方法文章

研究免疫突触形成过程中B细胞中的细胞动力学

8.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59621

⸱

2019年6月1日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Immune Cell Biology, Department of Cellular and Molecular Biology, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Faculty of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Centro de Investigaciones en Biología Celular y Biomedicina, Facultad de Ciencia, Universidad San Sebastián

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了在IS形成过程中描述B淋巴细胞细胞极化事件的两种方法。第一,涉及细胞器招募的定量和突触膜的细胞骨架重组。第二种是生化方法,用于描述中心体组成的变化,这种物质对免疫突触发生极化。

摘要

B细胞受体(BCR)对表面束缚抗原的识别触发免疫突触(IS)的形成,其中信号和抗原吸收均得到协调。IS 的形成涉及动态行为因重塑,并伴有偏振招募到中源体和相关细胞内细胞器(如溶酶体和Golgi设备)的突触膜。作用素重塑的初始阶段允许B细胞增加其细胞表面,并最大化在突触中收集的抗原-BCR复合物的数量。在某些情况下,当B细胞识别与刚性表面相关的抗原时,这个过程与地合体体招募和分泌相结合,从而促进抗原提取。被利用的抗原被内化成专门的内乳糖体隔间,用于加工成肽,这些肽被加载到主要组织相容性复合物II(MHC-II)分子上,以便进一步呈现给T帮助细胞。因此,研究与IS的形成相关的细胞器动力学对于理解B细胞是如何被激活的关键。在本文中,我们将讨论成像和用于研究细胞内细胞器定位和细胞骨架重组的变化的成像和生化技术,这些变化与B细胞中IS的形成有关。

引言

B淋巴细胞是适应性免疫系统的重要组成部分,负责产生针对不同威胁和入侵病原体的抗体。抗体的产生效率取决于B细胞在可溶性或表面束缚形式1、2中获取、处理和呈现抗原的能力。BCR对附着细胞表面的抗原的识别,导致形成称为IS3,4的紧密细胞间接触。在此动态平台中,均发生依赖 BCR 的下游信令和抗原内化到内生体隔间中。被吸收的抗原被处理并组装到MHC-II分子上,然后呈现给T淋巴细胞。生产性B-T相互作用,称为B-T细胞合作,允许B淋巴细胞接收适当的信号,促进其分化为产生抗体的血浆细胞或记忆细胞8。

B细胞的抗原提取有两种机制。第一种依赖于来自溶酶体的蛋白酶的分泌,这些蛋白酶在突触裂5、6处进行招募和融合。第二,取决于Myosin IIA介导的拉力,触发含有的抗原的内化到克拉辛涂层坑7的抗原的阴道。抗原提取模式依赖于发现抗原的膜的物理特性。然而,在这两种情况下,B细胞经历两个主要的重塑事件:行为细胞骨架重组和细胞器的极化到IS。Actin 细胞骨架重塑涉及初始扩散阶段,其中突触膜上的活性因子相关突起增加与抗原接触的表面。随后是收缩阶段,其中BCR与抗原结合集中在IS的中心,由分子马达和反应因子细胞骨架重塑8,9,10的协同作用, 11.细胞器的极化也依赖于细胞骨架的重塑.例如,通过相关行为因的局部去聚合,中心体与原子核脱钩,从而允许将这种细胞器重新定位到IS5,12。在B细胞中,将中心体重新定位到一个细胞杆(IS)将溶酶体招募到突触膜中,分泌后可促进表面束状抗原6的提取和/或处理。在IS招募的裂氧体富含MHC-II,这有利于在内皮腔中形成肽-MHC-II复合物,提交给T细胞13。此外,也观察到Golgi仪器被密切招募到IS14,这表明从分泌途径的Golgi衍生的囊泡可以参与抗原提取和/或处理。

总之,在突触形成期间,细胞内细胞器和细胞骨架在B细胞中重新排列是允许其进一步激活所需的高效抗原采集和处理的关键步骤。在这项工作中,我们介绍了如何在B细胞中执行成像和生化分析的详细方案,以研究与IS形成相关的细胞内重塑。这些技术包括:(i) 用抗原涂层珠和抗原涂层盖玻片激活的B细胞的免疫荧光和图像分析,允许对动员到IS和(ii)的细胞内成分进行可视化和定量。)通过在蔗糖梯度上超离心分离B细胞中中中质体富集的成分,从而能够识别与中质体相关的蛋白质,从而可能参与调节细胞极性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注:使用 IIA1.6 B 单元执行以下步骤。

1. 用抗原涂层珠子活化B细胞

  1. 抗原涂层珠子的制备
    1. 要激活B细胞,请使用NH2-珠共价涂覆抗原(Ag涂层珠),这些抗原使用50μL(±20 x 106珠)的3μm NH 2-珠子,具有激活(BCR-配体+)或非激活(BCR-ligand-)抗原。
    2. 对于 IIA1.6 B 细胞,使用抗 IgG-F(ab')2片段作为 BCR-配体+ 和抗 IgM-F(ab')2或牛血清白蛋白 (BSA) 作为 BCR-配体-要激活原B细胞或IgM+ B细胞系,请使用抗IgM-F(ab')2作为BCR配体+和BSA作为BCR配体-。
      注:为了避免配体与Fc受体结合,请使用F(ab')或F(ab')2抗体片段,而不是全长抗体。
    3. 要继续制备Ag涂层珠子,将珠子放入低蛋白结合微离心管中,以在样品操作过程中最大限度地恢复珠子。加入1mL的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS),以16,000 x g洗涤珠子和离心机5分钟。
    4. 用500μL 8%谷醛重新悬浮珠子,以激活NH2组,并在室温(RT)下旋转4小时。
      注意:谷醛库存溶液只能用于化学烟气罩。按照材料安全数据表 (MSDS) 上的说明进行操作。
    5. 在 16,000 x g下离心珠 5 分钟,去除谷醛,用 1 mL 的 1x PBS 再清洗三次。
      注意:谷醛溶液应作为危险化学品废物丢弃。
    6. 在 1x PBS 的 100 μL 中重新悬浮激活的磁珠。样品可分为两个低蛋白结合微离心管:BCR-配体50μL*,BCR-配体-50μL。
    7. 为了制备抗原溶液,请使用两个2 mL低蛋白结合微离心管,在150μL的PBS中含有100μg/mL抗原溶液:一个管与BCR-配体®,其他带BCR-配体-管。
    8. 将50μL的活性珠溶液加入含有150μL抗原溶液的每个管中,涡旋,在4°C下旋转过夜。
    9. 加入500 μL的10mg/mL BSA,以阻止珠子上剩余的活性NH2组,并在4°C下旋转1小时。
    10. 在 16,000 x g下在 4°C 下将珠子离心 5 分钟,然后去除上清液。用冷 1x PBS 再清洗珠子三次。
    11. 在 70 μL 的 1x PBS 中重新悬浮激活的磁珠。
    12. 要确定 Ag 涂层珠子的最终浓度,请稀释 PBS (1:200) 中的少量珠子,并使用流量计计数。然后在4°C储存,直到使用。
      注:涂布珠子的储存时间不应超过1个月。
  2. 聚L-莱辛盖玻片的制备
    1. 在用Ag涂层珠子进行B细胞活化测定之前,准备多-L-莱辛涂层盖玻片(PLL-盖玻片)。使用含有 40 mL 0.01% 的 PLL 溶液的 50 mL 管,并将 12 mm 直径盖玻片浸入溶液中。在 RT 下旋转一夜。
    2. 用 1x PBS 清洗盖玻片,然后放在覆盖石蜡膜的 24 孔板盖上晾干。继续激活 B 细胞。
  3. B 细胞激活
    1. 要用珠子启动 B 细胞活化,首先将 IIA1.6 B 细胞系稀释至 1.5 x 106细胞/mL,在 CLICK 培养基中(RPMI-1640 辅以 2 mM L-阿兰宁-L-谷氨酰胺 = 55 μM β-二聚苯并乙醇 = 1 mM 丙酮 = 100 U/mL 青霉素 = 100 μg/mL链霉素) = 5% 热灭活胎儿牛血清 [FBS]。
    2. 将 100 μL(150,000 个细胞)的 IIA1.6 B 细胞与 Ag 涂层珠子在 0.6 mL 管中以 1:1 的比例结合。使用涡旋和种子轻轻混合到 PLL 盖玻片上。在细胞培养箱(37°C / 5% CO2) 中孵育不同时间点。典型的激活时间点是 0、30、60 和 120 分钟。对于时间 0,将 PLL 盖片放入 24 孔板盖的冰上。加入细胞-Ag涂层珠混合物,在冰上孵育5分钟。
      注:重要的是通过涡旋混合,而不是上下移液,因为这可以减少样品中的珠子数量,因为它们积聚在移液器的塑料尖端。使用涂有 BCR 配体的珠子作为每次测定的负对照。我们建议首先激活最长的孵育时间,然后激活以下时间点。计算样本的激活间隔,以便它们同时准备好固定。
    3. 在每个盖玻片中加入100 μL的冷1xPBS,以阻止激活并继续免疫荧光方案。请参阅协议第 3 节。

2. 抗原涂层盖玻片上的B细胞活化

  1. 制备抗原涂层盖玻片
    1. 在激活前,制备抗原溶液(含有10μg/mL BCR-配体+和0.5μg/mL大鼠抗小鼠CD45R/B220的1xPBS)。
      注:请考虑在测定前一天准备盖玻片。B220改善B细胞附着力,但是,BCR-Ligand®足以产生扩散反应。
    2. 将 12 mm 盖玻片放在覆盖石蜡薄膜的 24 孔板盖上,在每个盖玻片上加入 40 μL 的抗原溶液,并在 4°C 下孵育过夜。密封板,避免抗原溶液蒸发。
    3. 用 1x PBS 和空气干燥清洗盖玻片。
  2. B 细胞激活
    1. 要开始激活,请在 CLICK 培养基 + 5% FBS 中稀释 IIA1.6 B 细胞至 1.5 x 106细胞/mL。
    2. 将100μL细胞添加到抗原涂层盖玻片(Ag-盖玻片)上,并在37°C / 5% CO2的细胞培养箱中激活不同时间点。典型的激活时间点是 0、30 和 60 分钟。
      注: 如同第 1 节一样,我们建议从最长的激活时间点开始,以便同时修复所有示例。
    3. 对于时间 0,将包含 Ag 盖玻片的 24 孔板盖放在冰上并添加细胞。在冰上孵育5分钟。
    4. 小心地吸出每个 Ag 型盖玻片上的介质,然后加入 100 μL 的冷 1x PBS 以停止激活。继续使用免疫荧光方案。见第3节。

3. 免疫荧光

注:为避免IIA 1.6 B细胞的BCR对二级抗体产生交叉反应,请勿使用小鼠衍生的初级抗体。

  1. 拆下 1x PBS 并继续固定每个盖玻片。
    注:要决定使用哪种固定介质,请检查抗体/染料数据表。例如,对于使用甲醛 (PFA) 固定介质的 phalloidin 标记,对于通过围心素进行中生菌标记使用甲醇固定。
    1. 加入50 μL的1xPBS,辅以4%PFA,并在RT孵育10分钟。
      注意:甲醛是有毒的。在使用这种化学品之前,请阅读 MSDS。PFA 解决方案应仅在戴手套和安全眼镜的化学烟罩下制造。PFA 溶液应作为危险化学品废物丢弃。
    2. 或者,加入50μL的冷甲醇,孵育20分钟。
  2. 用 1x PBS 洗涤三次。
    注:此时,盖玻片可在 4°C 下存储,在 1x PBS 中最多存储三天。
  3. 取出 1x PBS,并在每个盖玻片上加入 50 μL 的阻塞缓冲液(2% BSA = 1x PBS 中的 0.3M 甘氨酸)。在 RT 孵育 10 分钟。
  4. 轻轻吸气,加入50μL的渗透缓冲液(PB)(0.2%BSA = 0.05%皂苷在1xPBS中)。在 RT 孵育 20 分钟。
  5. 在 PB 中制备抗体或染料(每个盖玻片使用 30 μL),并在 RT 孵育 1 小时或在 4°C 下孵育 1 小时或过夜。有关详细信息,请参阅材料表。
    1. 要标记微管组织中心 (MTOC) 或心源体使用以下抗体:抗 α-图布林 (1:500)、抗 Cep55 (1:500)、抗 β-图布林 (1:500)、抗围念素 (1:1000)。
      注:对于中质体标记B细胞,可以使用中辛-GFP表达质粒转染。
    2. 对于 Golgi 仪器进行标记,请使用防拉布6a (1:500)。
      注:也可以使用其他抗体或染料。
    3. 要标记地索体,请使用防兰普1 (1:200)。
      注:抗H2-DM和抗MHC-II也可用于标记抗原处理隔间15、16。
    4. 对于标记内质视网膜,请使用抗Sec61a (1:500)。
    5. 对于行为素细胞骨架,请考虑以下事项:聚合化行为素可以通过Phalloidin结合到荧光染料中可视化。
      注:用LifeAct-GFP/RFP表达质粒转染的B细胞也可以用来标记行为蛋白。
  6. 用 PBS 清洗盖玻片三次。
  7. 稀释PBS中的二级抗体或染料(每个盖玻片使用30μL),并在RT孵育1小时。
    注:避免将样品暴露在直射光下,以保持荧光信号的质量。
  8. 用 PBS 清洗盖玻片三次。
  9. 从盖玻片中取出 PBS 解决方案。
  10. 将4μL的安装试剂添加到显微镜幻灯片中。将盖玻片安装到滑轨上,使单元侧朝下。让滑轨在 37°C 或 RT 过夜时干燥 30 分钟。
    注:考虑使用"防褪色"安装试剂(参见材料表)。
  11. 在共聚焦或荧光显微镜上获取荧光图像,具有 60 倍或 100 倍油浸光物。对于每次采集,考虑透射的光或亮场,以轻松识别与珠子相互作用的B细胞。
    注:拍摄三维 (3D) 图像,使用 z 堆栈覆盖整个单元格。我们建议采用 0.5 μm 厚的堆栈,但这取决于显微镜。

4. 图像分析

注: ImageJ 软件描述了以下算法。但是,这可以使用等效软件执行。此外,考虑在所有荧光强度测量中,我们使用集成荧光密度(ImageJ 中的"RawIntDen"),因为此参数会考虑图像每个像素中的荧光总量,并考虑区域。

  1. 用Ag涂层珠激活的B细胞中细胞器分布分析
    注: 为了量化单元组件与 IS 的极化,我们将任意值定义为接近 IS 的度量值。该指数范围介于 -1(反极化)和 1(完全极化,珠子上的物体)之间,如 Reversat 等人之前提出的。12.
    1. 估计中心体和高尔基仪器的极性指数(图1B)。
      注:此算法可用于仅限于一点的细胞器。
      1. 首先定义要分析的珠子和像元区域,使用圆工具选择来分隔两者的边界,然后将它们另存为感兴趣区域 (ROI)。参见图1、图2、图3和图4。
      2. 通过运行分析|分别测量细胞和珠子区域。从"结果"窗口获取的X 和 Y 值确定中心坐标。
      3. 使用 ImageJ 中的点工具选择手动确定中枢或 Golgi 仪器 (Ogelle) 的中心,并运行分析|测量。从"结果"窗口获取的X 和 Y 值确定坐标。
      4. 然后,使用角度工具选择绘制从 CC 到细胞 (a) 和 CC 到 BC (b) 的角度,然后运行分析 |测量。结果窗口中的角度值显示两个矢量 (a和b) 之间的角度 (*)。
      5. 使用以下公式计算极性指数:
        figure-protocol-1
    2. 估计裂索体极性指数 (图1F)。
      注:我们使用此算法分析显示更分散分布(如流解体)的细胞器的极性。
      1. 定义要分析的珠子和像元区域,使用圆工具选择来分隔两者的边界,并将其保存为 ROI。一旦珠子和细胞区域被震慑,设置荧光通道,并将图像投影到一个z堆栈(图片 |堆栈 |Z 项目 [总切片]),然后运行分析 |从结果窗口测量和提取质量中心 (MC) 坐标 (MX 和 MY)。
      2. 在更改 MC 的"细胞"之前应用相同的算法。因此, 角度 (*) 由 CC-MC (a) 和 CC-BC (b) 定义
      3. 使用以下公式计算极性:
        figure-protocol-2
    3. 估计突触区域的溶酶体招募(图2B)。
      注:此算法用于量化与 IS 相邻的细胞器。
      1. 确定珠子和像元区域后,确定 CC 和 BC 之间的矢量角度,然后旋转图像以达到 0° 角度。
      2. 设置荧光通道,并将图像投影到一个 z 堆栈中(图像 |堆栈 |Z-Project [Sum 切片]),消除所有落在细胞和珠子区域之外的荧光(运行编辑 = 在 ImageJ 中清除外部)。
      3. 使用矩形工具选择,在珠子旁边绘制一个矩形,并测量突触区域荧光 (SAF )。此矩形是单元格宽度的四分之一。
      4. 选择整个图像并运行分析 |测量获得整个细胞荧光 (WCF).
      5. 使用以下公式计算与 IS 相邻的细胞器荧光百分比:
        figure-protocol-3
    4. 量化细胞组件的招募到中心体。
      注:该算法改编自Obino等人5,用于量化中位体区细胞器的富集性。简单地说,我们将中心体区域视为在荧光/半径图中中与中心体相关的细胞荧光保持不变或高于 70% 的域。在静止条件下设置此参数至关重要,因为激活时此半径可能会更改。
      1. 确定珠和像元区域后,使用点工具选择定义中心体的定位(图3B)。
      2. 首先,通过在中心体周围绘制一个 3 μm 半径的圆,确定可以量化的中位体周围的最大区域。
      3. 使用 ImageJ 插件径向轮廓,它测量同心圆中的荧光并显示荧光/半径图。
      4. 确定至少保持 70% 荧光强度的最大半径。
      5. 使用以下公式计算荧光密度比:
        figure-protocol-4=figure-protocol-5
        注:荧光密度比表示中心体细胞器的浓度与整个细胞中的分布相比。
  2. Ag-coverslips上激活的B细胞细胞的细胞分布和分布分析
    1. 估计IS的细胞器分布(图4B)。
      注:此算法允许定量细胞器的XY分布及其在IS中心的浓度。我们定义中心和总突触区域之间的荧光密度比率。获得的值可能从负值到正值不等,分别表示细胞器的外围分布或中心分布。
      1. 确定单元格与盖接触的切片。
        注:要划定细胞边界,可以标记在IS外围富集的血浆膜或活性素。
      2. 将切片类型更改为 8 位,然后进行二元化 (进程 |二进制 |使二进制)并连接最近的外部点 进程 |二进制 |大纲。使用多边形工具选择分隔像元区域 (CA) 的边界.
        注: 此步骤可用于增加单元格边界的对比度,并使其更易于识别。此外,此时可以应用 ImageJ 的分析粒子插件来自动确定 CA。但是,同一字段中的其他单元格可能会干扰结果。
      3. 以CA参数(高度和宽度)和分隔与边界分隔四分之一的高度和宽度值的中心圆角区域,将此区域视为像元中心区域 (CCA)。
      4. 使用以下公式计算 IS 中心荧光密度分布:
        figure-protocol-6
    2. 测量Z平面中的细胞器分布(图4C)。
      注:此分析确定细胞器荧光在激活到Ag覆盖玻片上的B细胞Z平面上的一般分布,显示每Z馏分荧光的百分比。
      1. 要量化 Z 中的荧光分布,首先确定细胞与 Ag 盖玻片接触的 IS 平面,然后确定与细胞上限对应的平面。
      2. 在单元格中心之间画一条线。
      3. 在 Z 中重新切片图像(图像 |堆栈 |重新切片),以获取 XZ 图像。
      4. 测量高度并将 XZ 图像划分为从底部(IS 接口)到顶部(单元格上侧)的 10 个相同高度(Z 分数)的连续矩形,并量化每个矩形中的荧光信号。
      5. 用10个分数的总荧光之和来标准化每个Z分数的荧光强度。
      6. 绘制每个细胞 Z 部分的荧光强度百分比。

5. 从静息和活化B细胞中分离中体富集分数

注:在实验期间,将所有溶液保持在4°C,以避免蛋白质降解。该协议改编自以前的工作17,18。

  1. 在 2 mL 的 CLICK 介质 + 2% 热灭活 FBS(比率 1:1)中激活 2 x 107 B 细胞,用 Ag 涂层珠子进行激活。将非激活的 B 细胞视为静止 B 细胞。
  2. 加入细胞沙沙星D(2 μM)和诺科达索(0.2μM),在37°C下孵育1小时。
    注:这些药物用于通过分别去聚合行为因子细胞骨架和微管来轻轻地从原子核分离中质体,以避免核污染。
  3. 用 5 mL 的冷 1x TBS(50 mM Tris-HCl、pH 7.6、150 mM NaCl)清洗每个样品,然后用 1 mL 的 0.1x TBS 补充 8% 蔗糖。
  4. 用150μL的中源裂解缓冲液(1 mM HEPES,pH 7.2,0.5% NP-40,0.5 mM MgCl 2,0.1%β-Mercaptoto乙醇,1mM苯基硫磷(PMSF)或蛋白酶抑制剂鸡尾酒)和移液器上下,直到粘度减少,表示在样品中识别细胞分线。将样品放入 1.5 mL 管中。
  5. 在10,000 x g下在4°C下离心10分钟,将细胞器与细胞核分离。
  6. 小心地回收上清液,并将其放置在含有 60% 蔗糖的 300 μL 梯度缓冲液 (GB) (10 mM PIPES pH 7.2, 0.1% Triton X-100, 0.1% β-汞醇) 的 1.5 mL 管顶部。
  7. 在10,000 x g下在4°C下离心30分钟,将中心体浓缩在60%蔗糖分量中。
  8. 同时,在 2 mL 超离心管中制备不连续梯度,将 450 μL 的 GB + 70% 蔗糖覆盖在 270 μL 的 GB + 50% 蔗糖中,然后覆盖 270 μL 的 GB = 40% 蔗糖。
  9. 在第一次离心(中位体浓缩分数)后,丢弃上半部分(密度较低的部分),直到到达界面并涡旋管中的剩余样品。然后,覆盖在先前用中流体富集样品制备的不连续梯度之上。
    注:小心不要破坏梯度,所有移液程序必须小心操作。
  10. 在 4°C 下以 40,000 x g离心 1 小时,加速最小,离心制动器设置关闭,以避免破坏梯度。
  11. 从顶部开始将 12 个 100 μL 的馏分收集到单独的管中。
  12. 使用β-图布林作为中源体标记物,通过免疫蛋白识别中源富集分数。
    注:我们通常发现在分数6和8之间的中位富集提取物。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本文展示了如何使用珠子或盖玻片上的固定抗原激活B细胞,以诱导IS的形成。我们提供有关如何通过免疫荧光识别和量化不同细胞器的极化的信息,以及如何使用生物化学方法。

B细胞通过免疫荧光成像使我们能够跟踪细胞器的动态,如中心体、Golgi仪器和乳糖体,这些细胞在B细胞激活时被招募到IS。可以获取定量参数,以测量这些细...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

我们描述了一个综合的方法,研究B淋巴细胞如何重新组织其细胞内结构,以促进IS的形成。这项研究包括使用成像技术来量化细胞器的细胞内分布,如在B细胞激活期间,如中位体、Golgi装置和乳索体,以及它们如何与IS极化。此外,我们描述了一种生物化学方法,用于研究B细胞激活后中体组合物的变化。

为了促进在B细胞中形成IS,我们使用固定抗原(抗原涂层珠子)代替可溶性免疫复合物,...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者没有什么可透露的。

致谢

M.-I.Y.由FONDECYT#1180900的研究资助。J.I.、D.F.和J.L.得到国家委员会研究金的支持。我们感谢智利天主教大学的大卫·奥索里奥进行录像和编辑。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
IIA1.6 (A20变体)小鼠B淋巴瘤细胞ATCCTIB-208源自Balb/c的小鼠B细胞淋巴瘤，其表面表达含IgG的BCR，但不表达FcγIIR
100%甲醇Fisher ScientificA412-4
10毫米直径的盖玻片，厚度No. 1圆形Marienfield-Superior111500
2-巯基乙醇Thermo Fisher Scientific21985023
Alexa 488荧光-驴抗兔IgG LifeTech A21206推荐1:500稀释，但应进行优化
Alexa Fluor 546山羊抗兔IgGThermo Fisher Scientific A-11071推荐1:500稀释，但应进行优化
Alexa Fluor 647偶联的磷酸酯酶Thermo Fisher Scientific A21238推荐1:500稀释，但应进行优化
Amaxa核转染试剂盒VLonzaVCA-1003按照制造商的说明将转染试剂与DNA混合
Amaxa核转染仪2b型号LonzaAAB-1001使用L-013程序
Amino-DynabeadsThermoFisher14307D
抗周期中心蛋白 Abcamab4448 推荐1:200稀释，但应进行优化
抗rab6Abcamab95954推荐1:200稀释，但应进行优化
抗sec61Abcamab15575推荐1:200稀释，但应进行优化
BSA Winkler BM-0150
CaCl2WinklerCA-0520
培养板T25BD353014
Fiji软件Fiji col.
Fluoromount GElectron Microscopy Science17984-25
谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific35050061
戊二醛Sigma G7651 
甘氨酸Winkler BM-0820
山羊抗小鼠IgG抗体Jackson ImmunoResearch315-005-003IIA1.6阳性配体
山羊抗小鼠IgM抗体Thermo Fisher Scientific31186IIA1.6阴性配体
HyClone胎牛血清Thermo Fisher ScientificSH30071.03在56 oC下加热灭活30分钟
KClWinklerPO-1260
Leica SP8 TCS显微镜Leica
NaClWinklerSO-1455
Nikon Eclipse Ti-E荧光显微镜 Nikon
ParafilmMP1150-2
甲醛Merck30525-89-4用PBS稀释至4%，在安全柜中使用
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific15140122液体
Polybead氨基微球3.00μmPolyscience17145-5
聚-L-赖氨酸SigmaP8920用无菌水稀释
兔抗α-小管蛋白抗体Abcamab6160推荐1:1000稀释，但应进行优化
兔抗小鼠lamp1抗体Cell signaling3243推荐1:200稀释，但应进行优化
兔抗cep55Abcamab170414推荐1:500稀释，但应进行优化
兔抗γ-小管蛋白抗体 Abcamab16504 1:1000用于Western Blot
RPMI-1640Biological Industries01-104-1A
皂苷 Merck558255
钠丙酮酸Thermo Fisher Scientific11360070
蔗糖Winkler SA-1390 
Triton X-100 Merck9036-19-5
50毫升试管Corning353043

参考文献

  1. Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
  2. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
  3. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
  4. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  5. Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
  6. Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  7. Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
  8. Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
  9. Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
  10. Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
  11. Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
  12. Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
  13. Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
  14. Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
  15. Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
  16. Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
  17. Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
  18. Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, (2015).
  19. Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
  20. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
  21. Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

148B

相关文章