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从骨骼肌活检手术中分离、培养、鉴定及诱导人肌肉前体细胞分化

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DOI：

10.3791/59580

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2019年8月23日

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1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍了从骨骼肌活检组织中分离、培养、鉴定和诱导人原代肌前体细胞（hMPCs）的技术。 通过这些方法获得并鉴定的hMPCs可用于后续研究，以探讨与人类肌生成及骨骼肌再生相关的问题。

摘要

使用原代人体组织和细胞是研究生物学及生理学过程（如骨骼肌再生过程）的理想选择。然而，在使用人原代成体干细胞时存在公认的挑战，尤其是来源于骨骼肌活检的人肌肉前体细胞（hMPCs），其主要问题包括从采集组织中获得的细胞产量较低，以及不同供体来源的细胞在生长和死亡参数方面存在较大异质性。尽管在实验设计中纳入这种异质性需要更大的样本量才能检测到显著效应，但它也使我们能够识别影响hMPC 扩增能力差异的潜在机制，从而更深入地理解骨骼肌再生过程中的异质性。揭示能够区分不同培养物扩增能力的新型机制，有望推动改善骨骼肌再生能力的治疗策略的开发。

引言

骨骼肌是人体最大的器官系统，占全身质量的30−40%1。除了在运动中发挥公认的作用外，骨骼肌还维持体温和身体姿势，并在全身营养物质稳态中起核心作用。涉及人类受试者、动物和细胞培养模型的研究对于解答骨骼肌生物学和再生相关问题均具有重要价值。分离和培养人原代肌肉前体细胞（hMPCs）提供了一个可靠的模型，使得细胞培养技术和操作能够应用于人类样本。使用hMPCs的一个优势在于它们保留了每个供体的遗传和代谢表型2,3。供体表型的维持使研究人员能够考察肌源性过程中个体间的差异。例如，我们已采用hMPC表征方法鉴定出hMPC群体扩增能力中与年龄和性别相关的差异4。

本实验方案的目的是详细阐述从骨骼肌活检组织中分离、培养、鉴定和诱导分化 hMPCs 的技术。在先前研究的基础上，这些研究描述了 hMPCs 并鉴定了可用于 hMPCs 分离的潜在细胞表面标志物5,6，本方案填补了从细胞分离到细胞鉴定之间的重要知识空白。此外，本方案中包含的详细分步操作说明，使得 hMPCs 的分离与鉴定对广大科研人员而言更加易于实施，包括那些此前对 hMPCs 操作经验有限的研究者。我们的方案是最早描述使用成像细胞仪追踪细胞群体的方法之一。新设计的成像细胞仪属于前沿技术，具有高通量、基于微孔板的特点，可在数分钟内实现对培养容器每孔中所有细胞的活细胞成像、细胞计数以及多通道荧光分析。该系统能够在对培养过程干扰极小的情况下，快速量化整个细胞群体在增殖和活力方面的动态变化。例如，我们可在体外连续数天客观地测量汇合度，以确定来自不同供体的各培养样本的生长动力学。文献中的许多实验方案，尤其是涉及 MPCs 分化的方案，通常要求细胞达到特定的汇合度后才能开始诱导分化或处理7。我们的方法可对培养容器中每孔的汇合度进行客观判断，使研究人员能够以无偏倚、非主观的方式启动处理程序。

过去，使用原代 hMPC 的主要局限性在于产量较低，从而限制了可用于实验的细胞数量。我们及其他研究者已证明，从骨骼肌活检组织中获得的 MPC 产量为每毫克组织 1−15 个 MPC（图 1）8。由于本方案允许细胞在经荧光激活细胞分选（FACS）纯化前进行四次传代，因此即使仅使用少量活检组织（50−100 mg）所获得的冻存 hMPC 产量，也足以满足需要开展多项实验的研究需求。我们的 FACS 方案可获得约 80% 纯度（Pax7 阳性）的 MPC 群体，因此本方案在产量和纯度方面均得到了优化。

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方案

本方案已获得康奈尔大学机构审查委员会的批准。所有参与者均经过潜在健康状况的筛查，并签署了知情同意书。

1. 通过骨骼肌活检获取人体肌肉组织

  1. 通过触诊、解剖标志以及肌肉主动收缩来确定股外侧肌的位置。
  2. 让受试者收紧股四头肌，通过触诊找到股外侧肌的肌腹，其位置大约位于髌骨至髋关节距离的三分之一处，且紧邻股骨的腹外侧。
  3. 使用纸质卷尺测量，并用外科标记笔在髌骨上缘约4−6英寸处标记出代表肌腹的区域。
  4. 剃除标记区域附近的毛发，然后使用医疗操作前常用的外科级消毒剂进行清洁（例如：2%葡萄糖酸氯己定（CHG）/ 70%异丙醇（IPA））。
  5. 用1%利多卡因对活检部位进行局部麻醉。
    注意：避免将利多卡因注射入骨骼肌内。
  6. 在标记部位做一长度为4−5 mm的切口通道。
  7. 待区域麻醉完成后，将带有穿刺针芯的伯格斯特伦针（Bergstrom needle）穿过筋膜，插入肌肉肌腹内（深度约2−3 cm）。
  8. 在助手通过抽吸连接的60 mL注射器活塞施加负压的同时，将切割用穿刺针芯回撤2−3 cm，使肌肉组织被吸入伯格斯特伦针内。
  9. 关闭切割腔。
  10. 旋转活检针基部四分之一圈，重复打开针头、施加负压、关闭针头的操作步骤。
    注意：每次关闭针头时，应在伯格斯特伦针内获得一段肌肉组织。在取样过程中，针头始终保持在大腿内的相同垂直位置，仅沿纵轴旋转360°以获取各个样本。此过程可重复3−4次。
  11. 将采集的活检组织从针头中推出，置于无菌非粘连性敷料垫上。
  12. 检查组织，并使用无菌手术刀片或镊子去除任何可见的脂肪组织和纤维化组织。
  13. 取一部分组织（50−100 mg）放入含有CO2非依赖性营养培养基（例如：Hibernate A）的无菌管中。
    注意：组织重量的测定方法如下：首先将装有营养培养基并盖好盖子的试管放在天平上归零；然后将组织放入试管中，重新盖上盖子，再称量含有组织和营养培养基的试管总重。
  14. 将含有组织和营养培养基的试管置于4 °C保存，直至进行后续处理。
    注意：活检组织应在采集后48小时内完成处理。

2. 从活检组织中分离人类肌肉前体细胞

  1. 切碎活检组织。
    1. 将肌肉组织从营养培养基转移至生物安全柜或其他无菌工作区域内的无菌培养皿中。
    2. 使用无菌手术刀片将组织切成约 1 mm 的碎块3 片
  2. 洗涤切碎的活检组织以去除残留碎片。
    1. 将肌肉组织转移至含有10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）的15 mL锥形管中，静置使组织自然沉降。
    2. 吸除上清液，注意不要扰动肌肉组织。
    3. 向洗涤后的组织中加入 10 mL PBS，静置使肌肉组织自然沉降。
    4. 吸除上清液，注意不要扰动肌肉组织。
    5. 加入10 mL低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），静置使组织自然沉降。
    6. 吸除上清液，注意不要扰动肌肉组织。
  3. 将组织在消化液中孵育。
    1. 将肌肉组织重悬于3 mL消化液（含2 mg/mL胶原酶D的低糖DMEM）中。
      注意：胶原酶D储存液可配制成20 mg/mL的低糖DMEM溶液，于-80 °C保存；使用时用低糖DMEM按1:10稀释。
    2. 将含有肌肉组织的试管置于37 °C水浴中孵育30 min。
    3. 每10分钟使用10 mL血清移液管吹打混悬液一次 或宽口移液管。
    4. 加入83 µL额外的消化液和24 µL分散酶溶液（含0.76 mM醋酸钙、1.39 mM醋酸钠、13.91 mg/mL分散酶II的低糖DMEM）。将细胞悬液放回37 °C水浴中。
    5. 每隔5−10分钟用宽口移液器吸头吹打肌肉组织悬液一次。
    6. 继续研磨直至形成均匀的混悬液，且研磨时间不超过1.5小时，以防止过度消化。
      注意： 组织的充分剪碎以及胶原酶和分散酶的酶活性可能影响样本消化效果。应获得均匀的悬液 通过普通移液器吸头 1.5 小时后出现轻微堵塞。若 1.5 小时后仍未形成均匀的悬液，请重新检查组织剪切是否充分，并确认组织已剪切至适当大小（步骤 2.1.2）。此外，应检测酶的活性，因为不同批次间的酶活性可能存在差异。
  4. 离心收集细胞，并在复苏培养基中冷冻保存。
    1. 向肌肉匀浆中加入6 mL生长培养基（GM；79% Ham's F12，20%胎牛血清，1%青霉素/链霉素，5 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子[bFGF]，pH 7.4，经0.22 µm滤器过滤）。
    2. 将悬液通过70 µm细胞滤筛移入50 mL锥形管中。用额外的4 mL GM冲洗滤筛。
      注意： 样品可转移回15 mL离心管，以便于观察沉淀。如果后续细胞得率较低，可使用较大的洗涤体积。
    3. 以 300 x 离心 g 室温（RT）下孵育5分钟。
    4. 吸弃上清液，注意不要扰动沉淀。轻弹管壁，使沉淀在残留的培养基中重新悬浮。如果细胞不立即进行培养，请参照步骤2.4.5进行长期保存操作；否则，进入步骤3.1.6。
      注意： 若需立即进行培养，应在开始活检样本处理之前，预先孵育细胞培养板中的生长培养基（步骤 3.1.1 和 3.1.2）。
    5. 加入1.5 mL复苏细胞培养冻存液（材料表) 加入到回收的沉淀中。
    6. 将悬液转移至冻存管中。将冻存管置于异丙醇控速降温盒中，于-80 °C过夜。随后将冻存管在-80 °C保存，直至准备进行培养。
      注意： 含有悬液的冻存管可在液氮中长期保存（超过1个月）。使用异丙醇控制速率的冷冻装置可使细胞以1 °C/min的速率可重复地冷冻，从而获得最佳的细胞复苏率，这由冻存后的细胞活力以及细胞更易贴附于细胞培养容器的表现得以证实。9或者，可使用盛有室温异丙醇并置于-80 °C超低温冰箱中的烧杯。

3. 培养人类肌肉前体细胞

  1. 解冻肌肉 泥浆
    1. 在解冻和接种人源肌肉前体细胞（hMPCs）之前，需用生长培养基（GM）预先平衡细胞培养板。向经I型胶原蛋白包被的24孔细胞培养板中的4个孔各加入250 µL GM。其余孔中加入500 µL无菌基础培养基（如F12），以防止长期培养过程中培养基蒸发。
      注意： 对于50 g至100 g之间的活检组织，使用24孔板中的4个孔较为合适。若活检组织小于50 g，则使用2个孔可能更为适宜。由于残留碎片较多且细胞数量较少，此步骤无法采用细胞计数技术；因此，接种密度未予精确确定，且不同活检样本之间略有差异。
    2. 将细胞培养容器置于37 °C、5% CO₂条件下，用GM培养基孵育。2 接种前孵育1小时。
    3. 从-80 °C冰箱中取出冻存管，放入37 °C水浴中；冻存管内的液体应完全浸没于水中。
    4. 当解冻接近完成时（约5分钟），将冻存管转移至无菌超净工作台。将肌肉匀浆从冻存管中移出，并以1 mL/min的速度加入含有6 mL预热生长培养基（GM）的15 mL锥形管中。
    5. 将肌肉匀浆在300 x g下离心 g 室温下孵育5分钟。
      注意： 使用水平转子离心机有助于在此步骤中观察微小沉淀物，但并非必需。
    6. 吸弃上清液，注意不要扰动沉淀。轻弹管壁，用残留的培养基重悬沉淀，并加入1 mL生长培养基（GM）重悬。
    7. 将250 µL重悬的沉淀物（现视为hMPC悬液）转移至预孵育的24孔细胞培养板中的4个孔内。
  2. 原代人肌肉前体细胞的培养与传代
    1. 在37 °C、5% CO₂条件下，用GM培养基维持hMPC培养2.
      注意： 不含bFGF的生长培养基储备液（即F12、抗生素、FBS）需分批配制，4 °C保存，最多可保存2周。bFGF在使用当天加入生长培养基中。含bFGF的培养基可在4 °C保存48小时。
    2. 分离后24小时，吸除生长培养基（GM），用预热的生长培养基轻柔洗涤培养容器2次，然后加入新鲜生长培养基。
      注意： 24 小时应足以使hMPCs充分贴壁；洗涤后不应有hMPCs被去除。此步骤还可清除细胞收获过程中残留的碎片，使培养容器更适用于使用成像细胞仪进行准确的汇合度扫描（见下文第5节）。完成首次换液后，每48小时更换一次GM。
    3. 当人源肌肉前体细胞（hMPCs）达到70%融合度，或已在同一培养皿中培养10天时， whichever 先出现即进行传代。
      注意： 70% 汇合度约为 55,000 个细胞/cm²2.
    4. 传代时，向24孔细胞培养板的每孔中加入250 µL预热的胰蛋白酶，孵育约5分钟。
    5. 轻敲细胞培养容器的底部，以使人源肌肉前体细胞（hMPCs）脱落。可使用光学显微镜确认hMPCs是否已脱离培养表面。
    6. 将胰蛋白酶/hMPC悬浮液转移至含有5 mL生长培养基的15 mL锥形管中。
    7. 将 hMPC 悬液在 300 x g 室温下孵育5分钟。
    8. 从离心机中取出hMPC悬液，置于无菌超净台中的冰上。
      注意： 传代过程中将hMPCs置于冰上可减少细胞聚集。
    9. 吸弃hMPCs的上清液，用1 mL生长培养基轻柔重悬沉淀。
    10. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。
      注意： 细胞悬液与细胞计数缓冲液按1:5稀释通常较为合适。
    11. 将人源间充质前体细胞（hMPCs）接种于含预热生长培养基（GM）的胶原蛋白包被培养皿中，接种密度为每平方厘米3,500个细胞210 cm 培养皿与 24 孔板的组合最为理想。24 孔板可每日在成像细胞仪上扫描，以监测细胞生长情况。
    12. 后续传代均按照相同步骤（从3.2.4步开始）进行。
      注意： 可通过连续传代过程中细胞衰老标志物（如 β-半乳糖苷酶）和 Pax7 免疫染色来监测细胞活力与纯度。
  3. 冻存人源肌肉前体细胞（hMPCs）。
    1. 将多余的细胞冷冻保存以备后续使用，从而使培养体积更易于管理。
    2. 进行冷冻保存时，请按照步骤 3.2.4–3.2.9 中所述的胰蛋白酶消化程序操作。
    3. 在细胞悬液离心的同时，配制20%（如200 µL）二甲基亚砜（DMSO）与80%（如800 µL）生长培养基（GM）的混合液。上下吹打20次以确保充分混匀。将混合液置于冰上静置备用。
    4. 根据细胞计数，将hMPC悬液稀释至2 x 106/mL，在GM中。
    5. 将hMPC悬液与20%无菌DMSO/80% GM混合液按1:1体积比混合。最终冻存培养基为含10% DMSO和90% GM的混合液，其中细胞密度为1 × 10⁶ cells/mL6 hMPCs/mL
    6. 将3.3.5步骤中制备的hMPC悬液按初始细胞计数所能分配的数量，取1 mL分装至若干冻存管中。随后将分装的hMPC置于异丙醇控速降温盒中，于-80 °C冰箱过夜。
      注意： 此步骤通常可获得500万至1500万个细胞，其中通过FACS鉴定约30−60%为hMPCs。

4. 通过流式细胞术分离 Pax7+ 人肌肉前体细胞

  1. 为制备来自活体培养物的hMPCs（步骤3.2.11），用胰蛋白酶消化足够数量的培养容器，以获得1 × 10⁶个细胞6−2 × 106 总细胞数。按照步骤 3.2.4−3.2.9 所述制备细胞悬液。
  2. 从冻存培养物中制备hMPCs（步骤2.4.6或3.3.6）。
    1. 选择1−2个含有约1 x 10的试管6 每个供体的hMPCs传代四次。
      注意： 使用第4代hMPC可获得足够的细胞产量，同时仍能维持其增殖潜能至第6代（图2).
    2. 通过快速解冻细胞 从-80 °C冰箱中取出，放入37 °C水浴中，确保管内液体完全浸没。
    3. 当解冻接近完成时（约5分钟），将hMPCs转移至无菌超净台，以1 mL/min的速度将细胞悬液全部转移至含有6 mL预热生长培养基的15 mL锥形离心管中。
    4. 按照步骤 3.2.7−3.2.9 所述制备细胞悬液。
    5. 将每个沉淀重悬于3 mL FACS缓冲液中（500 mL PBS，12.5 mL正常山羊血清，2 mL 0.5 M EDTA，pH 7.4，经0.22 µm滤器过滤）。
    6. 将细胞悬液在300 x g 室温下孵育5分钟。
    7. 吸弃hMPCs的上清液，用250 µL FACS缓冲液轻柔重悬沉淀，置于冰上。
    8. 加入100 µL的 将细胞置于1.7 mL 微型离心管中，冰上放置，用作活/死细胞对照（步骤4.5.1）。
      注意：用于活/死细胞对照的100 μl细胞可来自每个待分选供体的重悬细胞中取出的小部分体积（约20 μl），也可来自冻存的细胞。
      注意：从单个供体中重悬的细胞取样量不应超过 20 μl。若体积不足，用 FACS 缓冲液补至 100 μl。 < 可提供 100 μl 细胞。
  3. 对人源间充质祖细胞（hMPCs）进行细胞表面标志物染色。
    1. 配制以下抗体混合液（所示用量针对每份培养物，可根据需要适当放大）：5 µL CD56（神经细胞黏附分子 [NCAM]；PE-Cy7标记）和5 µL CD29（β1-整合素；AlexFluor488标记）。最终抗体稀释比例为1:50。
    2. 向每份hMPC悬液中加入10 µL抗体混合液，置于冰上避光孵育30分钟。
    3. 向每份悬浮液/抗体混合液中加入 10 mL FACS 缓冲液。
    4. 将每支试管在室温下以300 × g离心5分钟。
    5. 将沉淀重悬于300 µL FACS缓冲液中，转移至5 mL圆底聚苯乙烯管。
    6. 将悬液置于冰上并避光保存。
  4. 制备补偿微珠。
    注意：     应使用补偿微珠制备每种抗体的阳性对照以及阴性对照（未染色微珠）。在上样分选前，需先在流式细胞仪上运行补偿微珠对照。这些对照可用于确定每种荧光染料在其他检测通道中的信号溢出程度，从而进行补偿调节。
    1. 涡流补偿珠
    2. 在三个1.7 mL微量离心管中，各加入一滴（50 µL）补偿微珠。
    3. 向每个适当的试管中加入 1 µL 的相应抗体，阴性对照组不加抗体。
    4. 避光孵育15分钟。
    5. 向每管中加入 1.5 mL FACS 缓冲液，涡旋混匀。
    6. 每管以 300 x 离心 g 在台式离心机中于室温下离心5分钟。
    7. 吸弃上清液，将沉淀重悬于200 µL FACS缓冲液中。
      注意： 沉淀可能极难观察，吸取上清液时应格外小心。
    8. 将悬液置于5 mL圆底聚苯乙烯管中，置于冰上避光保存。
  5. 制备活细胞和死细胞对照。
    1. 将步骤4.2.8中的100 µL hMPCs分装至两个1.7 mL微量离心管中（一个用于活细胞对照，一个用于死细胞对照）。
    2. 将死亡对照管置于预热至 70 °C 的加热块中 >10 分钟。在此期间，将活体对照置于冰上。
    3. 每管以 300 x g 离心 g 在台式离心机中于室温下离心5分钟。
    4. 吸弃上清液，将沉淀重悬于150 µL FACS缓冲液中。
    5. 将活/死对照合并为一个单一的5 毫升圆底聚苯乙烯管
  6. 进行活力染色。
    1. 向所有含待分选细胞的试管以及活/死细胞对照管中加入 1 µL 7-氨基放线菌素 D（7-AAD）。
    2. 将GM加入已包被胶原的24孔板（每孔250 µL）和10 cm板（每孔8 mL）中，置于37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中平衡。2.
  7. 通过流式细胞术分选人源间充质祖细胞（hMPCs）。
    1. 使用配备100 µm喷嘴、压力为20 psi的流式细胞仪对hMPCs进行分选。根据侧向散射和前向散射以及7-AAD阴性来确定活hMPCs（分选参数及代表性分选结果见于 图3).
    2. PE-Cy7（780/60 nm）和AlexFluor488（530/30 nm）阳性的细胞代表CD56+/CD29+ 细胞，因此为Pax7阳性细胞（hMPCs）。将双阳性细胞分选至含有300 µL FACS缓冲液垫层的收集管中。
      注意： 分选后培养物的纯度可通过Pax7免疫染色，随后进行流式细胞术分析来确定（图4).
    3. 弃去所有其他细胞。
    4. 将分选后的细胞转移至15 mL锥形管中。
    5. 将hMPC悬液在300 x g 室温下孵育5分钟。
    6. 小心吸除上清液，并用1 mL GM重悬。
    7. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。
      注意： 尽管可通过阳性分选的事件数来推断细胞数量，但与传统细胞计数方法相比，该计数方法已被发现会高估细胞数量10%–40%。
    8. 按照步骤 3.2.11 中所述方法接种 hMPCs。
      注意： 可通过Pax7免疫染色及流式细胞术分析来验证hMPC群体的纯度。

5. 使用成像细胞仪表征人肌肉前体细胞 (hMPC) 培养物

  1. 使用成像细胞仪（材料表）进行汇合度扫描。
    1. 选择 创建新扫描，然后输入或选择 板类型、板配置文件 和 板编号。成像细胞仪可兼容 96 孔、24 孔和 6 孔板。
    2. 在 应用 下，选择 汇合度 > 汇合度 1。
    3. 使用屏幕右侧的导航器选择要查看的孔。
    4. 找到一个焦平面，使细胞相对于背景呈现白色，然后选择 手动注册，或通过选择 自动注册 让成像细胞仪自动选择焦平面。
      注意：对于 材料表 中推荐的 96 孔板，建议位置约为 4.3 单位。
    5. 使用鼠标高亮所有需要扫描的孔。系统将自动扫描整个孔区域。选择 开始扫描。
    6. 选择适用于板型和细胞类型的分析设置。
      注意：对于 hMPCs，以下设置为最优：强度 = 6，饱和强度 = 0，直径 = 8，最小厚度 = 3，最小簇大小 = 500，精度 = 高。
    7. 选择 开始分析。
      注意：需目视检查图像，确保用户与成像细胞仪对细胞边界的识别一致。若存在较大差异，应使用不同的焦平面或分析参数重新扫描。汇合度扫描可用于比较不同培养物之间的生长情况、确定处理剂给药时间，或监测细胞状态以决定何时启动分化。如需进行分化，详见第 6 节。
  2. 使用成像细胞仪进行细胞计数。
    1. 配制染色液：包含 12 mL Ham's F12 培养基、6 µL Hoechst 33342 和 24 µL 碘化丙啶。
    2. 吸除培养基，加入染色液，在 37 °C 下孵育 15 分钟。
    3. 吸除染色液，替换为 Ham's F12 培养基。
      注意：应使用酚红含量较低的培养基以获得清晰图像。也可使用 PBS 替代。
    4. 将板放入成像细胞仪，在 应用 下选择 细胞活力 > 活细胞 + 死细胞 + 总细胞。活细胞通道为明场图像，死细胞通道为碘化丙啶信号，总细胞通道为 Hoechst 33342 信号。
    5. 将 活细胞 通道设为明场，并在 聚焦设置 下点击 自动注册。
    6. 在 总细胞 通道下，将通道设为蓝色。使用 查找焦点 功能使细胞核清晰对焦，或使用上下箭头手动调节焦点。点击 设置偏移 以确认焦点位置。
    7. 在 死细胞 通道下，将通道设为红色。使用 查找焦点 功能使死细胞清晰对焦，或使用上下箭头手动调节焦点。点击 设置偏移 以确认焦点位置。
    8. 选择 开始扫描 以启动扫描。
    9. 选择适用于板型和细胞类型的分析参数，然后选择 开始分析。分析完成后，需目视验证分析结果是否准确计数细胞（例如，在总细胞通道中，确认每个细胞核均被正确识别，且成像细胞仪未将背景中的任意斑点误判为细胞核）。若扫描和分析结果满意，则将板放回培养箱；否则应重新扫描或调整分析参数。

6. 将人肌肉前体细胞（hMPCs）分化为肌管细胞

  1. 使用第 5.1 节中的方案确定 hMPC 的汇合度。为将 hMPC 分化为成肌管，理想情况下细胞汇合度应达到 80−85%，该数值由成像细胞仪的汇合度检测功能确定（见第 5 节）。若使用来自多个不同供体的 hMPC，可通过汇合度扫描使不同供体的细胞在达到汇合时即开始分化。
    注意：当汇合度为 80% 时，细胞密度约为 66,000 个/cm2。
  2. 用分化培养基（97% Ham's F12，2% 马血清，1% 青霉素/链霉素，pH 7.4，经 0.22 µm 滤器过滤）洗涤细胞 2 次。
  3. 根据实验要求，在整个实验期间使用分化培养基维持细胞培养，并每日更换培养基。
  4. 通过胚胎型肌球蛋白重链的免疫染色直接评估成肌管的形成情况，该标志物通常在分化开始后 7−10 天可被检测到。
    注意：成肌管形成所需时间可能因供体差异以及开始分化时的细胞数量而略有不同；因此，建议对每个供体来源的培养物进行单独监测。

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结果

人肌肉组织中hMPC分离的代表性流式细胞术结果见图1。首先根据侧向散射和前向散射对事件设门，以排除死细胞或碎片，再选择7-AAD阴性细胞以确保细胞活性，从而鉴定hMPC。同时表达细胞表面标志物CD56和CD29的细胞即为hMPC群体。仅60 mg的活检组织大约可获得75−250个hMPC。

典型的汇合度扫描结果如图2A所示。图2B中的绿色轮廓由成像细胞仪生成，展示了成像细胞仪如何根据所选的分析设置来确定细胞汇合度。在所示的两幅图像中，成像细胞仪测定的汇合度与用户通过肉眼判断的汇合度一致。然而，这些图像也揭示了成像细胞仪并非完美无缺。例如，红色箭头所指为培养板上的一个缺陷区域，该区域被误识别为细胞。如果培养板上存在大量此类缺陷，则最终的汇合度结果将无法准确反映实际的细胞汇合情况...

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讨论

原代人肌源性祖细胞（hMPCs）是研究骨骼肌生物学及再生过程的重要实验模型，此外，hMPCs 还具有用于治疗的潜力。然而，在科研和治疗中应用原代 hMPCs 仍存在一些公认的挑战，包括对来源于人类的细胞认知尚不充分10。不同供体来源的细胞培养物在扩增能力方面也存在较大差异，这限制了 hMPCs 的应用潜力，并可能影响研究结果的可重复性11。例如，最近的研究表明，采用本实验方案所述方法分离得到的 hMPCs，其扩增能力存在差异，而这种差异是由转录谱驱动的，且与供体的性别或年龄无关11。

本文介绍一种高效且高产量的方法，可分离获得足够数量的人源肌肉前体细胞（hMPCs），用于多种后续实验应用，包括向肌管细胞分化，从而在体外模拟肌生成过程。本方法依赖流式细胞分选技术（FACS）分离CD56+/CD29+细胞，此类细胞此前已被鉴定为富含表达Pax7的细胞群体12

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢康奈尔大学生物技术资源中心成像设施在荧光激活细胞分选方面的帮助。我们还感谢 Molly Gheller 在受试者招募方面的协助，以及 Erica Bender 进行骨骼肌活检的工作。最后，感谢所有受试者为本研究付出的时间与积极参与。本研究由美国国立卫生研究院下属国家衰老研究所资助，资助编号为 R01AG058630（资助对象：B.D.C. 和 A.E.T.）；同时获得医学研究格伦基金会与美国衰老研究联合会青年教员资助项目（资助对象：B.D.C.）以及康奈尔大学妇女总统委员会（资助对象：A.E.T.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTACorning25-053-Cl用于从细胞培养器皿中消化贴壁的hMPCs
10 cm 细胞培养板VWR664160用于培养hMPCs 的培养板
15 mL Falcon 管Falcon352196在hMPC 分离和培养流程中全程使用的 15 mL 锥形管
24 孔细胞培养板Grenier Bio-One662 160用于培养hMPCs 的培养板
7-AAD 活性染色液eBioscience00-6993-50在 FACS 分选过程中用于识别活细胞的活性染料
Alexa Fluor 488 标记抗人 CD29 抗体，克隆号：TS2/16BioLegend303016用于 FACS 的偶联抗体 
黑色 96 孔细胞培养板Grenier Bio-One655079适用于使用 Celigo S 进行荧光成像的 96 孔细胞培养板
Celigo SNexcelcom Bioscience用于追踪hMPC 培养的成像细胞仪
细胞滤网VWR352350在骨骼肌活检组织处理过程中用于去除大块碎片的细胞滤网
Ⅰ型胶原蛋白（大鼠尾来源）Corning354236用于包被细胞培养板的胶原蛋白 
胶原酶 DRoche11 088 882 001用于降解骨骼肌活检组织中的胶原蛋白及其他结缔组织
二甲基亚砜VWRWN182用于hMPCs 的冷冻保存
中性蛋白酶 IISigma Life SciencesD4693用于骨骼肌活检组织酶解消化的蛋白酶
低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基粉末Gibco31600-034用于骨骼肌活检组织处理的低糖 DMEM
Dulbecco 磷酸盐缓冲液Gibco21600-010用于骨骼肌活检组织处理的 PBS
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物J.T. Baker4040-01 FACS 缓冲液所需试剂
胎牛血清VWR89510-186 用于hMPC 生长培养基的胎牛血清
Ham's F12 培养基Gibco21700-026hMPCs 的基础培养基
热灭活马血清Gibco26-050-070用于配制hMPC 分化培养基的马血清
血细胞计数板iNCytoDHC-N0105用于细胞计数
Hibernate A 培养基GibcoA1247501用于保存骨骼肌活检组织的培养基
Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物Life TechnologiesH21492用于通过 Celigo S 识别所有细胞的 DNA 染料
异丙醇Fisher ScientificA416P-4用于hMPCs 的程序控速冷冻
Moxi 缓冲液OrfloMXA006自动细胞计数仪专用缓冲液
Moxi 细胞计数卡盒OrfloMXC002自动细胞计数仪专用卡盒
Moxi z Mini 自动细胞计数仪Orflo自动细胞计数仪
Mr. Frosty 冷冻容器Thermo Fisher Scientific5100-0001市售的程序控速细胞冷冻容器
正常山羊血清（10%）Thermo Fisher Scientific50062Z用于 FACS 缓冲液的山羊血清
PE-Cy7 标记小鼠抗人 CD56 抗体，克隆号：B159BD Pharmingen557747用于 FACS 的偶联抗体 
青霉素/链霉素 100 倍溶液Corning30-002-CI添加至培养基中的抗生素
碘化丙啶Thermo Fisher ScientificP3566用于通过 Celigo S 识别死细胞的 DNA 染料
重组人碱性成纤维细胞生长因子PromegaG5071添加至hMPC 生长培养基中以防止自发分化的补充因子
Recovery 细胞培养冷冻保存液 Gibco12648-010用于冷冻保存肌肉活检悬液的培养基
碳酸氢钠Fisher ScientificS233-3添加至 Ham's F12 培养基中
无菌圆底 5 mL 管VWR60818-565用于 FACS 的试管
UltraComp eBeadseBioscience01-2222-42用于校准流式 FACS 设置的补偿微珠

参考文献

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. D'Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
  3. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657(2012).
  4. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
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  7. Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
  8. Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
  9. Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Cryopreservation and thawing of cells. Current Protocols in Immunology. , Appendix 3, 3G (2012).
  10. Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy - from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2(2013).
  11. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
  12. Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).

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Pax7 CD56 CD29

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