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研究B细胞在免疫突触形成过程中的细胞器动力学

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DOI：

10.3791/59621

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2019年6月1日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Immune Cell Biology, Department of Cellular and Molecular Biology, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Faculty of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Centro de Investigaciones en Biología Celular y Biomedicina, Facultad de Ciencia, Universidad San Sebastián

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了两种用于表征B淋巴细胞在免疫突触（IS）形成过程中细胞极化事件的方法。第一种方法涉及对细胞器向突触膜募集以及细胞骨架在突触膜处重排的定量分析。第二种为生化方法，用于表征发生向免疫突触极化的中心体在组成上的变化。

摘要

表面锚定抗原的识别 通过B细胞受体（BCR） 触发免疫突触（IS）的形成，其中包含信号传导 并且抗原摄取是协调进行的。免疫突触（IS）的形成涉及动态的肌动蛋白重塑，同时伴随着中心体及与其相关的细胞内细胞器（如溶酶体和高尔基体）向突触膜的极化募集。肌动蛋白重塑的初始阶段使B细胞能够增加其细胞表面积，从而最大限度地富集突触处的抗原-BCR复合物。在某些条件下，当B细胞识别与刚性表面相关的抗原时，该过程会伴随溶酶体的局部募集与分泌，进而促进抗原的提取。被摄取的抗原 被内化到特化的内体-溶酶体区室中，加工成肽段，随后装载于主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）上，进一步呈递给辅助性T细胞。因此，研究与免疫突触（IS）形成相关的细胞器动态对于理解B细胞的活化机制至关重要。本文将讨论用于研究B细胞中免疫突触形成过程中细胞内细胞器定位变化及细胞骨架重排的成像技术和生物化学方法。

引言

B淋巴细胞是适应性免疫系统的重要组成部分，负责针对不同威胁和入侵病原体产生抗体。抗体产生的效率取决于B细胞获取、加工并呈递可溶性或表面锚定形式抗原的能力1,2。当B细胞受体（BCR）识别呈递细胞表面附着的抗原时，会形成一种紧密的细胞间接触结构，称为免疫突触（IS）3,4。在此动态平台上，既发生BCR依赖性的下游信号传导，也进行抗原向内体-溶酶体区室的内化。摄入的抗原被加工处理后，装载到MHC-II类分子上，并进一步呈递给T淋巴细胞。有效的B-T细胞相互作用，即B-T细胞协作，使B淋巴细胞获得适当信号，从而促进其分化为抗体分泌型浆细胞或记忆细胞8。

B细胞提取抗原涉及两种机制。第一种机制依赖于溶酶体来源的蛋白酶的分泌，这些蛋白酶被招募并融合至免疫突触间隙5,6。第二种机制依赖于肌球蛋白IIA介导的牵拉力，促使含有抗原的膜发生内陷，并被内吞至网格蛋白包被的小窝中7。抗原提取的方式取决于抗原所在膜的物理特性。然而，在这两种情况下，B细胞均经历两个主要的重塑过程：肌动蛋白细胞骨架的重组以及细胞器向免疫突触（IS）的极化。肌动蛋白细胞骨架的重塑包括初始的铺展阶段，在此阶段，突触膜上依赖肌动蛋白的突起增加与抗原接触的表面积；随后是收缩阶段，通过分子马达与肌动蛋白细胞骨架重塑的协同作用，将与抗原结合的BCR集中到IS的中心区域8,9,10,11。细胞器的极化也依赖于肌动蛋白细胞骨架的重塑。例如，中心体通过其周围肌动蛋白的局部去聚合而与细胞核解偶联，从而使得该细胞器重新定位至IS5,12。在B细胞中，中心体向细胞一极（即IS）的重新定位可引导溶酶体募集至突触膜，溶酶体一旦分泌，便可促进表面锚定抗原的提取和/或加工6。募集到IS的溶酶体富含MHC-II，有利于在内体区室中形成肽-MHC-II复合物，进而呈递给T细胞13。此外，已有研究观察到高尔基体也被紧密募集至IS14，提示分泌途径中来自高尔基体的囊泡可能参与了抗原的提取和/或加工过程。

B细胞中细胞内细胞器与细胞骨架的重排 在突触形成过程中，高效获取和加工抗原以实现后续活化的关键步骤。本文介绍了用于研究B细胞中与免疫突触（IS）形成相关的细胞器内部重塑的成像和生化分析的详细方案。这些技术包括：（i）利用抗原包被的微珠或抗原包被的盖玻片激活B细胞后进行免疫荧光染色及图像分析，以实现对迁移至IS的细胞内组分的可视化与定量；（ii）通过蔗糖梯度超速离心法分离B细胞中富含中心体的组分，从而鉴定可能参与调控中心体功能的相关蛋白。 细胞极性

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方案

     注意：以下步骤使用 IIA1.6 B 细胞进行。

1. 使用抗原包被的微珠激活B细胞

  1. 抗原包被微珠的制备
    1. 为了激活B细胞，使用NH2-共价包被抗原的珠粒（Ag-包被珠粒），使用50 µL（约20 × 10⁶）制备6 3 µm NH微珠2- 与激活性（BCR-配体+）或非激活性（BCR-配体-）抗原结合的微珠。
    2. 对于 IIA1.6 B 细胞，使用抗 IgG-F(ab')2 片段作为BCR-配体+和抗IgM-F(ab')2 或以牛血清白蛋白（BSA）作为BCR配体。用于激活原代B细胞或IgM+ B细胞系使用抗IgM-F(ab')2 以BCR-ligand+和BSA作为BCR-ligand-
      注意：为避免配体与 Fc 受体结合，应使用 F(ab') 或 F(ab')2 抗体片段而非全长抗体
    3. 为制备银涂层微珠，将微珠置于低蛋白吸附的微量离心管中，以在样品操作过程中最大限度地回收微珠。加入1 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤微珠，并在16,000 × g条件下离心 g 5 分钟后，吸除上清液。
    4. 用500 µL 8%戊二醛重悬珠子以活化NH2 分组并在室温下旋转孵育4小时。
      警告：戊二醛储备液仅可在化学通风橱中使用。请遵循材料安全数据表（MSDS）中的说明。
    5. 离心珠子，16,000 x g g 孵育5分钟后，去除戊二醛，再用1 mL 1×PBS洗涤珠子三次。
      警告：戊二醛溶液应作为危险化学废物丢弃。
    6. 将活化的磁珠重悬于 100 µL 1x PBS 中。样品可分装至两个低蛋白结合的微量离心管中：50 µL 用于 BCR-配体+，50 µL 用于 BCR-配体-。
    7. 准备抗原溶液时，使用两个2 mL低蛋白结合力的微量离心管，每管中含有150 µL PBS配制的100 µg/mL抗原溶液：一管加入BCR-ligand+，另一管加入BCR-ligand-。
    8. 向每管含有150 µL抗原溶液的试管中加入50 µL活化磁珠溶液，涡旋混匀，并在4 °C旋转孵育过夜。
    9. 加入500 µL浓度为10 mg/mL的BSA以封闭剩余的活性NH2 珠子上的基团在4 °C下旋转孵育1小时。
    10. 以 16,000 x g 离心珠子 g 4 °C下离心5分钟，弃上清液。用预冷的1×PBS再洗涤磁珠3次。
    11. 将活化的磁珠重悬于70 µL的1x PBS中。
    12. 为确定银涂层微珠的最终浓度，用PBS将少量微珠稀释（1:200），使用血细胞计数板进行计数。随后于4 °C保存，直至使用。
      注意：镀银微珠的储存时间不应超过1个月。
  2. 多聚-L-赖氨酸盖玻片的制备
    1. 在使用抗原包被的微珠进行B细胞活化实验之前，先准备多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片（PLL-盖玻片）。取一个50 mL离心管，加入40 mL浓度为0.01%（w/v）的PLL溶液，将直径为12 mm的盖玻片浸入溶液中，室温下旋转孵育过夜。
    2. 用1×PBS清洗盖玻片，并将其置于覆盖有石蜡膜的24孔板盖上晾干。随后进行B细胞激活。
  3. B细胞活化
    1. 为了使用磁珠启动B细胞活化，首先将IIA1.6 B细胞系稀释至1.5 × 10⁶6 细胞/mL，置于CLICK培养基中（RPMI-1640添加2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 + 55 µM β-巯基乙醇 + 1 mM 丙酮酸钠 + 100 U/mL 青霉素 + 100 µg/mL 链霉素）+ 5% 热灭活胎牛血清 [FBS]）
    2. 将100 µL（150,000个细胞）IIA1.6 B细胞与抗原包被的微珠按1:1比例在0.6 mL离心管中混合。用涡旋振荡器轻轻混匀后接种至PLL包被的盖玻片上。在细胞培养孵箱中（37 °C / 5% CO₂）孵育不同时间。2）。典型的激活时间点为 0、30、60 和 120 分钟。对于 0 分钟时间点，将 PLL-盖玻片置于冰上的 24 孔板盖内，加入细胞-抗原包被微珠混合物，在冰上孵育 5 分钟。
      注意：必须通过涡旋混合，而不是反复吹打，因为后者可能导致磁珠在移液器吸头的塑料尖端聚集，从而减少样品中的磁珠数量。每次实验均应使用包被有BCR配体阴性对照的磁珠作为阴性对照。建议先启动最长孵育时间的样本，再依次启动后续时间点的样本。应合理计算各样本的激活时间间隔，使其同时完成并准备进行固定处理。
    3. 向每张盖玻片中加入 100 µL 冷的 1x PBS 以终止激活反应，随后继续进行免疫荧光实验步骤。参见方案第 3 节

2. 抗原包被盖玻片上B细胞的活化

  1. 抗原包被盖玻片的制备
    1. 激活前，配制抗原溶液（含10 µg/mL BCR-ligand+ 和0.5 µg/mL 大鼠抗小鼠CD45R/B220的1x PBS溶液）。
      注意：建议在实验前一天准备盖玻片。B220可增强B细胞黏附，但BCR-Ligand+已足以引发铺展反应。
    2. 将12 mm盖玻片置于覆盖有石蜡膜的24孔板盖上，每张盖玻片上加入40 µL抗原溶液，4 °C过夜孵育。密封培养板以防止抗原溶液蒸发。
    3. 用1×PBS洗涤盖玻片，然后空气干燥。
  2. B细胞活化
    1. 为启动活化，将 IIA1.6 B 细胞稀释至 1.5 x 106 细胞/mL，使用 CLICK 培养基 + 5% FBS。
    2. 将100 µL细胞加入抗原包被的盖玻片（Ag-coverslip）上，在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育不同时间点进行激活。典型的激活时间点为0、30和60分钟。
      注意：与第1节相同，建议从最长的激活时间点开始，以便同时固定所有样本。
    3. 在0时间点，将含有Ag-盖玻片的24孔板盖置于冰上，并加入细胞。在冰上孵育5分钟。
    4. 小心吸去每张抗原载玻片上的培养基，然后加入 100 µL 冷的 1x PBS 以终止激活反应。继续进行免疫荧光实验步骤。参见第 3 节。

3. 免疫荧光

注意：为避免二抗与 IIA 1.6 B 细胞的 BCR 发生交叉反应，请勿使用小鼠来源的一抗。

  1. 移除 1x PBS，然后对每张盖玻片进行固定。
    注意：选择何种固定液，请参考抗体/染料的产品说明书。例如，使用鬼笔环肽标记肌动蛋白时应采用多聚甲醛（PFA）固定液；使用抗中心粒周围蛋白（pericentrin）抗体标记中心体时应使用甲醇固定。
    1. 加入 50 µL 含 4% PFA 的 1x PBS，室温孵育 10 分钟。
      注意：甲醛具有毒性。使用该化学品前请仔细阅读材料安全数据表（MSDS）。配制 PFA 溶液时必须在通风橱内操作，并佩戴手套和护目镜。PFA 溶液应作为危险化学废物妥善处理。
    2. 或者，加入 50 µL 冷甲醇，孵育 20 分钟。
  2. 用 1x PBS 洗涤三次。
    注意：此时盖玻片可在 1x PBS 中于 4 °C 最多保存三天。
  3. 移除 1x PBS，向每张盖玻片上加入 50 µL 封闭缓冲液（含 2% BSA 和 0.3 M 甘氨酸的 1x PBS），室温孵育 10 分钟。
  4. 轻柔吸除液体，加入 50 µL 通透缓冲液（PB）（含 0.2% BSA 和 0.05% 皂苷的 1x PBS），室温孵育 20 分钟。
  5. 将抗体或染料用 PB 稀释（每张盖玻片使用 30 µL），室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。更多细节请参见材料表。
    1. 标记微管组织中心（MTOC）或中心体时，可使用以下抗体：抗 γ-微管蛋白抗体（1:500）、抗 Cep55 抗体（1:500）、抗 α-微管蛋白抗体（1:500）、抗 pericentrin 抗体（1:1000）。
      注意：为标记中心体，B 细胞可转染表达 centrin-GFP 的质粒。
    2. 标记高尔基体时使用抗 Rab6a 抗体（1:500）。
      注意：也可使用其他抗体或染料。
    3. 标记溶酶体时使用抗 Lamp1 抗体（1:200）。
      注意：抗 H2-DM 和抗 MHC-II 抗体也可用于标记抗原加工区室15,16。
    4. 标记内质网时使用抗 Sec61a 抗体（1:500）。
    5. 标记肌动蛋白细胞骨架时可考虑以下方法：聚合态肌动蛋白可通过与荧光染料偶联的鬼笔环肽进行可视化。
      注意：转染了 LifeAct-GFP/RFP 表达质粒的 B 细胞也可用于标记肌动蛋白。
  6. 用 PBS 将盖玻片洗涤三次。
  7. 将二抗或染料用 PBS 稀释（每张盖玻片使用 30 µL），室温孵育 1 小时。
    注意：避免样品暴露于直射光下，以保持荧光信号的质量。
  8. 用 PBS 将盖玻片洗涤三次。
  9. 从盖玻片上移除 PBS 溶液。
  10. 在载玻片上滴加 4 µL 封片试剂。将盖玻片细胞面向下封于载玻片上，置于 37 °C 干燥 30 分钟，或室温过夜。
    注意：建议使用“抗荧光淬灭”封片试剂（见材料表）。
  11. 使用共聚焦或落射荧光显微镜，配备 60x 或 100x 油镜采集荧光图像。每次成像时建议同时采集透射光或明场图像，以便于识别与微珠相互作用的 B 细胞。
    注意：建议采集三维（3D）图像，通过 z 轴层扫覆盖整个细胞。推荐 z 轴步进为 0.5 µm，但具体参数取决于所用显微镜。

4. 图像分析

注意：以下算法以 ImageJ 软件为例进行描述，但也可使用功能相当的软件完成。此外，请注意，所有荧光强度测量均采用总荧光密度（ImageJ 中的 "RawIntDen"），因为该参数综合考虑了图像中每个像素的荧光总量，并计入了面积因素。

  1. 使用抗原包被微珠激活的B细胞中细胞器分布的分析
    注意：为了量化细胞组分向免疫突触（IS）的极化程度，我们定义了一个任意值作为组分接近IS的衡量标准。该指数范围介于-1（反极化）和1（完全极化，物体位于微珠上）之间，如Reversat等先前所述。12.
    1. 估算中心体和高尔基体的极性指数（图1B).
      注意：该算法可用于局限于单一点位的细胞器。
      1. 首先定义用于分析的微珠和细胞区域 圆形工具 选择以划定两者的边界，然后将其保存为感兴趣区域（ROI）。参见 图1, 图2, 图3，以及 图4.
      2. 确定细胞中心（CC）以及珠子中心（BC）通过运行 分析 | 测量 分别在细胞和微珠区域。从X和Y值获得的 结果 窗口确定中心坐标。
      3. 手动确定中心体或高尔基体的中心位置（细胞器) 使用 点工具 在 ImageJ 中进行选择并运行 分析 | 测量. 从X和Y值得到的 结果 窗口确定坐标。
      4. 然后，从CC向细胞器画一条角度线（a）以及 CC 至 BC（b) 使用角度工具选择并运行 分析 | 测量。该 角度 值在 结果 窗口显示角度（α）在两种载体之间（a 和 b).
      5. 使用以下公式计算极性指数：
        Polarity index formula, Polarity Index = a(cos(α)/b), used in chemical analysis, diagram.
    2. 估算溶酶体的极性指数（图1F).
      注意：我们使用该算法来分析分布较为分散的细胞器（如溶酶体）的极性。
      1. 定义需分析的珠子和细胞区域，使用 圆形工具 选择以划定两者的边界，并将其保存为感兴趣区域（ROI）。在确定微珠和细胞区域后，设置荧光通道并将图像投影为一个z轴层叠图像（z-stack）图像 | 图像序列 | Z轴投影［求和切片］），然后运行 分析 | 测量 并从结果窗口中提取质心（MC）坐标（MX 和 MY）。
      2. 应用之前提到的相同算法，只需将其中的 Organelle 替换为 MC。因此，该角度（α) 由 CC-MC 定义（a）和 CC-BC（b).
      3. 使用以下公式计算极性：
        Polarity index equation: Polarity Index = a cos(α)/b. Mathematical formula for research analysis.
    3. 估算溶酶体向突触区域的募集图2B).
      注意：该算法用于定量分析靠近免疫突触（IS）的细胞器。
      1. 确定微珠和细胞区域后，计算CC与BC之间向量的角度，然后旋转图像以获得0°角。
      2. 设置荧光通道，并将图像投影为一个z轴层叠图像（图像 | 图像序列 | Z轴投影［最大强度投影］），消除细胞和微珠区域之外的所有荧光信号（运行 编辑 | 清除外部 在 ImageJ 中）。
      3. 使用 矩形工具 选择，在珠子旁边绘制一个矩形，并测量突触区域的荧光强度（SAF该矩形宽度为细胞宽度的四分之一。
      4. 选择整个图像并运行 分析 | 测量 以获得全细胞荧光（WCF).
      5. 使用以下公式计算邻近免疫突触（IS）的细胞器荧光百分比：
        Synaptic fluorescence formula, SAF/WCF x 100%, equation for fluorescence analysis.
    4. 量化细胞组分向中心体的募集
      注意：本算法改编自 Obino 等人。5用于量化细胞器在中心体区域的富集程度。简言之，我们将中心体区域定义为在荧光强度/半径曲线中，与中心体相关的细胞器荧光信号保持恒定或高于70%的范围。必须在静息状态下设定此参数，因为该半径在细胞激活后可能发生变化。
      1. 在确定微珠和细胞区域后，利用以下方法定义中心体的定位 点工具 选择图3B).
      2. 首先，通过绘制一个围绕中心体、半径为 3 µm 的圆形区域，确定可定量分析的中心体周围最大范围。
      3. 使用 ImageJ 插件 径向分布轮廓，该方法通过测量同心圆内的荧光强度，并生成荧光强度/半径分布图。
      4. 确定荧光强度至少保持70%的最大半径。
      5. 使用以下公式计算荧光密度比：
        Ratio centrosome/cell density formula; scientific calculation; research data analysis.  = Fluorescence intensity ratio equation for centrosome analysis in cellular microscopy.
        注意：荧光密度比表示细胞器在中心体处的浓度相对于其在整个细胞中分布的浓度。
  2. 在抗原包被的载玻片上激活的B细胞中细胞铺展及细胞器分布的分析
    1. 估算细胞器在免疫突触处的分布图4B).
      注意：该算法可用于量化细胞器在免疫突触（IS）中心区域的XY分布及其浓度。我们定义了中心突触区域与总突触区域之间的荧光密度比值。所得数值可从负值到正值变化，分别指示细胞器的周边分布或中心聚集。
      1. 确定细胞与盖玻片接触的切片层面。
        注意：为了界定细胞边界，可以对质膜或在免疫突触周边富集的肌动蛋白进行标记。
      2. 将切片类型更改为8位，然后进行二值化（流程 | 二进制 | 生成二进制）并连接最近的外部点，过程 | 二值化 | 轮廓。界定细胞区域的边界（钙) 使用 多边形工具 筛选
        注意：此步骤有助于增强细胞边界的对比度，便于识别。此外，此时可以应用 分析颗粒 ImageJ 的插件可自动测定 CA，但同一视野中的其他细胞可能会干扰结果。
      3. 取 钙 参数（高度和宽度）并划定一个中心圆形区域，该区域与边界的距离为高度和宽度值的四分之一，将此区域视为细胞中心区（CCA）。
      4. 使用以下公式计算免疫突触中心的荧光密度分布：
        Organelle recruitment calculation formula, symbolizing fluorescence area ratio, study diagram.
    2. 在Z平面上测量细胞器分布（图4C).
      注意：该分析用于确定B细胞在抗原包被的盖玻片上活化后，细胞器荧光在Z平面的总体分布情况，显示每个Z层段的荧光百分比。
      1. 为了量化Z方向上的荧光分布，首先确定细胞与抗原覆盖玻片接触处的免疫突触（IS）所在平面，然后确定对应于细胞上边界极限的平面。
      2. 在细胞中心画一条线。
      3. 在 Z 轴方向重新切片图像（图像 | 图像序列 | 重新切片），以获取XZ图像。
      4. 测量高度，并将XZ图像从底部（IS界面）到顶部（细胞上侧）沿高度方向等分为10个连续的矩形区域（Z分段），分别量化每个区域中的荧光信号。
      5. 将每个 Z 分数的荧光强度除以 10 个分数的总荧光强度之和进行归一化。
      6. 绘制细胞每个Z层面的荧光强度百分比。

5. 从静息和活化B细胞中分离富含中心体的组分

注意：实验过程中所有溶液均需置于 4 °C 保存，以防止蛋白质降解。本方案改编自先前的研究17,18。

  1. 在 2 mL CLICK 培养基 + 2% 热灭活 FBS 中，以 1:1 的比例使用抗原包被的磁珠激活 2 × 107 个 B 细胞。未激活的 B 细胞视为静息态 B 细胞。
  2. 加入细胞松弛素 D（2 µM）和诺考达唑（0.2 µM），在 37 °C 下孵育 1 小时。
    注意：这些药物分别通过解聚肌动蛋白细胞骨架和微管，温和地使中心体与细胞核分离，以避免核污染。
  3. 每份样品先用 5 mL 冷的 1× TBS（50 mM Tris-HCl，pH 7.6，150 mM NaCl）洗涤，再用含 8% 蔗糖的 1 mL 0.1× TBS 洗涤。
  4. 用 150 µL 中心体裂解缓冲液（1 mM HEPES，pH 7.2，0.5% NP-40，0.5 mM MgCl2，0.1% 巯基乙醇，1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）或蛋白酶抑制剂混合物）重悬细胞，并反复吹打直至黏度降低，表明细胞已裂解。将样品转移至 1.5 mL 离心管中。
  5. 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟，以分离细胞器与细胞核。
  6. 小心收集上清液，并将其加至含有 300 µL 梯度缓冲液（GB）（10 mM PIPES，pH 7.2，0.1% Triton X-100，0.1% 巯基乙醇）并添加 60% 蔗糖的 1.5 mL 离心管中。
  7. 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 30 分钟，使中心体富集于 60% 蔗糖组分中。
  8. 同时，在 2 mL 超速离心管中制备不连续梯度：依次叠加 450 µL GB + 70% 蔗糖、270 µL GB + 50% 蔗糖和 270 µL GB + 40% 蔗糖。
  9. 第一次离心后（中心体富集组分），弃去上层较轻部分，保留至界面处，涡旋混匀管中剩余样品。然后将富集的中心体样品小心叠加至预先制备的不连续梯度上层。
    注意：操作时需避免破坏梯度，所有移液步骤均应谨慎进行。
  10. 在 4 °C 下以 40,000 × g 离心 1 小时，设置最低加速度且关闭离心机制动，以避免破坏梯度。
  11. 从顶部开始，分别收集 12 个 100 µL 的组分至不同的离心管中。
  12. 使用 γ-微管蛋白作为中心体标志物，通过免疫印迹鉴定富含中心体的组分。
    注意：我们通常在第 6 至第 8 组分中发现富含中心体的提取物。

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结果

本文介绍了如何利用固定在微珠或盖玻片上的抗原激活B细胞，以诱导免疫突触（IS）的形成。我们提供了通过免疫荧光识别和定量不同细胞器极性的方法信息，并介绍了如何采用生物化学方法，对在中心体（极化至免疫突触）定位发生动态变化的蛋白质进行表征。

通过免疫荧光成像观察B细胞，可追踪中心体、高尔基体和溶酶体等细胞器在B细胞活化后向免疫突触（IS）募集的动态过程。通过该方法可获得定量参数，用于测量这些细胞器向IS极化的程度，并可在不同条件下进行比较。如图1A所示，B细胞活化后，中心体和高尔基体会被募集至IS。而在仅使用BCR配体刺激的B细胞中未观察到此类募集现象，表明BCR的结合是驱动中心体和高尔基体向IS移动所必需的（图1A）。为了获得用于衡量各细胞器接近IS程度的极性指数，我们考虑了三个参数：细胞器与细胞中心之间的距离、微珠中心与细胞中心之间的...

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讨论

我们描述了一种全面的方法，用于研究B淋巴细胞如何重组其细胞内结构以促进免疫突触（IS）的形成。该研究包括利用成像技术定量分析B细胞活化过程中细胞器（如中心体、高尔基体和溶酶体）的细胞内分布及其向免疫突触极化的情况。此外，我们还介绍了一种生物化学方法，用于研究B细胞活化后中心体组成的变化。

为了促进B细胞中免疫突触（IS）的形成，我们采用固定化抗原（抗原包被的微珠）而非可溶性免疫复合物，因为前者能够诱导形成明确的接触位点，便于研究细胞骨架的重排和细胞器的极化。在对B细胞活化进行成像时，一个关键环节是样品的制备。理想情况下，所有图像采集应获得1:1的细胞与微珠比例，以便量化细胞器向单一抗原接触位点的极化情况。然而，在某些情况下，B细胞可能捕获两个或更多微珠，从而难以确定唯一的抗原接触位点。为避免微珠聚集，在将抗原偶联的微珠加入细胞前，必须充分涡旋混匀。此外，在免疫荧光实验中，我们建议排除捕获多个微珠的细胞，以防止图像分析过程中出现误判。样品制备中的另一个关键步骤是固定与通透条件的选择。例如，我们推荐使用甲醇固定以优化微管染色效果，而使用4%多聚甲醛（PFA）固定则适用于鬼笔环肽（pha...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

M.-I.Y. 获得智利国家科学与技术研究委员会（FONDECYT）第1180900号研究基金资助。J.I.、D.F. 和 J.L. 获得智利国家科学与技术委员会研究生奖学金资助。我们感谢智利天主教大学的 David Osorio 提供视频录制与编辑工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
IIA1.6（A20 变体）小鼠 B 淋巴瘤细胞ATCCTIB-208来源于 Balb/c 小鼠的 B 细胞淋巴瘤，其表面表达含 IgG 的 BCR，但不表达 FcγIIR
100% 甲醇Fisher ScientificA412-4
直径 10 mm、厚度为 1 号圆形盖玻片Marienfield-Superior111500
2-巯基乙醇Thermo Fisher Scientific21985023
Alexa 488 荧光标记驴抗兔 IgG LifeTech A21206推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化
Alexa Fluor 546 标记的山羊抗兔  IgGThermo Fisher Scientific A-11071推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化
Alexa Fluor 647 标记的鬼笔环肽Thermo Fisher Scientific A21238推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化
Amaxa 核转染试剂盒 VLonzaVCA-1003按照制造商说明将转染试剂与 DNA 混合
Amaxa Nucleofector 2b 型仪器LonzaAAB-1001使用程序 L-013
氨基磁珠（Amino-Dynabeads）ThermoFisher14307D
抗中心粒周围蛋白抗体（Anti-pericentrin） Abcamab4448 推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化
抗 rab6 抗体Abcamab95954推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化
抗 sec61 抗体Abcamab15575推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化
牛血清白蛋白（BSA） Winkler BM-0150
CaCl2WinklerCA-0520
T25 培养瓶BD353014
Fiji 软件Fiji col.
Fluoromount G 封片剂Electron Microscopy Science17984-25
谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific35050061
戊二醛Sigma G7651 
甘氨酸Winkler BM-0820
山羊抗小鼠 IgG 抗体Jackson ImmunoResearch315-005-003IIA1.6 阳性配体
山羊抗小鼠 IgM 抗体Thermo Fisher Scientific31186IIA1.6 阴性配体
HyClone 胎牛血清Thermo Fisher ScientificSH30071.03在 56 oC 下灭活 30 分钟
KClWinklerPO-1260
Leica SP8 TCS 显微镜Leica
NaClWinklerSO-1455
Nikon Eclipse Ti-E 正置荧光显微镜 Nikon
Parafilm 封口膜MP1150-2
多聚甲醛Merck30525-89-4在生物安全柜中用 PBS 稀释至 4%，现配现用
青霉素-链霉素溶液Thermo Fisher Scientific15140122液体
Polybead 氨基微球，直径 3.00μmPolyscience17145-5
聚-L-赖氨酸SigmaP8920用无菌水稀释
兔抗 α-微管蛋白抗体Abcamab6160推荐稀释比例为 1:1000，但应进行优化
兔抗小鼠 lamp1 抗体Cell signaling3243推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化
兔抗 cep55 抗体 Abcamab170414推荐稀释比例为 1:500，但应进行优化
兔抗 γ-微管蛋白抗体 Abcamab16504 用于 Western Blot 时稀释比例为 1:1000
RPMI-1640 培养基Biological Industries01-104-1A
皂苷 Merck558255
丙酮酸钠Thermo Fisher Scientific11360070
蔗糖Winkler SA-1390 
Triton X-100 Merck9036-19-5
50 ml 离心管Corning353043

参考文献

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