使用 Ever 设计自动化、高通量、连续细胞生长实验

摘要

EVOLVER 框架可实现高通量连续微生物培养, 具有高分辨率和对实验参数的动态控制。该协议演示了如何应用该系统进行复杂的健身实验, 指导用户对许多文化进行自动化控制编程, 实时测量、收集和与实验数据交互。

摘要

连续培养方法使细胞能够在定量控制的环境条件下生长, 因此对于测量健身表型和提高我们对基因型如何通过选择形成的认识具有广泛的用途。最近为开发和应用生态位连续培养装置所做的广泛努力揭示了进行新形式的细胞培养控制的好处。这包括定义自定义选择压力和提高研究的吞吐量, 从长期的实验进化到全基因组的图书馆选择和合成基因电路的表征。最近开发了 eVOLVER 平台, 以满足这一不断增长的需求: 一个具有高度可扩展性、灵活性和自动化的连续文化平台。eVOLVER 提供了一个单一的标准化平台, 可以 (重新) 配置和缩放, 只需花费最少的精力来执行许多不同类型的高吞吐量或多维增长选择实验。在这里, 我们提出了一个协议, 为 eVOLVER 框架的用户提供了一个描述, 用于配置系统以进行自定义的大规模连续增长实验。具体而言, 该协议指导用户如何对系统进行编程, 使其在许多 eVOLVER 瓶中多重选择温度和渗透性两种选择压力, 以便在罚款的情况下量化酿酒酵母突变体的健身景观分辨率。我们展示了如何通过其开源基于 web 的软件以编程方式配置设备, 以及通过安排流体和硬件布局进行物理配置。详细介绍了设备的物理设置、培养例程编程、互联网实时监控和与实验交互、采样小瓶进行后续离线分析以及实验后数据分析的过程。这应该成为不同学科的研究人员在设计自己复杂和高通量细胞生长实验以研究和操作生物系统方面应用 eVOLVER 的起点。

引言

连续细胞培养技术, 最早开发于近70年前^1,2, 正在享受最近的^{复兴 3,4}。这是由于多种因素交织在一起造成的。首先, 高通量组学技术的发展, 使得有可能读出并产生大量的基因型 5^,6, 同时产生了对实验技术的需求, 促进了控制良好的细胞生长和表型。为此, 连续培养是利用新兴基因组进步的一种强大的实验方法。通过促进生长选择在精确控制 (和动态) 环境条件下的细胞种群实验, 连续培养提供了一种方法, 可以严格地将基因型映射到表型^7,8,定量表征工程菌株和生物体⁹, 并跟踪实验室进化研究^中的适应性遗传变化 10^{, 11,12.}

其次, 最近出现了可访问的原型技术, 如添加剂制造和开源硬件和软件元素, 使更多的用户能够设计和构建自己的具有成本效益的连续培养系统形式直接在实验室里。所有这些都导致了一系列令人兴奋的自己动手 (DIY) 设备, 这些设备执行连续的培养功能, 如恒温器¹³、动肌¹⁴或益生^{菌 15}。不幸的是, 虽然成功地解决了它们所设计的特定 (利基) 问题, 但这些临时解决方案通常缺乏在吞吐量和实验设计复杂性方面进行扩展的能力。

这家公司的设计旨在创建一个单一的平台, 以满足不断增长的连续培养实验需求, 并匹配新兴基因组技术^的速度和规模 16 (图 1 a)。埃沃弗的设计实现了其他领域17中高度可扩展技术的共同原则, 包括标准化的足迹、模块化组件和开源设计原则。因此, 可以在不对系统进行重大修改的情况下设计新的利基应用解决方案。这家公司由高度模块化和开源的 wetware、硬件、电子和基于 web 的软件组成, 是第一个具有成本效益且易于重新配置的自动化连续培养系统, 可执行几乎任何类型的高通量增长实验。通过模块化和可编程的智能套筒, 它容纳了控制单个文化所需的所有传感器和执行器, 其独特的是实现了吞吐量和文化条件的单独控制。此外, 作为一个基于网络的平台, 埃沃弗与远程计算机实时交换数据和信息, 允许通过任意定义的控制同时监测数百种文化和自动化文化扰动算法。

在以前^{的工作 16}中, evolver 在数百小时的操作中进行了长期实验, 并在其培养从大肠杆菌和酿酒酵母到未驯化等各种生物的能力中表现出了强劲的性能。微生物。进行了一系列不同的生长选择实验, 在实验中, 以编程方式定义的多维选择梯度应用于一系列不同的文化条件, 由此产生的细胞健身景观量化。在这里, 目标是为 eVOLVER 用户提供如何使用系统进行设计的描述以及这些类型的实验。作为一个示例, 提出了在温度和渗透应力组成的二维环境梯度下, 对酿酒酵母的适宜性景观进行量化的方法。该协议指导用户通过编程方式配置此实验的 Ewolver 框架, 使用该软件为16个并行连续区域性中的每一个设置自定义的浊度和温度控制例程, 以及物理上,通过流体布局, 适当地路由不同盐浓度的介质。该协议应作为配置倾听的通用规范, 以便为不同的研究和学科执行各种自动化连续培养实验。

方案

1. 准备媒体、瓶和伊诺库鲁姆

请注意:此协议假定用户已经校准了 eVOLVER 系统, 并且正在使用之前工作¹⁶中描述的智能套筒配置。智能套筒易于重新设计或修改, 但对于替代配置, 音量和控制参数的设置详细信息可能会有所不同。

1. 实验前一天, 在30°c 的模拟物质培养基 (酵母 Pepone Dextrose) 中, 在设置为至少 300 R.P.M 的晃动孵化器中制备2 毫升夜间液体培养的酿酒酵母 by4741 参考菌株和变异菌株。
2. 将无菌 YPD 介质转移到装有管材的清洁高压灭菌瓶中。此外, 介质也可以直接在装有油管的瓶子中高压灭菌。
   请注意:瓶子与油管配合使用, 方法是在瓶盖上钻一个洞, 并通过它的连接器运行油管, 以确保其固定到位。请参阅材料表。
3. 在每个小瓶上加入搅拌杆, 并在装有流入和流出的小瓶盖上拧紧。通过目视检查确保所有组件清洁。
4. 将小瓶放在可高压灭菌的机架中, 用铝箔覆盖, 并在重力或真空循环上进行20分钟的灭菌步骤。

2. 设置实验

1. 在三个大型烧杯中, 制备500毫升的10% 漂白剂, 200 毫升的10% 漂白剂, 300 毫升的乙醇。
2. 使用 eVOLVER 设备上的开关, 打开 Ever 上的 5 V 电源, 等待 5秒, 然后打开 12 V 电源。
3. 如果从同一介质瓶中运行多个小瓶, 请将多个介质输入线与管道拆分器连接。定制的管材拆分器可以用 Luer 组件制造。
4. 将第一漂白剂烧杯中的介质输入线和第二漂白剂烧杯中的介质排流线淹没。将介质输入线的下游端放置在带有排流线的第二烧杯中。把废线放进垃圾车里。
5. 在大型空废物卡眼中加入1-2 升漂白剂, 对实验过程中产生的废物进行消毒。咨询安全协调员, 以确保废物的妥善处理。
6. 使用赢车上的触摸屏, 导航到设置部分, 并运行所有泵 20秒, 以填充流体线与10% 的漂白剂。在运行过程中, 通过目视检查确保所有线路都已灌装, 泵正常运行。让漂白剂在生产线上静坐至少30分钟进行消毒。
7. 再次运行泵使用触摸屏应用程序, 直到线路不再被淹没, 推动空气通过线路, 以获得尽可能多的漂白剂。
8. 将介质输入线放入乙醇烧杯中, 并按上述方式重复, 在生产线上灌满乙醇并冲洗空气。
   请注意:由于乙醇很快就会死亡, 因此没有必要等待 3 0分钟的消毒。
9. 使用 Luer 连接器将介质输入线连接到介质瓶, 并运行泵, 直到介质完全通过这些生产线, 冲洗出任何残留的乙醇。
10. 根据线条上的颜色编码, 将灭菌瓶部分插入 eVOLVER 智能套筒中, 并将线条连接到适当的位置。首先将输入线连接到短流入秸秆上, 然后将管道浪费在长的流出秸秆上。
    注意事项:检查线路是否松动或路由不正确是至关重要的。如果不这样做, 将导致溢出, 并可能损坏智能套筒。
11. 以10秒为增量运行所有泵, 以填充介质的小瓶。通过目视检查, 确保泵通过排流吸管有效去除介质, 防止溢出。如果流出物吸管似乎不能正常工作, 请检查流体线路连接和蠕动泵。根据需要更正或更换零件。
12. 将小瓶向下推, 直到完全被智能套筒包裹。
13. 使用交互式设置页上的 eVOLVER 触摸屏设置实验参数的初始条件。对于所有小瓶, 将温度设置为 30°c, 搅拌设置为10。这可以通过在触摸屏上拖动手指来选择所有小瓶, 从而一次完成所有小瓶。

3. 配置 eVOLVER 软件和编程算法文化例程

1. 在计算机上的 eVOLVER 仪表板中, 导航到实验管理器页。在实验导航面板或现有实验中选择基本实验作为起点, 然后单击 "克隆新"。
   请注意:通过将 GitHub 链接粘贴到将实验定义保存到实验管理器中的存储库, 可以使用其他组的实验。
2. 指定将在其上运行实验的实验名称和 eVOLVER 设备。通过修改页面上的这些字段, 确保已选择所需的校准设置。
3. 使用小瓶选择器和参数定义窗格设置实验条件。例如, 若要设置小瓶0-4 至30°c 的温度, 请在小瓶选择器中选择小瓶, 将参数定义设置为 30, 然后单击 "设置"。对 OD 重复此操作, 为每个小瓶设置上限和下限。
4. 实验参数定义完成后, 通过单击"保存"并单击"开始"运行来保存实验。

4. 实时启动实验和监控

1. 实验开始后, 导航到交互式仪表板中的实时数据面板。对于每个小瓶, 检查 OD 值是否保持在零, 并且通过浏览图表, 温度是否达到或达到编程水平。
2. 为了准备接种, 测量隔夜培养物的 OD, 计算所需的折叠稀释假设小瓶体积为25毫升, 并通过取样口计算接种到小瓶中的移液器体积。例如, 要达到所需的起始 od 约0.05 在培养小瓶从隔夜培养在 OD 2.0, 625μl 的细胞应添加到每个小瓶。
3. 检查仪表板上的图形, 以查看 OD 图形是否已相应更新。应在图表中看到增加到接近所需的起始 OD。
4. 通过浏览仪表板中的相应图形, 在整个实验过程中跟踪不同的数据类型 (如 OD、温度、增长率、世代和媒体消耗)。这些值可能会通知用户的实验决策 (例如计划时间点), 甚至可以在函数中用于执行自动反馈。
5. 要在实验中期更换介质瓶, 请在实验管理器面板中暂停实验, 以防止泵事件的发生。快速拧开空瓶中的介质线, 并将其连接到新瓶子。避免接触管材的两端, 以防止污染。在实验管理器中继续实验。

5. 从 Ever 瓶中取样酵母细胞

1. 制备环己酰亚胺溶液, 以抑制蛋白质合成, 并固定酵母细胞流式细胞仪分析。在15毫升锥形管中, 加入12毫升的 PBS 和12μl 的 20 Mgml 环己酰亚胺和涡液, 为5秒。
2. 使用多通道移液器, 在96孔圆形底板的每口井中加入100Μl。
3. 用铝箔包裹板材, 以阻挡光线, 并保持在 4°c, 直到需要。
4. 要进行取样, 使用延长的长度200μl 吸头, 通过小瓶盖上的采样端口进行移液器。
5. 移液器100μl 从小瓶进入固定板的井中, 通过上下移液混合2-3 倍, 然后在铝箔中恢复并将钢板恢复到4°c。

6. 实验分解和清理

1. 在大型烧杯中准备1升10% 漂白剂和两升500毫升 di 水溶液。
2. 通过在实验管理器面板中发送停止命令来停止实验。数据仍存储在启用云的数据库中, 以后仍可在仪表板的实时数据面板中查看, 或下载以进行脱机分析。
3. 从智能套筒中取出小瓶, 并将其放置在高压灭菌器机架中, 以避免在后续步骤中溢出。
4. 拧下介质瓶中的介质输入线, 并将其放入10% 漂白剂的烧杯中。从 eVOLVER 用户界面运行泵, 如在设置中消毒线路和小瓶。
5. 断开 DI 水中的小瓶和淹没线的连接。运行泵, 先用 DI 水冲洗系统中的所有漂白剂, 然后用空气冲洗所有漂白剂。
6. 先关闭 12 V 电源, 等待 5秒, 然后关闭 5 V 电源, 以关闭 epolver。
7. 将搅拌棒和瓶盖浸泡在10% 的漂白剂中, 然后用 DI 水冲洗。一定要冲洗流入和流出的秸秆的每个帽运行 di 水通过他们。如果在墙上形成了薄膜, 则使用试管刷擦洗小瓶。
8. 适当处理废物, 彻底冲洗废物容器。
   注意事项:废物容器中含有10% 漂白剂、灭菌细胞培养废物和微量乙醇的混合物。请咨询安全协调员, 以进行正确的处理和处置。

7. 利用流式细胞仪对分数种群进行量化适宜性分析

1. 使用配备适当荧光通道和探测器的流式细胞仪分析第5节收集的样本¹⁶。
2. 每个样本获取至少 10, 000个事件, 并使用正向和侧面散射数据为完整的单元格进行门。
3. 门基于适当的荧光通道 (如 GFP), 以确定每个群体的分数分布。
4. 在计算机上, 单击 "导出" 按钮, 将数据从 "实验管理器" 页保存到所需位置。
5. 从 Revover 数据文件中, 确定每个小瓶的每个时间点完成的世代数。在 Evover 代码中, 通过首先对每个稀释事件之间的 OD 数据进行分段来计算各代, 然后每个段与窗体的基本指数相匹配, 以生成 r, 增长率¹⁶。然后使用以下公式计算时间段内的代数:
   
6. 绘制流式细胞术数据中标记和未标记群体的对数比与采集样本时上述计算的生成数。根据下面的公式确定线性区域并拟合斜率。这个坡度通常被定义为^{竞技健身 18,19}。
   

结果

本文所述的协议用于构建不同温度和盐度二维应力梯度的酿酒酵母遗传变异的健身图。具体而言, 对于每个变种菌株, 我们使用 eVOLVER 对16种不同的荧光标记的参考菌株 (具有集成本构性Neongreen 记者的酿酒菌株 BY4741) 进行了成对竞争实验这些应力的组合 (图 1)。对于变种 , 选择了两个淘汰赛菌株 , 每个预测对其中一个应力条件轴敏感 : Prx1 , 据报道 , 它在高温^下存在健身缺陷 20 和pbs2 , 在高的适宜性缺陷盐浓度²¹。作为一种控制变体, 使用了未标记的野生型 BY4741 菌株, 其性能应与参考菌株相似。这三个72小时的比赛实验总共在48个小瓶中同时进行, 这些小瓶都是在一台计算机上运行的。

埃沃弗交互式仪表板用于导航在每个实验期间生成的大量数据 (图 2a)。图 2b显示了单个赢墙设备的所有16个小瓶上的代表性 od 跟踪。每个轨迹都显示了一个典型的锯齿模式, 从浊度控制算法, 利用 OD 上的反馈触发稀释和保持培养在一个狭窄的密度范围 (在这种情况下为 0.2-0.3)。对 OD 和温度数据进行连续测量, 流式传输到支持云的数据库, 并在 eVOLVER 交互式仪表板中实时更新。从连续流数据中, 可以在仪表板 (图 2C) 中计算和绘制高阶指标 (如增长率、累积生成), 甚至在不同的选择方案 (如病态劣势) 中用作反馈参数。

为了生成健身图, 我们通过结合流式细胞仪测量和 eVOLVER 生长数据来测量参考应变优于变异应变的速率。具体而言, 利用每个时间点样本的流式细胞仪数据, 将种群分数计算为变量应变与参考应变的对数比。对于每个培养和时间点, 在每个稀释期内, 从 eVOLVER 增长率数据中插值的世代数。将日志比率与世代绘制后, 开始出现不同条件之间的质量差异 (图 3 a)。为了计算适宜性, 坡度是通过每个图^18、19的线性部分进行拟合的, 生成一个定量的健身值 (包括符号和速率), 该值描述了变异菌株如何与参考应变竞争 (图 3B)。在本实验中, 负适应度值表明变异菌株被参考菌株所超越。从所有的健身计算构建热图允许可视化的二维健身景观, 揭示了不同菌株和条件之间在性能上的细微数量差异 (图 3C)。

从健身热图中, 我们可以看到, 每个变种菌株都表现出不同方式表现出的健身缺陷。Prx1主要对高温敏感 , 但盐胁迫似乎具有加性作用 , 增加了适宜性缺陷。相反 , Pbs2显示的健身缺陷主要是为了应对高盐浓度 , 沿温度轴的差异最小。这些结果突出了高分辨率选择实验的效用, 特别是在破译多种环境压力源的相互作用方面, 这些因素可能具有附加性、协同作用或表观效应。

最后, 需要注意的是, 在某些情况下, 特别是在严重的压力条件下, 健身计算可能会导致夸大或扭曲的结果。例如 , Pbs2在39°C m ncl 条件下相对于参考应变似乎显示了一个陡峭的正斜率 (图 3 a) 。这是由于这两种菌株的生长不良, 这反映在野生类型数据中, 并限制了这一特定指标在这种情况下的效用。不到的世代数导致 1) 时间点的分离不良, 干扰了斜率拟合, (2) 对滞后阶段产生的随机影响的敏感性。虽然我们在本研究中没有选择这样做, 但在实验期间由中小学生收集的实时增长数据本可以用来为延长实验的决定提供信息, 并在几乎没有努力的情况下收集这种情况的额外时间点。在后续实验中, 还可以调整起始比, 以便在饱和发生之前延长线性区域的长度。

图 1: 埃沃弗框架和实验设计概述.(A) everver 是一个自动化、连续的文化平台, 允许对文化条件进行多参数控制。该平台由用于控制培养条件的传感器和执行器的智能套筒、用于进出文化的流动介质和废物的蠕动泵阵列、用于手动与设备交互的触摸屏以及计算机组成。用于与来自平台的数据流式传输的云基础架构进行交互。(B) everover 可以通过多种方式进行配置: 物理配置、通过单元格和媒体输入, 以及通过调整控制智能套筒培养小瓶模块的算法以编程方式进行配置。这可用于对高分辨率的多维选择环境梯度进行编程, 其输出由在定义时间点物理收集的细胞和培养数据的实时流媒体组成。(C) 配置 eVOLVER, 以进行跨二维选择梯度的生长适应性实验, 由温度和渗透应力组成。在 Everver 培养瓶中播种的参考和变异酵母菌株的比例相等。一个浊度恒温器例程被编程, 以保持所有的培养在指数阶段在一个定义的 OD 窗口 (OD 0.2-0.3)。在智能套筒阵列中, 温度和介质条件各不相同, 形成两个独立的应力梯度。为预防细菌污染, 基础培养基由 YPD (2% 葡萄糖) + 100μgml 卡比西林 + 25μgml 氯霉素组成。介质成分通过将补充氯化钠添加到 0 M、0.6 M、0.8 M 或 1.0 M, 使其被编程为四个值之一: 30°c、35°c、37°C 或39°c。(D) 三个测试条件下的文化 od 和人口部分原始产出的例子。竞争实验保持了 72小时, 采样时间为 24小时, 随后每12小时进行一次采样, 直至实验结束。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 埃沃尔弗实时数据分析仪表板.(A) 通过基于云的软件将 ever 数据实时处理和流式传输到交互式仪表板。通过仪表板, 用户可以在连接的赢车上定义和启动自己的培养例程, 监控当前在所有赢取程序单元上运行的实验, 并根据需要在单个小瓶或小瓶集中手动更改实验条件。(B) 在整个实验期间测试的条件矩阵中, 每个小瓶的 od 痕迹。可以实时查看痕迹, 以确保实验按需运行, 并在实验后用于进一步分析。(C) 生长速度和细胞世代可以从飞行中的 od 痕迹来计算, 以跟踪实验的进展。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:健身表面的构建.(A) 细胞群分数自然日志 (变异菌株参考菌株) 绘制对细胞世代。颜色表示选择的温度, 而破折号则区分盐的浓度。(B) 为了量化变量与参考应变的相对适宜性, 从细胞种群分数代代相传的速度推导出适宜性指标。此指标是根据最小三点的细胞分数图的线性区域计算得出的。(C) 热图中显示了相关的健身指标, 以便在环境压力梯度上构建健身面。由于培养物经过的世代不足, 野生类型和Pbs2的右上角条件 (39°cce1.0 m ncl) 不包括在本分析中 (见代表性结果)。请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

生长选择是生物学中不可缺少的工具, 广泛用于生成和表征细胞群体之间的表型差异。虽然批量文化确实允许以有限的方式选择增长, 但连续的培养技术通过对选择的形式和动态进行精确的监管, 极大地扩大了这些实验的控制程度和可预测性可重复的, 定量结果²²。连续文化已被用于严格控制高多样性库^{20、23、24、25 的}选择, 并在实验和实验中实施复杂的自适应系统。定向进化^11,12,26,27。连续培养还可以在一系列定量控制的条件下精确地描述细胞, 以更好地了解复杂的遗传系统, 并优化工程生物生产菌株^9,14,28岁

然而, 连续培养没有普遍的协议, 因为选择性条件的微妙变化会导致生物结果^{4、29、30 的}剧烈变化。实验者必须能够在选择制度之间作出选择, 并相应地调整实验方案和设备。除了在控制参数之间提供选择外, 这样的系统还能在非常平行的实验中独立地同时管理几个参数, 而这些实验是破译复杂中相互作用的输入所必需的生物系统 (如呼吸系统)。赢沃解决了这一挑战, 使用户能够任意编程反馈控制之间的培养条件和流体功能, 以指定高度专业化的环境利基。

为了克服当前设置中的限制, 并扩展或更改控制参数, 可以轻松地重新设计智能套筒以添加新的传感器或执行器。此外, 减少小瓶数量将减少媒体支出, 这在持续文化中可能意义重大。虽然目前的设计允许测量和控制温度、培养、光感应、浊度和流体, 但其他参数必须通过从小瓶中取样进行外部测量。目前的工作包括纳入通过荧光素酶监测酶活性的能力, 并在 Evover 培养物中直接调节溶解氧和 pH 值。此外, 虽然没有在这项工作中演示, 但赢流复用可以与新型毫流控复用设备 16 接口, 这些器件借鉴了大规模集成的原理 (源自电子, 并被微流体所采用), 以便低成本, 可实现更复杂的流体处理 (例如多路复用流体输入, 生动到小瓶传输)。这些湿具模块可以完全在实验室中设计和制造, 允许用户通过在自动化流体例程中以编程方式驱动不同的阀门组合来输送流体。这使得用户能够克服传统上在连续培养中使用的刚性流体设计, 还可以通过更少的昂贵控制元件 (如蠕动泵) 将流体能力扩展到高吞吐量。最后, 我们希望加入一个自动采样平台, 该平台将利用这些毫流化体和 DIY 组件, 克服在采样培养会很麻烦的更长和更大的实验中手动交互的限制。

除了对平台进行物理修改外, 基于 web 的软件还允许用户编写、编辑和共享自定义的 Evover 脚本, 生成完全自动化的、支持反馈的区域性程序 (例如, turbidostat), 从而开启了新的自由度。用户可以通过编程方式扫描参数范围在相同的选择方案的细微变化或连接控制算法在新颖的组合, 以指定任何数量的复杂选择方案。此外, 能够轻松实时监测文化, 改变了实验的进行方式。通过实时监控, 用户可以 (1) 检查运行之间的一致性, 这是生物生产应用和高通量实验的一个关键功能, 2) 在实验期间进行干预, 以便在必要时对具有挑战性的菌株进行故障排除生长不良或生物膜形成, 或诊断用户错误 (如污染)。最后, 由于为每个区域性实时收集和解释多个数据流, Everver 会生成高密度的数据, 这可能有助于采用机器学习方法进行新的下游分析。

除了在健身表征、图书馆选择和实验室进化方面的明确用途外, 我们还认为在集成流体的高压力中实施一些相关领域已经成熟。利用微生物群样本进行的 efolver 实验可以检测受控环境^{中的群落稳定性 31,}32, 利用文化组学技术³³探索微生物区系组合物, 或动态混合物种, 以询问殖民或入侵的生态动态^34,35。许多连续定向进化生物分子的方法可以很容易地在设备上实现,^{以及26, 36,}37, 大大提高了这些系统的可访问性和吞吐量。在动态、高吞吐量的自然中优化培养基成分、温度和应变等生长条件的能力有助于工业生物制造应用的优化工作⁹。我们进一步设想将 Efolver 与其他分析技术 (如显微镜和流式细胞术) 以闭环方式垂直集成, 为单个细胞和人群的细胞培养物的生长和分析提供了一个完全自动化的系统水平。此外, 通过对智能套筒进行一些硬件修改 (如密封容器和控制气体含量), Everover 可能会进行调整, 以支持更广泛的细胞类型 (如悬浮哺乳动物细胞) 的生长。将整个框架放入厌氧室进行厌氧细胞培养也是可行的。展望未来, 我们的目标是将我们的软件框架构建为一个集中式的云基础架构, 并相信这将使用户能够轻松地远程配置、分析和共享他们的数据, 而无需实际出现在实验室中。云基础架构作为数据策展人, 也适合于跨实验进行大规模的元分析。我们预计, 埃沃弗和这些未来的进展将通过促进连续文化中的自动化和创新, 极大地扩大可能的增长选择实验的范围。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5加仑塑料袋带盖	Midwest酿造和酿酒用品	45-56Y8-E2FR	用于废物收集
a-D（+）-葡萄糖	化学-Impex	00805	用于YPD培养基
Attune NxT自动进样器	Thermo Fisher		允许流式细胞仪从96孔板运行样品
Attune NxT流式细胞仪	Thermo Fisher		用于通过单细胞荧光测定群体组分
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118-07-0	用于 YPD 培养基
羧青霉素	Fisher Scientific	BP2648250	用于 YPD 培养基
耐化学腐蚀的倒钩管接头 三通接头，用于 1/8" 管内径，250 度;F 最高温度	McMaster- Carr	5121K731	用于培养基输入分支
氯霉素	Fisher Scientific	BP904-100	用于 YPD 培养基
CLOROX 杀菌漂白剂 8.25	Fisher Scientific	50371500	用于流体管路的灭菌
定制的 eVOLVER 样品瓶盖	FynchBio		盖子具有用于采样和流体输入/输出
的端口放线菌	Fisher Scientific	ICN10018301	用于流式细胞术采样板
乙醇、无水（组织学）	Fisher Scientific	A405P-4	用于流体管路的灭菌
eVOLVER 装置	FynchBio
Fisherbrand 加长型吸头（从机架上提起;1 至 200 ul）	Fisher Scientific	02-681-420	用于样品瓶采样
Fisherbrand 八边形旋转杆磁力搅拌棒	Fisher Scientific	14-513-57	直径：4.5 毫米，长度，12 毫米
Fisherbrand 可重复使用的玻璃培养基瓶，带盖	Fisher Scientific	FB8002000	必须配备管道
高温硅橡胶管 半透明白色，硬度计 70A，1/8" 内径，1/4" 外径	McMaster- Carr	51135K73	用于培养基瓶
Mac迷你	苹果		用于运行实验/收集数据
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Fisher Scientific	BP243820	用于流式细胞术采样板
移液器	Eppendorf
塑料快速转管接头， 塞子， 用于 1/16" 倒钩管内径， 聚丙烯	McMaster- Carr	51525K141	用于培养基瓶
塑料快速转动管接头，塞子，用于 5/32" 倒钩管内径，聚丙烯	McMaster- Carr	51525K144	用于媒体瓶
快速转动管接头，插座，用于 1/16" 倒钩管内径，聚丙烯	McMaster- Carr	51525K291	用于媒体瓶
塑料快速转动管接头，插座，用于 5/32" 倒钩管内径，聚丙烯	McMaster- Carr	51525K294	用于媒体瓶子
螺口盖，开口，带 PTFE 表面硅胶隔垫，LAB-PAC，SEPTUM。螺纹尺寸：24-400，绿色	Chemglass	CG-4910-04	培养瓶
氯化钠 （NaCl）	Fsher Scientific	S271-3	用于 YPD 培养基
SpectraMax M5 多功能微孔板读板仪	分子设备		用于测量过夜细胞培养物的 OD600
仅样品瓶，样品，40 mL，透明，28 mm x95 mm，GPI 24-400	Chemglass	CG-4902-08	培养瓶
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-500	用于 YPD 培养基