDCKII-WT细胞，在无菌条件下（LAF）于T75或T175细胞培养瓶中培养10至14天，以备实验使用。
- 第二天更换培养基，以去除所有未贴壁和凋亡的细胞。
- 每三天更换一次新鲜培养基（T75 细胞培养瓶加 12 mL，T175 细胞培养瓶加 23 mL）。
- 根据实验时间安排，在细胞融合度达到80%时，将细胞分传至新的培养瓶或细胞培养皿中，以避免形成双层生长。
- 实验用细胞的制备
- 实验前两天将细胞进行传代，以 2.5 x 105 每2 mL细胞悬液接种于细胞培养皿的斜面图4). 使用自动细胞计数仪或血球计数板对细胞进行计数，并计算相应的传代比例。
- 实验前一天移除培养基，用 4 mL DPBS 清洗培养皿中的细胞，加入新鲜的 5 mL 细胞培养基。将培养皿水平放置于培养箱中。
- 用 DPBS 清洗细胞，实验前至少 0.5 小时完成，并更换为 2 mL 无 FBS 培养基。在显微镜下观察细胞汇合度及形态。
- 在三种不同的实验设置中进行实验。
- 按照4.2.3节所述，使用培养皿进行实验。
- 实验前用处理细胞0.5 h 10 µM 盐酸维拉帕米（±）
- 添加 0.98 µL 20.4 mM（±）-盐酸维拉帕米DMSO储备液。处理期间DMSO终浓度≤0.05%。
- 将细胞与溶剂对照（DMSO）共同孵育0.5小时，所用体积与药物处理时相同。
- 实时检测实验（针对所有三种设置）
- 打开设备和计算机，确保它们正确连接，然后启动控制软件。
- 选择 一个靶点 选项，解锁模板并调整以下设置：
岗位数量：2（两个）
检测时间（秒）：3（三）
检测延迟时间（s）：2（二）
第一阶段名称：基线 - 将细胞培养皿插入设备的倾斜支架中，确保细胞极位于底部并被细胞培养基覆盖。
- 通过以下方式启动运行 开始 按钮。系统将提示保存文件。选择文件名和保存路径。控制中心弹出，基线测量开始（细胞培养皿支架开始旋转）。
- 选择下方 其他选项:
时间尺度：分钟
核素校正：碳-11 - 勾选下方所有复选框 图中曲线 （背景（红色），目标信号（蓝色）及目标信号减去背景（黑色））。
- 获得质量控制参数：摩尔活度 [GBq·µmol-1] 和活度浓度 [MBq·mL⁻¹]-1] 在合成结束时。
- 计算 [³H] 标记示踪剂在 15 nM 浓度下的相应体积natC]SNAP-7941 在 2 mL 的检测体积中。
- 准备移液器至相应体积，并移取一份 [11C]SNAP-7941 产物置于铅屏蔽中。
- 点击 暂停运行 在控制中心窗口中。等待培养皿旋转停止，以及标题为 暂停并进入下一阶段.
- 打开实时动力学检测设备的盖子。转动培养皿支架 90° 向左。加入计算好的示踪剂体积，然后转回初始位置。接着，关闭设备盖子。立即按下 继续 启动实验的按钮。
- 20 分钟后，选择暂停以结束实验，随后终止运行（按 结束跑动 在侧边栏中）。
- 使用统计软件进行数据分析与处理
- 打开实时控制软件。点击 打开文件 以回忆所需的反应动力学。反应动力学在控制中心窗口中显示。
- 通过右键单击直接选择动力学曲线 导出曲线保存包含原始数据的文本文件。打开统计分析程序，粘贴实时实验的原始数据文件。
- 从放射性示踪剂加入时开始计时（x轴，排除背景测量），并将信号归一化为最大每秒计数（CPS）的百分比。
- 将所有归一化数据载入新的 GraphPad Prism 文件中。
- 计算平均值和标准差。
- 将获得的数据绘制成图表，显示三种实验条件下示踪剂摄取量的偏差（增加速率）。
结果
完全自动化的[11C]SNAP-7941 的产量为 5.7 ± 2.5 GBq（EOB 时为 4.6 ± 2.0%，基于[11C]CH3OTf；n = 10）的配制产物。整个合成过程持续约40分钟，其中15分钟用于制备[11C]CH3OTf 通过 气相法需要另外5分钟完成前体的放射性标记，随后进行10分钟的半制备型反相高效液相色谱纯化，以及10分钟的C18柱固相萃取与制剂。然后，取少量样品（约100-200 µL) 被送至负责质量控制的人员，而装有即用型示踪剂的原始产品小瓶则交由实时动力学分析的实验人员。
合成结束后10分钟内完成质量控制。摩尔活度为72 ± 41 GBq/µmol（n = 10），放射化学纯度始终> 95%。其他所有参数（pH值、渗透压、残留溶剂）均符合放行标准。为开展实时动力学检测，选择了三种不同的实验设置：（A）经处理与未经处理（溶剂对照）的MDCKII-WT细胞，（B）未经处理或经溶剂处理的MDCKII-hMDR1细胞，以及（C）在开展转运体实时动力学检测前，使用（±）-维拉帕米对后一细胞系进行阻断。将[11C]SNAP-7941应用于野生型细胞系MDCKII-WT（不表达P-糖蛋白）和MDCKII-hMDR1（表达P-糖蛋白）时，表现出不同的动力学行为：在野生型细胞系中快速蓄积，而在MDCKII-hMDR1细胞中未观察到蓄积现象。然而，在MDCKII-hMDR1细胞中使用（±）-维拉帕米阻断P-糖蛋白外排转运体后，其实时动力学曲线与野生型细胞系相似（图5）。
图1：工作流程概览。 [11C]SNAP-7941的放射性合成、质量控制及实时动力学测量的工作流程。黑色箭头表示放射性物质的传输路径。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：自动合成仪的放射性合成示意图。 自动合成仪的切换回路，起始于用于 [11C]CH3I/[11C]CH3OTf 制备的循环单元，随后进入反应器将放射性引入前体溶液，并通过固相萃取进行纯化（SPE = 固相萃取；PCV = 产物收集瓶）。请点击此处查看该图的高清版本。
图 3：全自动放射合成 [11C]SNAP-7841 的代表性色谱图。 上图为半制备型反相高效液相色谱（RP-HPLC）色谱图，下图为纯化后的分析型色谱图。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：实时实验用细胞培养皿的制备。 第一步包括接种 2.5 × 105 至 1 × 106 个细胞，具体数量取决于细胞类型及其生长速率。随后，将培养皿置于倾斜位置（约 30–45°）。因此，可在培养箱中使用所提供的金属装置或细胞培养皿的盖子来固定培养皿的倾斜状态。接种后第二天（24 小时），将培养皿调至水平位置，并加入新鲜细胞培养基，完全覆盖细胞表面。实验当天，检测细胞活力和融合度。根据实验方案，用 DPBS 清洗细胞，更换为无血清培养基（2 mL），并将培养皿重新置于倾斜位置，直至实验开始。此后，可对细胞施加抑制剂或溶剂处理。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：[11C]SNAP-7941 的实时动力学测量。 展示了三种不同实验条件下的 [11C]SNAP-7941 实时动力学代表性结果：使用 MDCKII-WT 细胞；使用 P-糖蛋白抑制剂（±）-维拉帕米预阻断的 MDCKII-hMDR1 细胞；以及未进行阻断的 MDCKII-hMDR1 细胞。Y 轴表示预阻断的 MDCKII-hMDR1 细胞和 WT 细胞相对于未经处理或仅经溶剂处理的 MDCKII-MDR1 细胞的增加速率（无摄取，0%）。请点击此处查看该图的高清版本。
讨论
在商用合成模块上建立了[11C]SNAP-7941的放射性合成方法。由于该方法可完全自动化操作，放射性合成过程被证实具有良好的可靠性，同时在操作人员的辐射防护方面也得到了改进。合成装置的准备工作对放射性示踪剂的质量具有重大影响，尤其是在摩尔活度方面。因此，必须始终在惰性气氛（例如氦气环境）下操作，并对反应容器之前的所有管路（靶线、[11C]CH3I生成回路及反应器（见图2））进行充分吹扫。此外，在开始合成前对相关捕集阱和加热炉进行预热，以去除水分和环境中的二氧化碳，有利于提高摩尔活度。特别是负载石墨化碳的AgOTf柱对湿度极为敏感，即使微量水分也会干扰[11C]CH3I向[11C]CH3OTf的转化。在开始合成前，需将[11C]CO2捕集阱和[11C]CH3I捕集阱重新冷却至室温，以确保后续捕集效果。此外，建议在开始合成前短时间内溶解前体化合物，并将碱直接加入前体溶液中。
碳-11放射性示踪剂的质量控制必须合理设计，以实现连续且快速的工作流程。然而，对于细胞培养研究而言，获得有效结果最关键的参数是放射化学纯度和摩尔活性。准确评估摩尔活性需要可靠的高效液相色谱（HPLC）分析方法，且校准曲线必须覆盖终产物的浓度范围。由于放射性合成过程中产生的量较少，放射性示踪剂面临的挑战在于实现高于定量限（LOQ）的浓度。因此，关键在于找到一个平衡点：既要保持较高的摩尔活性以避免受体饱和，又要确保浓度足够高，以便仍能定量检测非放射性信号。
[11C]SNAP-7941 被证实是人 P-糖蛋白（P-gp）转运体的强效底物，因为在未经处理或溶剂处理的 MDCKII-hMDR1 细胞中未观察到其蓄积，这是由于其被快速外排所致。相比之下，两种实验设置（MDCKII-WT 细胞或预先阻断的 MDCKII-hMDR1 细胞）均得到相似的结果（[11C]SNAP-7941 的蓄积），这支持了该体外 检测方法的通用性。MDCKII-hMDR1 细胞因其稳定转染、生长迅速且对旋转培养皿引起的剪切应力具有较强耐受性，因此非常适用于 LigandTracer 实验。因此，[11C]SNAP-7941 在大鼠和小鼠脑组织中缺乏摄取的现象，可能是由于通过 P-gp 转运体外排所致。由于该方法使用表达人多药耐药蛋白 1（hMDR-1, P-gp）的犬肾细胞进行转染，因此在预测人源外排转运体结合方面具有较高的预测价值，这对于未来的临床应用具有积极意义。然而，截至目前，该方法对其他外排转运体的选择性尚未得到验证。因此，可采用表达其他主要外排转运体（如乳腺癌耐药蛋白（BCRP）或多药耐药蛋白-1（MRP-1））的其他细胞系，以研究待测物与这些转运体的相互作用。与传统的蓄积或转运实验相比，该方法操作极为简便，并可立即获得定性结果。此外，该技术最大的优势在于能够实时评估正电子发射断层扫描（PET）示踪剂与靶点之间的直接相互作用，而传统实验通常依赖间接定量方法（主要是竞争置换实验）。同时，实时放射性检测软件提供了较高的实验灵活性（例如，核素衰变校正、测量时间与位置设定等），从而赋予使用者较大的操作自由度。然而，该方法也存在一定的局限性，例如通量较低，因每次仅能测量一个细胞培养皿。此外，还需考虑若干其他技术与操作问题：该技术对背景辐射极为敏感，因此应将辐射源远离检测系统，并在实验前重视背景辐射的测量。另一个问题是当实验温度高于室温时，倾斜支架的加热可能导致培养基蒸发，从而影响探测器性能。建议不采用局部加热，而是将整个装置置于培养箱内。此外，该方法仅适用于贴壁细胞系。由于细胞培养皿的旋转可能引起剪切应力，对剪切应力敏感的细胞可能从培养皿上脱落，从而导致结果无效。
然而，如果实验人员注意到这些微小的缺点，该方法仍可为临床前PET示踪剂动力学行为的分析提供快速且可靠的结果。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作由奥地利科学基金（FWF P26502-B24，M. Mitterhauser）资助。我们感谢T. Zenz和A. Krcal提供的技术支持。此外，我们感谢K. Pallitsch制备AgOTf，以及H. Spreitzer分发前体化合物。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 表1：全自动放射性合成[11C]SNAP-7941所用材料与仪器列表 | |||
| Ni催化剂 | Shimadzu，京都，日本 | Shimalilte Ni还原型，80/100目 | |
| 碘 | Merck，达姆施塔特，德国 | 1.04761.0100 | |
| 乙腈 | Merck，达姆施塔特，德国 | 用于DNA合成，< 10 ppm H2O | |
| 乙腈 | Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国 | HPLC级 | |
| 乙酸铵 | Merck，达姆施塔特，德国 | ||
| 乙酸 | Merck，达姆施塔特，德国 | 冰醋酸 | |
| 乙醇 | Merck，达姆施塔特，德国 | 96% | |
| NaCl | B. Braun，梅尔松根，德国 | 0.9% | |
| 四丁基氢氧化铵 | Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国 | ||
| 甲醇 | Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国 | HPLC级 | |
| SPE小柱 | Waters，米尔福德，马萨诸塞州，美国 | SepPak C18plus | |
| 半制备型反相高效液相色谱柱 | Merck，达姆施塔特，德国 | Chromolith SemiPrep RP-18e，100-10 mm | |
| 保护柱 | Merck，达姆施塔特，德国 | Chromolith Guard RP-18e，5-4.6 mm | |
| 前体 | 奥地利维也纳大学 | SNAP-酸 | |
| 对照品 | 奥地利维也纳大学 | SNAP-7941 | |
| 三氟甲磺酸银 | Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国 | ||
| Graphpa GC | Alltech，迪尔菲尔德，伊利诺伊州，美国 | 80/100目 | |
| PET trace 860回旋加速器 | GE Healthcare，乌普萨拉，瑞典 | ||
| [11C]CO2高压靶 | 液化空气公司，维也纳，奥地利 | ||
| TRACERlabFX2 C | GE Healthcare，乌普萨拉，瑞典 | ||
| N2 + 1% O2 | 液化空气公司，维也纳，奥地利 | 靶气体 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 表2：[11C]SNAP-7941质量控制所用材料与仪器列表。 | |||
| Merck Hitachi LaChrom, L-7100 | Hitachi Vantara Austria GmbH（维也纳，奥地利） | HPLC泵 | |
| Merck Hitachi, L7400 | Hitachi Vantara Austria GmbH（东京，日本） | 紫外检测器 | |
| NaI放射性检测器 | Raytest（施特劳宾哈特，德国） | NaI放射性检测器 | |
| Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm | Merck（达姆施塔特，德国） | HPLC色谱柱 | |
| 430-GC | Bruker（不来梅，德国） | 气相色谱仪 | |
| 毛细管柱 ID-BP20；12 m × 0.22 mm × 0.25 mm | SGE Ananlytical Science Pty. Ltd.（维多利亚，澳大利亚） | 气体毛细管柱 | |
| Wesco，Vapro 5600渗透压仪 | Sanoya Medical Systems（维也纳，奥地利） | 渗透压仪 | |
| γ能谱仪 | γ能谱仪 | ||
| 气相色谱控制软件 | VARIAN（帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国） | Galaxie Version 1.9.302.952 | |
| γ能谱仪控制软件 | ORTEC（橡树岭，田纳西州，美国） | Maestro for Windows Version 6.06 | |
| γ能谱数据回放软件 | ORTEC（橡树岭，田纳西州，美国） | Winplots version 3.21 | |
| HPLC控制软件 | Raytest（施特劳宾哈特，德国） | Gina Star Version 5.9 | |
| inolab 740 | WTW（魏尔海姆，德国） | pH计 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 表3：评估[11C]SNAP-7941实时动力学行为所用材料与仪器列表。 | |||
| Madin-Darby犬肾细胞系（MDCKII-hMDR1） | 荷兰癌症研究所（NKI，阿姆斯特丹，荷兰） | 表达人P-糖蛋白（hMDR1） | |
| Madin-Darby犬肾细胞系（MDCKII-WT） | 荷兰癌症研究所（NKI，阿姆斯特丹，荷兰） | 野生型（WT） | |
| DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH，维也纳，奥地利 | Gibco 61965-026 | |
| 胎牛血清（FCS） | VWR International GmbH，维也纳，奥地利 | Gibco 10270-106 | |
| 青霉素/链霉素 | VWR International GmbH，维也纳，奥地利 | Gibco 15140 | |
| 细胞培养皿 | Greiner Bio-One GmbH，弗里肯豪森，德国 | Cellstar 100 mm × 20 mm，货号 664160 | |
| 体外实验 | |||
| DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH，维也纳，奥地利 | Gibco 61965-026 | |
| （±）-盐酸维拉帕米 | Sigma Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国） | ||
| DMSO | Sigma Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国） | 276855-100 mL | |
| 细胞培养皿 | Greiner Bio-One GmbH，弗里肯豪森，德国 | Cellstar 100 mm × 20 mm，货号 664160 | |
| 无菌一次性塑料移液管 | VWR International GmbH，维也纳，奥地利 | Sterilin，5 mL – 25 mL | |
| 无菌移液器吸头 | VWR International GmbH，维也纳，奥地利 | Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL | |
| 细胞培养瓶 | Greiner Bio-One GmbH，弗里肯豪森，德国 | Cellstar 250 mL，75 cm2 红色滤膜螺旋盖，货号 658175 | |
| LigandTracer 控制软件 Version 2.2.2 | Ridgeview Instruments AB，乌普萨拉，瑞典。 | ||
| LigandTracer Yellow | Ridgeview Instruments AB，乌普萨拉，瑞典。 | ||
| LigandTracer White | Ridgeview Instruments AB，乌普萨拉，瑞典。 | ||
| GraphPad Prism 6.0 | GraphPad Software, Inc. | ||
| 手持式自动细胞计数仪 | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter（货号 PHC00000） | |
| 细胞计数传感器 | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter Sensor 60 µm（货号 PHCC60050） |
参考文献
- Saito, Y., Maruyama, K. Identification of melanin-concentrating hormone receptor and its impact on drug discovery. Journal of Experimental Zoology. 305, 761-768 (2006).
- Philippe, C., et al. Preclinical in vitro & in vivo evaluation of [11C]SNAP-7941 - the first PET tracer for the melanin concentrating hormone receptor 1. Nuclear Medicine and Biology. 40, 919-925 (2013).
- Philippe, C., et al. Radiosynthesis of [ 11C]SNAP-7941-the first PET-tracer for the melanin concentrating hormone receptor 1 (MCHR1). Applied. Radiation and Isotopes. 70, 2287-2294 (2012).
- Philippe, C., et al. SNAPshots of the MCHR1 : a Comparison Between the PET-Tracers [ 18 F ] FE @ SNAP and [ 11 C ] SNAP-7941. Molecular Imaging Biology. , 1-12 (2018).
- Schirmer, E., et al. Syntheses of precursors and reference compounds of the melanin- concentrating hormone receptor 1 (MCHR1) Tracers [11C]SNAP-7941 and [18F]FE@SNAP for positron emission tomography. Molecules. 18, 12119-12143 (2013).
- Miller, P. W., Long, N. J., Vilar, R., Gee, A. D. Synthese von 11C-, 18F-, 15O- und 13N-Radiotracern für die Positronenemissionstomographie. Angewandte Chemie. 120, 9136-9172 (2008).
- Pichler, V., et al. An overview on PET radiochemistry: part 1 - covalent labels - 18 F, 11 C, and 13 N. Journal of Nuclear Medicine. 59, 1350-1354 (2018).
- Pichler, V., et al. Molar activity - The keystone in 11C-radiochemistry: An explorative study using the gas phase method. Nuclear Medicine and Biology. 67, 21-26 (2018).
- Larsen, P., Ulin, J., Dahlstrøm, K., Jensen, M. Synthesis of [11C]iodomethane by iodination of [11C]methane. Applied Radiation and Isotopes. 48, 153-157 (1997).
- Dahl, K., Halldin, C., Schou, M. New methodologies for the preparation of carbon-11 labeled radiopharmaceuticals. Clinical and Translational Imaging. 5, 275-289 (2017).
- Raaphorst, R. M., et al. Radiopharmaceuticals for assessing ABC transporters at the blood-brain barrier. Clinical. Pharmacollogy & Therapeutics. 97, 362-371 (2015).
- Nics, L., et al. Speed matters to raise molar radioactivity: Fast HPLC shortens the quality control of C-11 PET-tracers. Nuclear Medicine and Biology. 57, 28-33 (2018).
- Zeilinger, M., et al. New approaches for the reliable in vitro assessment of binding affinity based on high-resolution real-time data acquisition of radioligand-receptor binding kinetics. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging (Research). 7, 22(2017).
重印与许可
标签
