本文介绍了两种用于表征B淋巴细胞在免疫突触（IS）形成过程中细胞极化事件的方法。第一种方法涉及对细胞器向突触膜募集以及细胞骨架在突触膜处重排的定量分析。第二种为生化方法，用于表征发生向免疫突触极化的中心体在组成上的变化。
本文内容
摘要
摘要
表面锚定抗原的识别 通过B细胞受体（BCR） 触发免疫突触（IS）的形成，其中包含信号传导 并且抗原摄取是协调进行的。免疫突触（IS）的形成涉及动态的肌动蛋白重塑，同时伴随着中心体及与其相关的细胞内细胞器（如溶酶体和高尔基体）向突触膜的极化募集。肌动蛋白重塑的初始阶段使B细胞能够增加其细胞表面积，从而最大限度地富集突触处的抗原-BCR复合物。在某些条件下，当B细胞识别与刚性表面相关的抗原时，该过程会伴随溶酶体的局部募集与分泌，进而促进抗原的提取。被摄取的抗原 被内化到特化的内体-溶酶体区室中，加工成肽段，随后装载于主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）上，进一步呈递给辅助性T细胞。因此，研究与免疫突触（IS）形成相关的细胞器动态对于理解B细胞的活化机制至关重要。本文将讨论用于研究B细胞中免疫突触形成过程中细胞内细胞器定位变化及细胞骨架重排的成像技术和生物化学方法。
引言
B淋巴细胞是适应性免疫系统的重要组成部分，负责针对不同威胁和入侵病原体产生抗体。抗体产生的效率取决于B细胞获取、加工并呈递可溶性或表面锚定形式抗原的能力1,2。当B细胞受体（BCR）识别呈递细胞表面附着的抗原时，会形成一种紧密的细胞间接触结构，称为免疫突触（IS）3,4。在此动态平台上，既发生BCR依赖性的下游信号传导，也进行抗原向内体-溶酶体区室的内化。摄入的抗原被加工处理后，装载到MHC-II类分子上，并进一步呈递给T淋巴细胞。有效的B-T细胞相互作用，即B-T细胞协作，使B淋巴细胞获得适当信号，从而促进其分化为抗体分泌型浆细胞或记忆细胞8。
B细胞提取抗原涉及两种机制。第一种机制依赖于溶酶体来源的蛋白酶的分泌，这些蛋白酶被招募并融合至免疫突触间隙5,6。第二种机制依赖于肌球蛋白IIA介导的牵拉力，促使含有抗原的膜发生内陷，并被内吞至网格蛋白包被的小窝中7。抗原提取的方式取决于抗原所在膜的物理特性。然而，在这两种情况下，B细胞均经历两个主要的重塑过程：肌动蛋白细胞骨架的重组以及细胞器向免疫突触（IS）的极化。肌动蛋白细胞骨架的重塑包括初始的铺展阶段，在此阶段，突触膜上依赖肌动蛋白的突起增加与抗原接触的表面积；随后是收缩阶段，通过分子马达与肌动蛋白细胞骨架重塑的协同作用，将与抗原结合的BCR集中到IS的中心区域8,9,10,11。细胞器的极化也依赖于肌动蛋白细胞骨架的重塑。例如，中心体通过其周围肌动蛋白的局部去聚合而与细胞核解偶联，从而使得该细胞器重新定位至IS5,12。在B细胞中，中心体向细胞一极（即IS）的重新定位可引导溶酶体募集至突触膜，溶酶体一旦分泌，便可促进表面锚定抗原的提取和/或加工6。募集到IS的溶酶体富含MHC-II，有利于在内体区室中形成肽-MHC-II复合物，进而呈递给T细胞13。此外，已有研究观察到高尔基体也被紧密募集至IS14，提示分泌途径中来自高尔基体的囊泡可能参与了抗原的提取和/或加工过程。
B细胞中细胞内细胞器与细胞骨架的重排 在突触形成过程中，高效获取和加工抗原以实现后续活化的关键步骤。本文介绍了用于研究B细胞中与免疫突触（IS）形成相关的细胞器内部重塑的成像和生化分析的详细方案。这些技术包括：（i）利用抗原包被的微珠或抗原包被的盖玻片激活B细胞后进行免疫荧光染色及图像分析，以实现对迁移至IS的细胞内组分的可视化与定量；（ii）通过蔗糖梯度超速离心法分离B细胞中富含中心体的组分，从而鉴定可能参与调控中心体功能的相关蛋白。 细胞极性
方案
注意：以下步骤使用 IIA1.6 B 细胞进行。
1. 使用抗原包被的微珠激活B细胞
- 抗原包被微珠的制备
- 为了激活B细胞，使用NH2-共价包被抗原的珠粒（Ag-包被珠粒），使用50 µL（约20 × 10⁶）制备6 3 µm NH微珠2- 与激活性（BCR-配体+）或非激活性（BCR-配体-）抗原结合的微珠。
- 对于 IIA1.6 B 细胞，使用抗 IgG-F(ab')2 片段作为BCR-配体+和抗IgM-F(ab')2 或以牛血清白蛋白（BSA）作为BCR配体。用于激活原代B细胞或IgM+ B细胞系使用抗IgM-F(ab')2 以BCR-ligand+和BSA作为BCR-ligand-
注意：为避免配体与 Fc 受体结合，应使用 F(ab') 或 F(ab')2 抗体片段而非全长抗体 - 为制备银涂层微珠，将微珠置于低蛋白吸附的微量离心管中，以在样品操作过程中最大限度地回收微珠。加入1 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤微珠，并在16,000 × g条件下离心 g 5 分钟后，吸除上清液。
- 用500 µL 8%戊二醛重悬珠子以活化NH2 分组并在室温下旋转孵育4小时。
警告：戊二醛储备液仅可在化学通风橱中使用。请遵循材料安全数据表（MSDS）中的说明。 - 离心珠子，16,000 x g g 孵育5分钟后，去除戊二醛，再用1 mL 1×PBS洗涤珠子三次。
警告：戊二醛溶液应作为危险化学废物丢弃。 - 将活化的磁珠重悬于 100 µL 1x PBS 中。样品可分装至两个低蛋白结合的微量离心管中：50 µL 用于 BCR-配体+，50 µL 用于 BCR-配体-。
- 准备抗原溶液时，使用两个2 mL低蛋白结合力的微量离心管，每管中含有150 µL PBS配制的100 µg/mL抗原溶液：一管加入BCR-ligand+，另一管加入BCR-ligand-。
- 向每管含有150 µL抗原溶液的试管中加入50 µL活化磁珠溶液，涡旋混匀，并在4 °C旋转孵育过夜。
- 加入500 µL浓度为10 mg/mL的BSA以封闭剩余的活性NH2 珠子上的基团在4 °C下旋转孵育1小时。
- 以 16,000 x g 离心珠子 g 4 °C下离心5分钟，弃上清液。用预冷的1×PBS再洗涤磁珠3次。
- 将活化的磁珠重悬于70 µL的1x PBS中。
- 为确定银涂层微珠的最终浓度，用PBS将少量微珠稀释（1:200），使用血细胞计数板进行计数。随后于4 °C保存，直至使用。
注意：镀银微珠的储存时间不应超过1个月。
- 多聚-L-赖氨酸盖玻片的制备
- 在使用抗原包被的微珠进行B细胞活化实验之前，先准备多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片（PLL-盖玻片）。取一个50 mL离心管，加入40 mL浓度为0.01%（w/v）的PLL溶液，将直径为12 mm的盖玻片浸入溶液中，室温下旋转孵育过夜。
- 用1×PBS清洗盖玻片，并将其置于覆盖有石蜡膜的24孔板盖上晾干。随后进行B细胞激活。
- B细胞活化
- 为了使用磁珠启动B细胞活化，首先将IIA1.6 B细胞系稀释至1.5 × 10⁶6 细胞/mL，置于CLICK培养基中（RPMI-1640添加2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 + 55 µM β-巯基乙醇 + 1 mM 丙酮酸钠 + 100 U/mL 青霉素 + 100 µg/mL 链霉素）+ 5% 热灭活胎牛血清 [FBS]）
- 将100 µL（150,000个细胞）IIA1.6 B细胞与抗原包被的微珠按1:1比例在0.6 mL离心管中混合。用涡旋振荡器轻轻混匀后接种至PLL包被的盖玻片上。在细胞培养孵箱中（37 °C / 5% CO₂）孵育不同时间。2）。典型的激活时间点为 0、30、60 和 120 分钟。对于 0 分钟时间点，将 PLL-盖玻片置于冰上的 24 孔板盖内，加入细胞-抗原包被微珠混合物，在冰上孵育 5 分钟。
注意：必须通过涡旋混合，而不是反复吹打，因为后者可能导致磁珠在移液器吸头的塑料尖端聚集，从而减少样品中的磁珠数量。每次实验均应使用包被有BCR配体阴性对照的磁珠作为阴性对照。建议先启动最长孵育时间的样本，再依次启动后续时间点的样本。应合理计算各样本的激活时间间隔，使其同时完成并准备进行固定处理。 - 向每张盖玻片中加入 100 µL 冷的 1x PBS 以终止激活反应，随后继续进行免疫荧光实验步骤。参见方案第 3 节
2. 抗原包被盖玻片上B细胞的活化
- 抗原包被盖玻片的制备
- 激活前，配制抗原溶液（含10 µg/mL BCR-ligand+ 和0.5 µg/mL 大鼠抗小鼠CD45R/B220的1x PBS溶液）。
注意：建议在实验前一天准备盖玻片。B220可增强B细胞黏附，但BCR-Ligand+已足以引发铺展反应。 - 将12 mm盖玻片置于覆盖有石蜡膜的24孔板盖上，每张盖玻片上加入40 µL抗原溶液，4 °C过夜孵育。密封培养板以防止抗原溶液蒸发。
- 用1×PBS洗涤盖玻片，然后空气干燥。
- 激活前，配制抗原溶液（含10 µg/mL BCR-ligand+ 和0.5 µg/mL 大鼠抗小鼠CD45R/B220的1x PBS溶液）。
- B细胞活化
- 为启动活化，将 IIA1.6 B 细胞稀释至 1.5 x 106 细胞/mL，使用 CLICK 培养基 + 5% FBS。
- 将100 µL细胞加入抗原包被的盖玻片（Ag-coverslip）上，在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育不同时间点进行激活。典型的激活时间点为0、30和60分钟。
注意：与第1节相同，建议从最长的激活时间点开始，以便同时固定所有样本。 - 在0时间点，将含有Ag-盖玻片的24孔板盖置于冰上，并加入细胞。在冰上孵育5分钟。
- 小心吸去每张抗原载玻片上的培养基，然后加入 100 µL 冷的 1x PBS 以终止激活反应。继续进行免疫荧光实验步骤。参见第 3 节。
3. 免疫荧光
注意：为避免二抗与 IIA 1.6 B 细胞的 BCR 发生交叉反应，请勿使用小鼠来源的一抗。
- 移除 1x PBS，然后对每张盖玻片进行固定。
注意：选择何种固定液，请参考抗体/染料的产品说明书。例如，使用鬼笔环肽标记肌动蛋白时应采用多聚甲醛（PFA）固定液；使用抗中心粒周围蛋白（pericentrin）抗体标记中心体时应使用甲醇固定。- 加入 50 µL 含 4% PFA 的 1x PBS，室温孵育 10 分钟。
注意：甲醛具有毒性。使用该化学品前请仔细阅读材料安全数据表（MSDS）。配制 PFA 溶液时必须在通风橱内操作，并佩戴手套和护目镜。PFA 溶液应作为危险化学废物妥善处理。 - 或者，加入 50 µL 冷甲醇，孵育 20 分钟。
- 加入 50 µL 含 4% PFA 的 1x PBS，室温孵育 10 分钟。
- 用 1x PBS 洗涤三次。
注意：此时盖玻片可在 1x PBS 中于 4 °C 最多保存三天。 - 移除 1x PBS，向每张盖玻片上加入 50 µL 封闭缓冲液（含 2% BSA 和 0.3 M 甘氨酸的 1x PBS），室温孵育 10 分钟。
- 轻柔吸除液体，加入 50 µL 通透缓冲液（PB）（含 0.2% BSA 和 0.05% 皂苷的 1x PBS），室温孵育 20 分钟。
- 将抗体或染料用 PB 稀释（每张盖玻片使用 30 µL），室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。更多细节请参见材料表。
- 标记微管组织中心（MTOC）或中心体时，可使用以下抗体：抗 γ-微管蛋白抗体（1:500）、抗 Cep55 抗体（1:500）、抗 α-微管蛋白抗体（1:500）、抗 pericentrin 抗体（1:1000）。
注意：为标记中心体，B 细胞可转染表达 centrin-GFP 的质粒。 - 标记高尔基体时使用抗 Rab6a 抗体（1:500）。
注意：也可使用其他抗体或染料。 - 标记溶酶体时使用抗 Lamp1 抗体（1:200）。
注意：抗 H2-DM 和抗 MHC-II 抗体也可用于标记抗原加工区室15,16。 - 标记内质网时使用抗 Sec61a 抗体（1:500）。
- 标记肌动蛋白细胞骨架时可考虑以下方法：聚合态肌动蛋白可通过与荧光染料偶联的鬼笔环肽进行可视化。
注意：转染了 LifeAct-GFP/RFP 表达质粒的 B 细胞也可用于标记肌动蛋白。
- 标记微管组织中心（MTOC）或中心体时，可使用以下抗体：抗 γ-微管蛋白抗体（1:500）、抗 Cep55 抗体（1:500）、抗 α-微管蛋白抗体（1:500）、抗 pericentrin 抗体（1:1000）。
- 用 PBS 将盖玻片洗涤三次。
- 将二抗或染料用 PBS 稀释（每张盖玻片使用 30 µL），室温孵育 1 小时。
注意：避免样品暴露于直射光下，以保持荧光信号的质量。 - 用 PBS 将盖玻片洗涤三次。
- 从盖玻片上移除 PBS 溶液。
- 在载玻片上滴加 4 µL 封片试剂。将盖玻片细胞面向下封于载玻片上，置于 37 °C 干燥 30 分钟，或室温过夜。
注意：建议使用“抗荧光淬灭”封片试剂（见材料表）。 - 使用共聚焦或落射荧光显微镜，配备 60x 或 100x 油镜采集荧光图像。每次成像时建议同时采集透射光或明场图像，以便于识别与微珠相互作用的 B 细胞。
注意：建议采集三维（3D）图像，通过 z 轴层扫覆盖整个细胞。推荐 z 轴步进为 0.5 µm，但具体参数取决于所用显微镜。
4. 图像分析
注意：以下算法以 ImageJ 软件为例进行描述，但也可使用功能相当的软件完成。此外，请注意，所有荧光强度测量均采用总荧光密度（ImageJ 中的 "RawIntDen"），因为该参数综合考虑了图像中每个像素的荧光总量，并计入了面积因素。
- 使用抗原包被微珠激活的B细胞中细胞器分布的分析
注意：为了量化细胞组分向免疫突触（IS）的极化程度，我们定义了一个任意值作为组分接近IS的衡量标准。该指数范围介于-1（反极化）和1（完全极化，物体位于微珠上）之间，如Reversat等先前所述。12.- 估算中心体和高尔基体的极性指数（图1B).
注意：该算法可用于局限于单一点位的细胞器。- 首先定义用于分析的微珠和细胞区域 圆形工具 选择以划定两者的边界，然后将其保存为感兴趣区域（ROI）。参见 图1, 图2, 图3，以及 图4.
- 确定细胞中心（CC）以及珠子中心（BC）通过运行 分析 | 测量 分别在细胞和微珠区域。从X和Y值获得的 结果 窗口确定中心坐标。
- 手动确定中心体或高尔基体的中心位置（细胞器) 使用 点工具 在 ImageJ 中进行选择并运行 分析 | 测量. 从X和Y值得到的 结果 窗口确定坐标。
- 然后，从CC向细胞器画一条角度线（a）以及 CC 至 BC（b) 使用角度工具选择并运行 分析 | 测量。该 角度 值在 结果 窗口显示角度（α）在两种载体之间（a 和 b).
- 使用以下公式计算极性指数：
- 估算溶酶体的极性指数（图1F).
注意：我们使用该算法来分析分布较为分散的细胞器（如溶酶体）的极性。- 定义需分析的珠子和细胞区域，使用 圆形工具 选择以划定两者的边界，并将其保存为感兴趣区域（ROI）。在确定微珠和细胞区域后，设置荧光通道并将图像投影为一个z轴层叠图像（z-stack）图像 | 图像序列 | Z轴投影［求和切片］），然后运行 分析 | 测量 并从结果窗口中提取质心（MC）坐标（MX 和 MY）。
- 应用之前提到的相同算法，只需将其中的 Organelle 替换为 MC。因此，该角度（α) 由 CC-MC 定义（a）和 CC-BC（b).
- 使用以下公式计算极性：
- 估算溶酶体向突触区域的募集图2B).
注意：该算法用于定量分析靠近免疫突触（IS）的细胞器。- 确定微珠和细胞区域后，计算CC与BC之间向量的角度，然后旋转图像以获得0°角。
- 设置荧光通道，并将图像投影为一个z轴层叠图像（图像 | 图像序列 | Z轴投影［最大强度投影］），消除细胞和微珠区域之外的所有荧光信号（运行 编辑 | 清除外部 在 ImageJ 中）。
- 使用 矩形工具 选择，在珠子旁边绘制一个矩形，并测量突触区域的荧光强度（SAF该矩形宽度为细胞宽度的四分之一。
- 选择整个图像并运行 分析 | 测量 以获得全细胞荧光（WCF).
- 使用以下公式计算邻近免疫突触（IS）的细胞器荧光百分比：
- 量化细胞组分向中心体的募集
注意：本算法改编自 Obino 等人。5用于量化细胞器在中心体区域的富集程度。简言之，我们将中心体区域定义为在荧光强度/半径曲线中，与中心体相关的细胞器荧光信号保持恒定或高于70%的范围。必须在静息状态下设定此参数，因为该半径在细胞激活后可能发生变化。- 在确定微珠和细胞区域后，利用以下方法定义中心体的定位 点工具 选择图3B).
- 首先，通过绘制一个围绕中心体、半径为 3 µm 的圆形区域，确定可定量分析的中心体周围最大范围。
- 使用 ImageJ 插件 径向分布轮廓，该方法通过测量同心圆内的荧光强度，并生成荧光强度/半径分布图。
- 确定荧光强度至少保持70%的最大半径。
- 使用以下公式计算荧光密度比：
= 
注意：荧光密度比表示细胞器在中心体处的浓度相对于其在整个细胞中分布的浓度。
- 估算中心体和高尔基体的极性指数（图1B).
- 在抗原包被的载玻片上激活的B细胞中细胞铺展及细胞器分布的分析
- 估算细胞器在免疫突触处的分布图4B).
注意：该算法可用于量化细胞器在免疫突触（IS）中心区域的XY分布及其浓度。我们定义了中心突触区域与总突触区域之间的荧光密度比值。所得数值可从负值到正值变化，分别指示细胞器的周边分布或中心聚集。- 确定细胞与盖玻片接触的切片层面。
注意：为了界定细胞边界，可以对质膜或在免疫突触周边富集的肌动蛋白进行标记。 - 将切片类型更改为8位，然后进行二值化（流程 | 二进制 | 生成二进制）并连接最近的外部点，过程 | 二值化 | 轮廓。界定细胞区域的边界（钙) 使用 多边形工具 筛选
注意：此步骤有助于增强细胞边界的对比度，便于识别。此外，此时可以应用 分析颗粒 ImageJ 的插件可自动测定 CA，但同一视野中的其他细胞可能会干扰结果。 - 取 钙 参数（高度和宽度）并划定一个中心圆形区域，该区域与边界的距离为高度和宽度值的四分之一，将此区域视为细胞中心区（CCA）。
- 使用以下公式计算免疫突触中心的荧光密度分布：
- 确定细胞与盖玻片接触的切片层面。
- 在Z平面上测量细胞器分布（图4C).
注意：该分析用于确定B细胞在抗原包被的盖玻片上活化后，细胞器荧光在Z平面的总体分布情况，显示每个Z层段的荧光百分比。- 为了量化Z方向上的荧光分布，首先确定细胞与抗原覆盖玻片接触处的免疫突触（IS）所在平面，然后确定对应于细胞上边界极限的平面。
- 在细胞中心画一条线。
- 在 Z 轴方向重新切片图像（图像 | 图像序列 | 重新切片），以获取XZ图像。
- 测量高度，并将XZ图像从底部（IS界面）到顶部（细胞上侧）沿高度方向等分为10个连续的矩形区域（Z分段），分别量化每个区域中的荧光信号。
- 将每个 Z 分数的荧光强度除以 10 个分数的总荧光强度之和进行归一化。
- 绘制细胞每个Z层面的荧光强度百分比。
- 估算细胞器在免疫突触处的分布图4B).
5. 从静息和活化B细胞中分离富含中心体的组分
注意：实验过程中所有溶液均需置于 4 °C 保存，以防止蛋白质降解。本方案改编自先前的研究17,18。
- 在 2 mL CLICK 培养基 + 2% 热灭活 FBS 中，以 1:1 的比例使用抗原包被的磁珠激活 2 × 107 个 B 细胞。未激活的 B 细胞视为静息态 B 细胞。
- 加入细胞松弛素 D（2 µM）和诺考达唑（0.2 µM），在 37 °C 下孵育 1 小时。
注意：这些药物分别通过解聚肌动蛋白细胞骨架和微管，温和地使中心体与细胞核分离，以避免核污染。 - 每份样品先用 5 mL 冷的 1× TBS（50 mM Tris-HCl，pH 7.6，150 mM NaCl）洗涤，再用含 8% 蔗糖的 1 mL 0.1× TBS 洗涤。
- 用 150 µL 中心体裂解缓冲液（1 mM HEPES，pH 7.2，0.5% NP-40，0.5 mM MgCl2，0.1% 巯基乙醇，1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）或蛋白酶抑制剂混合物）重悬细胞，并反复吹打直至黏度降低，表明细胞已裂解。将样品转移至 1.5 mL 离心管中。
- 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟，以分离细胞器与细胞核。
- 小心收集上清液，并将其加至含有 300 µL 梯度缓冲液（GB）（10 mM PIPES，pH 7.2，0.1% Triton X-100，0.1% 巯基乙醇）并添加 60% 蔗糖的 1.5 mL 离心管中。
- 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 30 分钟，使中心体富集于 60% 蔗糖组分中。
- 同时，在 2 mL 超速离心管中制备不连续梯度：依次叠加 450 µL GB + 70% 蔗糖、270 µL GB + 50% 蔗糖和 270 µL GB + 40% 蔗糖。
- 第一次离心后（中心体富集组分），弃去上层较轻部分，保留至界面处，涡旋混匀管中剩余样品。然后将富集的中心体样品小心叠加至预先制备的不连续梯度上层。
注意：操作时需避免破坏梯度，所有移液步骤均应谨慎进行。 - 在 4 °C 下以 40,000 × g 离心 1 小时，设置最低加速度且关闭离心机制动，以避免破坏梯度。
- 从顶部开始，分别收集 12 个 100 µL 的组分至不同的离心管中。
- 使用 γ-微管蛋白作为中心体标志物，通过免疫印迹鉴定富含中心体的组分。
注意：我们通常在第 6 至第 8 组分中发现富含中心体的提取物。
结果
本文介绍了如何利用固定在微珠或盖玻片上的抗原激活B细胞，以诱导免疫突触（IS）的形成。我们提供了通过免疫荧光识别和定量不同细胞器极性的方法信息，并介绍了如何采用生物化学方法，对在中心体（极化至免疫突触）定位发生动态变化的蛋白质进行表征。
通过免疫荧光成像观察B细胞，可追踪中心体、高尔基体和溶酶体等细胞器在B细胞活化后向免疫突触（IS）募集的动态过程。通过该方法可获得定量参数，用于测量这些细胞器向IS极化的程度，并可在不同条件下进行比较。如图1A所示，B细胞活化后，中心体和高尔基体会被募集至IS。而在仅使用BCR配体刺激的B细胞中未观察到此类募集现象，表明BCR的结合是驱动中心体和高尔基体向IS移动所必需的（图1A）。为了获得用于衡量各细胞器接近IS程度的极性指数，我们考虑了三个参数：细胞器与细胞中心之间的距离、微珠中心与细胞中心之间的距离，以及这两个向量之间的夹角（图1B）。该指数范围为-1（反极化）至1（完全极化，即细胞器位于微珠上）。图1C和1D展示了各细胞器极性指数随活化时间变化的曲线图。与免疫荧光染色结果一致，随着活化时间的延长，中心体和高尔基体的极性指数均呈现更正值，反映出它们逐步向IS募集的过程。该算法适用于局限于单一位置的细胞器。
此外，我们通过应用之前提到的相同算法，但将点坐标替换为溶酶体的质量中心坐标（图1F），对呈弥散分布的细胞器（如溶酶体（图1E））的极化程度进行了量化。可以观察到，溶酶体群的极性指数在细胞活化后呈现更高的正值，表明在B细胞活化过程中，溶酶体向免疫突触方向发生动员（图1G）。
我们还定义了两种算法，用于确定与突触界面（微珠）接触的细胞器，以及位于突触附近但不一定发生接触的细胞器数量。如图2所示，我们通过将微珠区域内的LAMP-1信号除以细胞和微珠的总荧光强度，来量化与突触界面接触的溶酶体（图2A）（图2B）。需要注意的是，微珠区域的直径会影响所获得百分比数值的范围。例如，在展示的定量结果中（图2B），我们绘制了一个直径为3 µm的圆形区域以测量微珠处的荧光强度，考虑到微珠本身的尺寸（3 µm），这是一个较为严格的参数。使用该参数时，结果表明，在B细胞活化过程中，溶酶体会逐步募集至突触界面，最终达到其总质量的10–15%（图2C）。另一种分析方法是量化溶酶体向突触区域的聚集情况。图2D显示，溶酶体在免疫突触（IS）处逐步累积，最多可达其总量的25%。总体而言，通过上述两种分析方法，可以评估细胞器在免疫突触处的极化与锚定情况。
在B细胞活化过程中，已记录到中心体相关蛋白池的变化5例如，其中一种在B细胞活化期间改变其中心体结合状态的蛋白质是肌动蛋白。在此情况下，该区域内的肌动蛋白减少，使得中心体得以与细胞核分离，从而促进其中心体向免疫突触（IS）极化。5. 本文展示了中心体处肌动蛋白的定量分析，以及B细胞活化后肌动蛋白如何被耗竭（图3）。为了确定用于量化相关肌动蛋白的中心体区域，我们测量了围绕中心体的同心圆内该标记物的荧光强度。半径的界定依据是标记物荧光强度至少保持70%的位置（图3B). 利用该方法可以量化B细胞激活后中心体处肌动蛋白密度的降低，如图所示 图3C.
为了更清晰地观察细胞器在免疫突触（IS）界面的分布情况，我们在抗原包被的盖玻片上激活B细胞，并对肌动蛋白、高尔基体和内质网进行标记（图4A）。可通过将突触区域划分为中央区和外周区来分析细胞器在IS处的分布，划分标准如图4B所示。该划分依据此前的研究结果，即B细胞受体（BCR）聚集于这一中央区域，该区域极可能对应于中央超分子活化复合体（cSMAC）10,19。图4A显示，在被招募至IS的细胞器中，高尔基体与内质网呈现出相反的分布模式。事实上，它们的分布指数与其在图4C中所示的免疫荧光染色结果相关联。高尔基体呈正值，表明其主要集中于IS的中央区域；而内质网呈负值，表明其主要定位于IS的外周区域。此外，还可利用先前确定的突触区域数值，测量B细胞活化过程中的铺展面积，如图4D和图4E所示。这些结果表明，B细胞活化后铺展面积增加，与此前报道一致10,20。
与微珠实验类似，我们可以通过获取抗原包被盖玻片上活化的B细胞的XZ图像，并测量细胞器荧光在Z轴方向上的分布，来确定细胞器向免疫突触的分布情况（图4F）。如图4F中XZ平面所示，测量了Z平面上肌动蛋白的荧光强度，可见肌动蛋白在突触界面处逐渐富集（第1和第2区段）（图4G）。
除了B细胞成像分析外，我们还进行了富含中心体组分的分离，以定量分析与中心体相关联的蛋白质（图5A）。该方法可为B细胞免疫突触形成的研究所提供补充，因为中心体可极化至突触膜，并已被证明可协调参与抗原提取和呈递的溶酶体运输21。此前该方法需使用大量细胞（1 × 109 个细胞）17,18，但我们已建立了一种简化版本，所需细胞量更少，且可使用较小体积的超速离心管（2–3 mL）进行操作。如图5B所示，我们通过免疫印迹分析了不同的细胞组分，并通过γ-微管蛋白染色确定了富含中心体的组分。在此，我们展示了在中心体上积累发生变化的蛋白质示例，如肌动蛋白（Actin）和Arp2，这些现象此前已有报道5。
图1： 细胞器向免疫突触（IS）的极化。（A）IIA1.6 B细胞在与BCR配体阳性（0、30、60和120分钟）或BCR配体阴性珠粒（120分钟）共孵育后，高尔基体（Rab6a）和微管（α-tubulin）的免疫荧光染色。箭头指示中心体。BF = 明场。比例尺 = 3 µm。（B）计算细胞器（中心体或高尔基体）向免疫突触（IS）极化指数的示意图。a = 细胞中心（CC）到细胞器的距离；b = 细胞中心（CC）到珠粒中心（BC）的距离。（C、D）代表性散点图显示不同激活时间点的细胞器极化指数。每个点代表一个细胞。（E）B细胞在与BCR配体阳性（0、30、60和120分钟）或BCR配体阴性珠粒（120分钟）共孵育后，溶酶体（Lamp1）的免疫荧光染色。BF = 明场。比例尺 = 3 µm。（F）计算溶酶体极化指数的示意图。a = 细胞中心（CC）到质量中心（MC）的距离；b = 细胞中心（CC）到珠粒中心（BC）的距离。（G）代表性散点图显示不同激活时间点的溶酶体极化指数。每个点代表一个细胞。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）并进行Sidak多重比较检验。图中显示均值及标准误（SEM）。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2： 溶酶体在免疫突触（IS）处的聚集。（A）B细胞在有BCR配体（0、30、60和120分钟）或BCR配体包被的微珠（120分钟）存在下孵育后，溶酶体（Lamp1）的免疫荧光染色。BF = 明场。比例尺 = 3 µm。（B）示意图，展示如何计算溶酶体等细胞器在微珠及突触区域的聚集程度。图中显示了整个细胞的荧光（WCF）、微珠荧光（BF）以及突触区域荧光（SAF）。（C、D）溶酶体在微珠及突触区域聚集的代表性柱状图。N = 1。20 > 细胞。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）结合Sidak多重比较检验进行统计分析。数据以均值±标准误（SEM）表示。请点击此处查看该图的放大版本。
图3： B细胞免疫突触形成过程中中心体肌动蛋白的定量分析。 （A）B细胞与BCR配体阳性（0 和 60 分钟）或BCR配体阴性微珠（0 和 60 分钟）共孵育后，肌动蛋白（Phalloidin）和微管（α-Tubulin）的免疫荧光染色。箭头指示中心体位置。比例尺 = 3 µm。（B）用于计算中心体相关组分募集或减少程度的示意图。中心体区域通过半径（X µm）计算，该半径需保持至少70%的最大荧光强度。（C）代表性散点图显示在激活（BCR-ligand+）和非激活（BCR-ligand-）条件下中心体处的肌动蛋白水平。N = 1。15 > 细胞。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）结合Sidak多重比较检验。数据以均值±标准误表示。请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 细胞组分在突触界面的分布。 （A）肌动蛋白（Phalloidin）、内质网（Sec61a）和高尔基体（转染表达KDELR-DN-GFP，即KDEL受体的显性负性突变体，可定位于高尔基体）的免疫荧光染色。将B细胞接种于包被BCR配体+的盖玻片上，孵育60分钟。BF = 明场。比例尺 = 5 µm。（B）示意图，展示如何测定细胞的铺展面积以及细胞器在免疫突触（IS）中心的募集情况。图中CA表示由皮层肌动蛋白界定的细胞区域，CCA表示中心细胞区域。（C）高尔基体和内质网在IS处的分布，以柱状图表示，其中数值>0表示在IS中心富集，< 0表示呈周边分布。N = 1，超过20个>细胞。显示均值及标准误（SEM）。（D）B细胞在抗原包被的盖玻片上不同时间点（0、30和60分钟）激活后的代表性图像，标记肌动蛋白（Phalloidin），显示XZ和XY平面。（E）图示B细胞在E中的铺展面积。（F）示意图，展示如何确定目标信号在Z轴方向的分布以及各Z分数段的作图方式。矩形表示IS界面。（G）肌动蛋白在Z轴方向的分布，以荧光信号百分比相对于各Z分数段的折线图表示。矩形代表IS界面。N = 1，超过25个>细胞。显示均值及标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。
图5： B细胞中富集的中心体组分。 （A）通过蔗糖梯度超速离心法获得中心体富集组分的工作流程。（B）静息态与激活态B细胞（激活60分钟）所得各组分的免疫印迹结果。中心体富集组分通过γ-微管蛋白标记进行鉴定，位于虚线框内（第6至第8组分）。在激活与静息条件下，中心体相关蛋白（肌动蛋白和Arp2）均出现在中心体富集组分中。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
我们描述了一种全面的方法，用于研究B淋巴细胞如何重组其细胞内结构以促进免疫突触（IS）的形成。该研究包括利用成像技术定量分析B细胞活化过程中细胞器（如中心体、高尔基体和溶酶体）的细胞内分布及其向免疫突触极化的情况。此外，我们还介绍了一种生物化学方法，用于研究B细胞活化后中心体组成的变化。
为了促进B细胞中免疫突触（IS）的形成，我们采用固定化抗原（抗原包被的微珠）而非可溶性免疫复合物，因为前者能够诱导形成明确的接触位点，便于研究细胞骨架的重排和细胞器的极化。在对B细胞活化进行成像时，一个关键环节是样品的制备。理想情况下，所有图像采集应获得1:1的细胞与微珠比例，以便量化细胞器向单一抗原接触位点的极化情况。然而，在某些情况下，B细胞可能捕获两个或更多微珠，从而难以确定唯一的抗原接触位点。为避免微珠聚集，在将抗原偶联的微珠加入细胞前，必须充分涡旋混匀。此外，在免疫荧光实验中，我们建议排除捕获多个微珠的细胞，以防止图像分析过程中出现误判。样品制备中的另一个关键步骤是固定与通透条件的选择。例如，我们推荐使用甲醇固定以优化微管染色效果，而使用4%多聚甲醛（PFA）固定则适用于鬼笔环肽（phalloidin）染色。当需要同时标记肌动蛋白细胞骨架和微管时，一种替代方案是通过转染表达LifeAct-GFP/RFP质粒来标记肌动蛋白，同时结合微管染色。用于量化中心体及其他细胞内细胞器极化的图像采集，可使用落射荧光显微镜完成。然而，若需在不同z平面进行精确量化（例如在细胞铺展实验中），则必须使用共聚焦显微镜。
在此所述的中心体分离方案中，一个关键步骤是获取适量的样本，以便通过免疫印迹法对蛋白质进行定量。鉴于B细胞具有较大的细胞核，其细胞质体积不足细胞总体积的30% 体积，获得较高产量的胞质蛋白可能具有挑战性。因此，我们建议使用约 20 x 106 每个激活时间点的B细胞用于中心体分离。
这些方法的一个重要局限性在于，使用抗原偶联微珠进行激活无法完全模拟体内环境中表面锚定抗原向B细胞呈递时的复杂性。可通过在培养体系或微珠中添加其他共刺激因子（如细胞因子和细胞外基质组分）来弥补这一局限。然而，在这些情况下必须使用适当的对照，以正确解读实验结果。
本文所展示方法的重要性在于采用了一种整合性方法来研究B细胞免疫突触：（1）细胞器的极化及其分布，以及（2）中心体处蛋白质组成的改变。由于进行具有统计学意义的分析需要大量细胞，且该过程会产生海量数据，本文介绍的多种定量分析算法有助于细胞成像数据的分析。此外，用于分析细胞极化的算法可通过ImageJ中的宏（MACROS）函数轻松实现自动化，这一工具可有效减少重复性操作，节省时间。
这些实验步骤可推广至其他能够建立极化表型以实现特定细胞功能的细胞类型。此外，这些方案还可通过引入其他检测方法进行优化，例如检测中心体富集组分中相关蛋白（如激酶或蛋白酶）的活性。总体而言，这些研究可为调控细胞极性建立的细胞信号转导和分子通路提供机制层面的深入见解。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
M.-I.Y. 获得智利国家科学与技术研究委员会（FONDECYT）第1180900号研究基金资助。J.I.、D.F. 和 J.L. 获得智利国家科学与技术委员会研究生奖学金资助。我们感谢智利天主教大学的 David Osorio 提供视频录制与编辑工作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| IIA1.6（A20 变体）小鼠 B 淋巴瘤细胞 | ATCC | TIB-208 | 来源于 Balb/c 小鼠的 B 细胞淋巴瘤，其表面表达含 IgG 的 BCR，但不表达 FcγIIR |
| 100% 甲醇 | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 直径 10 mm、厚度为 1 号圆形盖玻片 | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-巯基乙醇 | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 荧光标记驴抗兔 IgG | LifeTech | A21206 | 推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化 |
| Alexa Fluor 546 标记的山羊抗兔 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化 |
| Alexa Fluor 647 标记的鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化 |
| Amaxa 核转染试剂盒 V | Lonza | VCA-1003 | 按照制造商说明将转染试剂与 DNA 混合 |
| Amaxa Nucleofector 2b 型仪器 | Lonza | AAB-1001 | 使用程序 L-013 |
| 氨基磁珠（Amino-Dynabeads） | ThermoFisher | 14307D | |
| 抗中心粒周围蛋白抗体（Anti-pericentrin） | Abcam | ab4448 | 推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化 |
| 抗 rab6 抗体 | Abcam | ab95954 | 推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化 |
| 抗 sec61 抗体 | Abcam | ab15575 | 推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| T25 培养瓶 | BD | 353014 | |
| Fiji 软件 | Fiji col. | ||
| Fluoromount G 封片剂 | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| 谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 戊二醛 | Sigma | G7651 | |
| 甘氨酸 | Winkler | BM-0820 | |
| 山羊抗小鼠 IgG 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 阳性配体 |
| 山羊抗小鼠 IgM 抗体 | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 阴性配体 |
| HyClone 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | 在 56 oC 下灭活 30 分钟 |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS 显微镜 | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E 正置荧光显微镜 | Nikon | ||
| Parafilm 封口膜 | M | P1150-2 | |
| 多聚甲醛 | Merck | 30525-89-4 | 在生物安全柜中用 PBS 稀释至 4%，现配现用 |
| 青霉素-链霉素溶液 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 液体 |
| Polybead 氨基微球，直径 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P8920 | 用无菌水稀释 |
| 兔抗 α-微管蛋白抗体 | Abcam | ab6160 | 推荐稀释比例为 1:1000，但应进行优化 |
| 兔抗小鼠 lamp1 抗体 | Cell signaling | 3243 | 推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化 |
| 兔抗 cep55 抗体 | Abcam | ab170414 | 推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化 |
| 兔抗 γ-微管蛋白抗体 | Abcam | ab16504 | 用于 Western Blot 时稀释比例为 1:1000 |
| RPMI-1640 培养基 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| 皂苷 | Merck | 558255 | |
| 丙酮酸钠 | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| 蔗糖 | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| 50 ml 离心管 | Corning | 353043 |
参考文献
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
重印与许可
标签
