使用 CRISPR/Cas9 在 CAR-T 细胞中敲除 GM-CSF

摘要

本文介绍了一种通过CRISPR/Cas9系统对CAR-T细胞进行基因编辑的实验方案。

摘要

嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法是一种前沿且可能具有革命性的癌症治疗新方法。然而，该疗法在癌症治疗中的广泛应用仍存在显著局限性。这些局限性包括出现独特的毒性反应，如细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性（NT），以及在实体瘤中CAR-T细胞扩增能力有限、效应功能不足和抗肿瘤活性较弱。一种提高CAR-T疗效和/或控制其毒性的策略是在CAR-T细胞制备过程中对CAR-T细胞自身的基因组进行编辑。本文描述了通过慢病毒载体转导携带靶向粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的向导RNA和Cas9的构建体，实现CRISPR/Cas9基因编辑技术在CAR-T细胞中的应用。以敲除GM-CSF为例，我们阐述了CRISPR/Cas9介导的GM-CSF基因敲除方法。我们已证实，与野生型CAR-T细胞相比，GM-CSF^k/o CAR-T细胞能够有效减少GM-CSF的产生，同时保持关键的T细胞功能，并在体内表现出更强的抗肿瘤活性。

引言

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）疗法在癌症治疗中展现出巨大前景。^1,2 近期，两种靶向CD19的CAR-T细胞疗法（CART19）已在美国和欧洲获批，用于治疗B细胞恶性肿瘤，其在多中心临床试验中表现出显著疗效。^3,4,5 CAR-T细胞更广泛应用的障碍包括在实体瘤中活性有限，以及相关的毒性反应，如细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性（NT）。^3,5,6,7,8,9 为了提高CAR-T细胞疗法的治疗指数，研究人员利用锌指核酸酶、TALENs和CRISPR等基因组编辑工具对CAR-T细胞进行进一步改造，以期获得毒性更低或疗效更佳的CAR-T细胞。^10,....

方案

本方案遵循梅奥诊所机构审查委员会（IRB）和机构生物安全委员会（IBC）的指南。

1. CART19 细胞的制备

1. T细胞分离、刺激及体外培养
   1. 在细胞培养超净台中进行所有细胞培养操作，并使用适当的个人防护装备。从去标识化的正常供体血液分离锥中收集外周血单个核细胞（PBMCs），这些血液样本是在单采术期间采集的，已知是PBMCs的有效来源。¹³
   2. 分离PBMC时，向50 mL密度梯度分离管中加入15 mL密度梯度介质。用等体积含2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释供体血液，以避免细胞滞留。
      1. 将锥形容器中稀释后的供体血液加入分离管，注意不要扰动血液与密度梯度介质之间的界面。在1,200 x g 室温下孵育10分钟。
      2. 将上清液倒入一个新的50 mL锥形管中，用PBS + 2% FBS定容至40 mL洗涤，300 × g离心 g 室温孵育8分钟，吸除上清液，加入40 mL缓冲液重悬细胞，计数细胞。
   3. 使用全自动细胞分离仪，根据制造商说明书，通过负向选择磁珠试剂盒从外周血单个核细胞中分离T细胞。
   4. 为了培养分离的T细胞，需制备T细胞培养基 （TCM）由10%人AB血清（v/v）、1%青霉素-链....

结果

图1 显示了GM-CSF^k/o CART19细胞中GM-CSF的减少。为验证T细胞基因组已被编辑以敲除GM-CSF，对GM-CSF^k/o CART19细胞进行了TIDE测序分析（图1A）。通过门控活CD3+细胞进行CAR-T细胞表面染色，证实T细胞在体外成功表达了CAR表面受体（图1B）。通过流式细胞术对GM-CSF进行胞内染色，门控活CD3+细胞后显示GM-CSF^k/o CART19细胞中GM-CSF表达显著降低，验证了基因敲除的功能性成功（图1C）。与野生型抗CD19 CAR-T细胞（CART19）相比，GM-CSF^k/o CAR-T细胞通过胞内染色检测显示GM-CSF水平降低（图1B）.......

讨论

在本报告中，我们描述了一种利用 CRISPR/Cas9 技术在 CAR-T 细胞中诱导二次修饰的方法。具体而言，该方法 使用含有靶向目的基因的gRNA和Cas9的慢病毒载体，通过慢病毒转导生成粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）^k/o CART19细胞。我们先前已证明，在异种移植模型中，GM-CSF中和可改善细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性（NT）。¹² 如前所述，GM-CSF^k/o CAR-T细胞可在制备过程中抑制GM-CSF，有效减少GM-CSF的产生，同时维持其他关键的T细胞功能，与野生型CAR-T细胞相比，体内抗肿瘤活性显著增强。¹²

由于Cas9在基因组中的永久性整合在转化为临床可用产品时可能带来非预期效应，我们提出这一特定方法，用于生成研究级别的CRISPR/Cas9修饰的CART19，以进行概念验证实验。

尽管CAR-T细胞在癌症治疗中具有前.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CD3 单克隆抗体（OKT3），PE，eBioscience	Invitrogen	12-0037-42
CD3 单克隆抗体（UCHT1），APC，eBioscience	Invitrogen	17-0038-42
Choice Taq Blue Mastermix	Denville Scientific	C775Y51
CTS（细胞治疗系统）Dynabeads CD3/CD28	Gibco	40203D
CytoFLEX 系统 B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	流式细胞仪
二甲基亚砜	Millipore Sigma	D2650-100ML
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Gibco	14190-144
Dynabeads MPC-S（磁性颗粒浓缩器）	Applied Biosystems	A13346
Easy 50 EasySep 磁铁	STEMCELL Technologies	18002
EasySep 人 T 细胞分离试剂盒	STEMCELL Technologies	17951	阴性选择磁珠；17951RF 包含吸头和缓冲液
胎牛血清	Millipore Sigma	F8067
FITC 标记小鼠抗人 CD107a	BD Pharmingen	555800
固定液（溶液A）	Invitrogen	GAS001S100
GenCRISPR gRNA 载体：名称：CSF2 CRISPR 指导 RNA 1；物种：人，载体： pLentiCRISPR v2；抗性：氨苄青霉素；拷贝数： 高；质粒制备：标准递送：4 μ克（游离） 免费	GenScript	N/A	定制订单
抗小鼠 IgG（H+L）山羊多克隆二抗，经交叉吸附，Alexa Fluor 647 标记	Invitrogen	A-21235
https://tide.nki.nl	Desktop Genetics
人AB型血清；男性供体；AB型；美国	康宁	35-060-CI
IFNγ 单克隆抗体（4S.B3），APC-eFluor 780，eBioscience	Invitrogen	47-7319-42
Lipofectamine 3000 转染试剂	Invitrogen	L3000075
LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒（适用于 405 nm 激发）	Invitrogen	L34966
Lymphoprep	STEMCELL Technologies	07851
莫能菌素溶液，1000倍浓缩液	BioLegend	420701
小鼠抗人 CD28 克隆 CD28.2	BD Pharmingen	559770
小鼠抗人 CD49d 单克隆抗体 9F10	BD Pharmingen	561892
小鼠抗人MIP-1β PE-Cy7	BD Pharmingen	560687
Frosty先生冷冻容器	赛默飞世尔科技	5100-0001
NALM6，克隆 G5	ATCC	CRL-3273	急性淋巴细胞白血病细胞系
无核酸酶水	Promega	P119C
奥林巴斯真空过滤系统，500 mL，PES膜，0.22 μm，无菌	Genesee Scientific	25-227
Nalgene 快速流速无菌一次性滤器（CN 膜，0.45 μm）	赛默飞世尔科技 Nalgene	450-0045
Opti-MEM I 低血清培养基（1X），液体	Gibco	31985-070
PE-CF594 小鼠抗人 IL-2	BD Horizon	562384
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100倍浓缩液），液体	Gibco	10378-016
破膜液（B液）	Invitrogen	GAS002S100
PureLink 基因组 DNA 小量提取试剂盒	Invitrogen	K182001
嘌呤霉素二盐酸盐	MP Biomedicals, Inc.	0210055210
QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒	QIAGEN	28704
大鼠抗人 GM-CSF BV421	BD Horizon	562930
RoboSep-S	STEMCELL Technologies	21000	全自动细胞分离仪
SepMate-50（IVD）	STEMCELL Technologies	85450
叠氮化钠，5%（w/v）	Ricca Chemical	7144.8-16
X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基	Lonza	04-418Q