从骨骼肌活检手术中分离、培养、鉴定及诱导人肌肉前体细胞分化

摘要

我们介绍了从骨骼肌活检组织中分离、培养、鉴定和诱导人原代肌前体细胞（hMPCs）的技术。 通过这些方法获得并鉴定的hMPCs可用于后续研究，以探讨与人类肌生成及骨骼肌再生相关的问题。

摘要

使用原代人体组织和细胞是研究生物学及生理学过程（如骨骼肌再生过程）的理想选择。然而，在使用人原代成体干细胞时存在公认的挑战，尤其是来源于骨骼肌活检的人肌肉前体细胞（hMPCs），其主要问题包括从采集组织中获得的细胞产量较低，以及不同供体来源的细胞在生长和死亡参数方面存在较大异质性。尽管在实验设计中纳入这种异质性需要更大的样本量才能检测到显著效应，但它也使我们能够识别影响hMPC 扩增能力差异的潜在机制，从而更深入地理解骨骼肌再生过程中的异质性。揭示能够区分不同培养物扩增能力的新型机制，有望推动改善骨骼肌再生能力的治疗策略的开发。

引言

骨骼肌是人体最大的器官系统，占全身质量的30−40%¹。除了在运动中发挥公认的作用外，骨骼肌还维持体温和身体姿势，并在全身营养物质稳态中起核心作用。涉及人类受试者、动物和细胞培养模型的研究对于解答骨骼肌生物学和再生相关问题均具有重要价值。分离和培养人原代肌肉前体细胞（hMPCs）提供了一个可靠的模型，使得细胞培养技术和操作能够应用于人类样本。使用hMPCs的一个优势在于它们保留了每个供体的遗传和代谢表型^2,3。供体表型的维持使研究人员能够考察肌源性过程中个体间的差异。例如，我们已采用hMPC表征方法鉴定出hMPC群体扩增能力中与年龄和性别相关的差异⁴。

本实验方案的目的是详细阐述从骨骼肌活检组织中分离、培养、鉴定和诱导分化 hMPCs 的技术。在先前研究的基础上，这些研究描述了 hMPCs 并鉴定了可用于 hMPCs 分离的潜在细胞表面标志物^5,6，本方案填补了从细胞分离到细胞鉴定之间的重要知识空白。此外，本方案中包含的详细分步操作说明，使得 hMPCs 的分离与鉴定对广大科研人员而言更加易于实施，包括那些此前对 hMPCs 操作经验有限的....

方案

本方案已获得康奈尔大学机构审查委员会的批准。所有参与者均经过潜在健康状况的筛查，并签署了知情同意书。

1. 通过骨骼肌活检获取人体肌肉组织

1. 通过触诊、解剖标志以及肌肉主动收缩来确定股外侧肌的位置。
2. 让受试者收紧股四头肌，通过触诊找到股外侧肌的肌腹，其位置大约位于髌骨至髋关节距离的三分之一处，且紧邻股骨的腹外侧。
3. 使用纸质卷尺测量，并用外科标记笔在髌骨上缘约4−6英寸处标记出代表肌腹的区域。
4. 剃除标记区域附近的毛发，然后使用医疗操作前常用的外科级消毒剂进行清洁（例如：2%葡萄糖酸氯己定（CHG）/ 70%异丙醇（IPA））。
5. 用1%利多卡因对活检部位进行局部麻醉。
   注意：避免将利多卡因注射入骨骼肌内。
6. 在标记部位做一长度为4−5 mm的切口通道。
7. 待区域麻醉完成后，将带有穿刺针芯的伯格斯特伦针（Bergstrom needle）穿过筋膜，插入肌肉肌腹内（深度约2−3 cm）。
8. 在助手通过抽吸连接的60 mL注射器活塞施加负压的同时，将切割用穿刺针芯回撤2−3 cm，使肌肉组织被吸入伯格斯特伦针内。
9. 关闭切割腔。
10. 旋转活检针基部四分之一圈，重复打开针头、施加负压、关闭针头的操作步骤。
    注意：

结果

可从图1中查看从人肌肉组织中分离人肌肉前体细胞（hMPC）的代表性流式细胞术结果。首先根据侧向散射和前向散射对事件设门，以排除死细胞或碎片，再选择7-AAD阴性细胞以确保细胞具有活性，从而鉴定hMPC。同时表达细胞表面标志物CD56和CD29的细胞即为hMPC群体。仅60 mg的活检组织大约可获得75−250个hMPC。

典型的汇合度扫描结果如图2A所示。图2B中的绿色轮廓由成像细胞仪生成，展示了成像细胞仪如何根据所选的分析设置来确定细胞汇合度。在所示的两幅图像中，成像细胞仪测定的汇合度与用户通过肉眼判断的汇合度一致。然而，这些图像也揭示了成像细胞仪并非完美无缺。例如，红色箭头指示的是培养板上的一个缺陷区域，该区域被误识别为细胞。如果培养板上存在大量此类缺陷，则最终的汇合度结.......

讨论

原代人肌源性祖细胞（hMPCs）是研究骨骼肌生物学及再生过程的重要实验模型，此外，hMPCs 还具有用于治疗的潜力。然而，在科研和治疗中应用原代 hMPCs 仍存在一些公认的挑战，包括对来源于人类的细胞认知尚不充分¹⁰。不同供体来源的细胞培养物在扩增能力方面也存在较大差异，这限制了 hMPCs 的应用潜力，并可能影响研究结果的可重复性¹¹。例如，最近的研究表明，采用本实验方案所述方法分离得到的 hMPCs，其扩增能力存在差异，而这种差异是由转录谱驱动的，且与供体的性别或年龄无关¹¹。

本文介绍一种高效且高产量的方法，可分离获得足够数量的人源肌肉前体细胞（hMPCs），用于多种后续实验应用，包括向肌管细胞分化，从而在体外模拟肌生成过程。本方法依赖流式细胞分选技术（FACS）分离CD56⁺/CD29⁺细胞，此类细胞此前已被鉴定为富含表达Pax7的细胞群体¹²

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	用于从细胞培养器皿中消化贴壁的hMPCs
10 cm 细胞培养板	VWR	664160	用于培养hMPCs 的培养板
15 mL Falcon 管	Falcon	352196	在hMPC 分离和培养流程中全程使用的 15 mL 锥形管
24 孔细胞培养板	Grenier Bio-One	662 160	用于培养hMPCs 的培养板
7-AAD 活性染色液	eBioscience	00-6993-50	在 FACS 分选过程中用于识别活细胞的活性染料
Alexa Fluor 488 标记抗人 CD29 抗体，克隆号：TS2/16	BioLegend	303016	用于 FACS 的偶联抗体
黑色 96 孔细胞培养板	Grenier Bio-One	655079	适用于使用 Celigo S 进行荧光成像的 96 孔细胞培养板
Celigo S	Nexcelcom Bioscience		用于追踪hMPC 培养的成像细胞仪
细胞滤网	VWR	352350	在骨骼肌活检组织处理过程中用于去除大块碎片的细胞滤网
Ⅰ型胶原蛋白（大鼠尾来源）	Corning	354236	用于包被细胞培养板的胶原蛋白
胶原酶 D	Roche	11 088 882 001	用于降解骨骼肌活检组织中的胶原蛋白及其他结缔组织
二甲基亚砜	VWR	WN182	用于hMPCs 的冷冻保存
中性蛋白酶 II	Sigma Life Sciences	D4693	用于骨骼肌活检组织酶解消化的蛋白酶
低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基粉末	Gibco	31600-034	用于骨骼肌活检组织处理的低糖 DMEM
Dulbecco 磷酸盐缓冲液	Gibco	21600-010	用于骨骼肌活检组织处理的 PBS
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物	J.T. Baker	4040-01	FACS 缓冲液所需试剂
胎牛血清	VWR	89510-186	用于hMPC 生长培养基的胎牛血清
Ham's F12 培养基	Gibco	21700-026	hMPCs 的基础培养基
热灭活马血清	Gibco	26-050-070	用于配制hMPC 分化培养基的马血清
血细胞计数板	iNCyto	DHC-N0105	用于细胞计数
Hibernate A 培养基	Gibco	A1247501	用于保存骨骼肌活检组织的培养基
Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物	Life Technologies	H21492	用于通过 Celigo S 识别所有细胞的 DNA 染料
异丙醇	Fisher Scientific	A416P-4	用于hMPCs 的程序控速冷冻
Moxi 缓冲液	Orflo	MXA006	自动细胞计数仪专用缓冲液
Moxi 细胞计数卡盒	Orflo	MXC002	自动细胞计数仪专用卡盒
Moxi z Mini 自动细胞计数仪	Orflo		自动细胞计数仪
Mr. Frosty 冷冻容器	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	市售的程序控速细胞冷冻容器
正常山羊血清（10%）	Thermo Fisher Scientific	50062Z	用于 FACS 缓冲液的山羊血清
PE-Cy7 标记小鼠抗人 CD56 抗体，克隆号：B159	BD Pharmingen	557747	用于 FACS 的偶联抗体
青霉素/链霉素 100 倍溶液	Corning	30-002-CI	添加至培养基中的抗生素
碘化丙啶	Thermo Fisher Scientific	P3566	用于通过 Celigo S 识别死细胞的 DNA 染料
重组人碱性成纤维细胞生长因子	Promega	G5071	添加至hMPC 生长培养基中以防止自发分化的补充因子
Recovery 细胞培养冷冻保存液	Gibco	12648-010	用于冷冻保存肌肉活检悬液的培养基
碳酸氢钠	Fisher Scientific	S233-3	添加至 Ham's F12 培养基中
无菌圆底 5 mL 管	VWR	60818-565	用于 FACS 的试管
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	用于校准流式 FACS 设置的补偿微珠