本文介绍了两种用于表征B淋巴细胞在免疫突触（IS）形成过程中细胞极化事件的方法。第一种方法涉及对细胞器向突触膜募集以及细胞骨架在突触膜处重排的定量分析。第二种为生化方法，用于表征发生向免疫突触极化的中心体在组成上的变化。
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本文内容
摘要
摘要
表面锚定抗原的识别 通过B细胞受体（BCR） 触发免疫突触（IS）的形成，其中包含信号传导 并且抗原摄取是协调进行的。免疫突触（IS）的形成涉及动态的肌动蛋白重塑，同时伴随着中心体及与其相关的细胞内细胞器（如溶酶体和高尔基体）向突触膜的极化募集。肌动蛋白重塑的初始阶段使B细胞能够增加其细胞表面积，从而最大限度地富集突触处的抗原-BCR复合物。在某些条件下，当B细胞识别与刚性表面相关的抗原时，该过程会伴随溶酶体的局部募集与分泌，进而促进抗原的提取。被摄取的抗原 被内化到特化的内体-溶酶体区室中，加工成肽段，随后装载于主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）上，进一步呈递给辅助性T细胞。因此，研究与免疫突触（IS）形成相关的细胞器动态对于理解B细胞的活化机制至关重要。本文将讨论用于研究B细胞中免疫突触形成过程中细胞内细胞器定位变化及细胞骨架重排的成像技术和生物化学方法。
引言
B淋巴细胞是适应性免疫系统的重要组成部分，负责针对不同威胁和入侵病原体产生抗体。抗体产生的效率取决于B细胞获取、加工并呈递可溶性或表面锚定形式抗原的能力1,2。当B细胞受体（BCR）识别呈递细胞表面附着的抗原时，会形成一种紧密的细胞间接触结构，称为免疫突触（IS）3,4。在此动态平台上，既发生BCR依赖性的下游信号传导，也进行抗原向内体-溶酶体区室的内化。摄入的抗原被加工处理后，装载到MHC-II类分子上，并进一步呈递给T淋巴细胞。有效的B-T细胞相互作用，即B-T细胞协作，使B淋巴细胞获得适当信号，从而促进其分化为抗体分泌型浆细胞或记忆细胞8。
B细胞提取抗原涉及两种机制。第一种机制依赖于溶酶体来源的蛋白酶的分泌，这些蛋白酶被招募并融合至免疫突触间隙5,6。第二种机制依赖于肌球蛋白IIA介导的牵拉力，促使含有抗原的膜发生内陷，并被内吞至网格蛋白包被的小窝中7。抗原提取的方式取决于抗原所在膜的物理特性。然而，在这两种情况下，B细胞均经....
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方案
注意：以下步骤使用 IIA1.6 B 细胞进行。
1. 使用抗原包被的微珠激活B细胞
- 抗原包被微珠的制备
- 为了激活B细胞，使用NH2-共价包被抗原的珠粒（Ag-包被珠粒），使用50 µL（约20 × 10⁶）制备6 3 µm NH微珠2- 与激活性（BCR-配体+）或非激活性（BCR-配体-）抗原结合的微珠。
- 对于 IIA1.6 B 细胞，使用抗 IgG-F(ab')2 片段作为BCR-配体+和抗IgM-F(ab')2 或以牛血清白蛋白（BSA）作为BCR配体。用于激活原代B细胞或IgM+ B细胞系使用抗IgM-F(ab')2 以BCR-ligand+和BSA作为BCR-ligand-
注意：为避免配体与 Fc 受体结合，应使用 F(ab') 或 F(ab')2 抗体片段而非全长抗体 - 为制备银涂层微珠，将微珠置于低蛋白吸附的微量离心管中，以在样品操作过程中最大限度地回收微珠。加入1 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤微珠，并在16,000 × g条件下离心 g 5 分钟后，吸除上清液。
- 用500 µL 8%戊二醛重悬珠子以活化NH2 分....
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结果
本文介绍了如何利用固定在微珠或盖玻片上的抗原激活B细胞，以诱导免疫突触（IS）的形成。我们提供了通过免疫荧光识别和定量不同细胞器极性的方法信息，并介绍了如何采用生物化学方法，对在中心体（极化至免疫突触）定位发生动态变化的蛋白质进行表征。
通过免疫荧光成像观察B细胞，可追踪中心体、高尔基体和溶酶体等细胞器在B细胞活化后向免疫突触（IS）募集的动态过程。通过该方法可获得定量参数，用于测量这些细胞器向IS极化的程度，并可在不同条件下进行比较。如图1A所示，B细胞活化后，中心体和高尔基体会被募集至IS。而在仅使用BCR配体刺激的B细胞中未观察到此类募集现象，表明BCR的结合是驱动中心体和高尔基体向IS移动所必需的（图1A）。为了获得用于衡量各细胞器接近IS程度的极性指数，我们考虑了三个参数：细胞器与细胞中心之间的距离、微珠中心与细胞中心之间的.......
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讨论
我们描述了一种全面的方法，用于研究B淋巴细胞如何重组其细胞内结构以促进免疫突触（IS）的形成。该研究包括利用成像技术定量分析B细胞活化过程中细胞器（如中心体、高尔基体和溶酶体）的细胞内分布及其向免疫突触极化的情况。此外，我们还介绍了一种生物化学方法，用于研究B细胞活化后中心体组成的变化。
为了促进B细胞中免疫突触（IS）的形成，我们采用固定化抗原（抗原包被的微珠）而非可溶性免疫复合物，因为前者能够诱导形成明确的接触位点，便于研究细胞骨架的重排和细胞器的极化。在对B细胞活化进行成像时，一个关键环节是样品的制备。理想情况下，所有图像采集应获得1:1的细胞与微珠比例，以便量化细胞器向单一抗原接触位点的极化情况。然而，在某些情况下，B细胞可能捕获两个或更多微珠，从而难以确定唯一的抗原接触位点。为避免微珠聚集，在将抗原偶联的微珠加入细胞前，必须充分涡旋混匀。此外，在免疫荧光实验中，我们建议排除捕获多个微珠的细胞，以防止图像分析过程中出现误判。样品制备中的另一个关键步骤是固定与通透条件的选择。例如，我们推荐使用甲醇固定以优化微管染色效果，而使用4%多聚甲醛（PFA）固定则适用于鬼笔环肽（pha.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
M.-I.Y. 获得智利国家科学与技术研究委员会（FONDECYT）第1180900号研究基金资助。J.I.、D.F. 和 J.L. 获得智利国家科学与技术委员会研究生奖学金资助。我们感谢智利天主教大学的 David Osorio 提供视频录制与编辑工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| IIA1.6（A20 变体）小鼠 B 淋巴瘤细胞 | ATCC | TIB-208 | 来源于 Balb/c 小鼠的 B 细胞淋巴瘤，其表面表达含 IgG 的 BCR，但不表达 FcγIIR |
| 100% 甲醇 | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 直径 10 mm、厚度为 1 号圆形盖玻片 | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-巯基乙醇 | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 荧光标记驴抗兔 IgG | LifeTech | A21206 | 推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化 |
| Alexa Fluor 546 标记的山羊抗兔 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化 |
| Alexa Fluor 647 标记的鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化 |
| Amaxa 核转染试剂盒 V | Lonza | VCA-1003 | 按照制造商说明将转染试剂与 DNA 混合 |
| Amaxa Nucleofector 2b 型仪器 | Lonza | AAB-1001 | 使用程序 L-013 |
| 氨基磁珠（Amino-Dynabeads） | ThermoFisher | 14307D | |
| 抗中心粒周围蛋白抗体（Anti-pericentrin） | Abcam | ab4448 | 推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化 |
| 抗 rab6 抗体 | Abcam | ab95954 | 推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化 |
| 抗 sec61 抗体 | Abcam | ab15575 | 推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| T25 培养瓶 | BD | 353014 | |
| Fiji 软件 | Fiji col. | ||
| Fluoromount G 封片剂 | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| 谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 戊二醛 | Sigma | G7651 | |
| 甘氨酸 | Winkler | BM-0820 | |
| 山羊抗小鼠 IgG 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 阳性配体 |
| 山羊抗小鼠 IgM 抗体 | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 阴性配体 |
| HyClone 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | 在 56 oC 下灭活 30 分钟 |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS 显微镜 | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E 正置荧光显微镜 | Nikon | ||
| Parafilm 封口膜 | M | P1150-2 | |
| 多聚甲醛 | Merck | 30525-89-4 | 在生物安全柜中用 PBS 稀释至 4%，现配现用 |
| 青霉素-链霉素溶液 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 液体 |
| Polybead 氨基微球，直径 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P8920 | 用无菌水稀释 |
| 兔抗 α-微管蛋白抗体 | Abcam | ab6160 | 推荐稀释比例为 1:1000，但应进行优化 |
| 兔抗小鼠 lamp1 抗体 | Cell signaling | 3243 | 推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化 |
| 兔抗 cep55 抗体 | Abcam | ab170414 | 推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化 |
| 兔抗 γ-微管蛋白抗体 | Abcam | ab16504 | 用于 Western Blot 时稀释比例为 1:1000 |
| RPMI-1640 培养基 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| 皂苷 | Merck | 558255 | |
| 丙酮酸钠 | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| 蔗糖 | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| 50 ml 离心管 | Corning | 353043 |
参考文献
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E.
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