方法文章

一种用于持久无细胞基因表达的多层微流控平台

DOI：

10.3791/59655

⸱

2019年10月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Computational Biology Group, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Molecules and Materials, Radboud University, 3Institute of Bioengineering, School of Engineering École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的多层微流控装置的制备过程，该装置可实现体外转录与翻译（IVTT）反应的长期进行。此外，还全面概述了实现并维持这些反应长期自动化的所需硬件与软件。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

随着研究人员致力于开发更大、更复杂的合成基因调控回路，基于细胞的合成生物学的局限性日益显现。在体内对合成基因调控网络进行分析耗时较长，且存在环境控制不足的问题，外源性合成组分与宿主过程相互作用可能导致非预期行为。为克服这些问题，无细胞表征新回路的方法正变得越来越普遍。体外转录与翻译（IVTT）混合体系可实现对实验环境的调控，并能针对每个独特系统进行优化。本文所述方案详细介绍了可用于长期维持IVTT反应的多层微流控装置的制备方法。与反应物随时间消耗、（副）产物不断积累的批处理反应不同，微流控装置的使用可实现反应资源的持续补充以及反应产物的及时清除。通过这种方式，可模拟细胞环境，维持非平衡状态，从而在较长时间内研究基因回路的动态行为。为了充分挖掘多层微流控装置的潜力，已将硬件与软件集成，以实现IVTT反应的自动化。将IVTT反应与本文介绍的微流控平台相结合，可全面分析复杂网络行为，进一步加深我们对调控细胞过程机制的理解。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞能够利用复杂的动态调控网络来感知并响应其环境1,2。合成生物学领域利用我们对这些网络中天然存在组分的认知，设计可扩展细胞功能的生物系统3,4。相反，通过设计现有回路的简化型合成类似物，或通过正向工程构建具有天然生物学行为的生物系统，也有助于加深我们对调控生命活动的天然网络的理解。这类生物系统的从头设计采用自下而上的策略，以明确定义的生物元件为基础，理性构建新型基因回路或信号通路5,6。将网络的理性设计与具有生物学意义的系统设计相结合，可实现对不同抽象层次的生物调控系统进行深入表征与研究7。

Elowitz 和 Leibler8 以及 Gardner 等人9 的开创性工作首次成功地将合成基因网络引入细胞宿主。在随后的十年中，尽管将合成回路引入细胞仍存在若干局限性7,10,11,12，众多研究人员仍在此前成果的基础上持续推进。理想情况下，合成回路应以模块化的方式引入细胞宿主。然而，细胞环境的复杂性使得这一目标极具挑战性，许多元件和网络的功能高度依赖于具体生物学背景12,13,14。因此，合成网络常常与宿主内源组分发生非预期的相互作用，从而影响合成回路的功能。同样，外源网络的元件也可能抑制宿主的正常生理过程，与宿主竞争共享资源，并影响细胞的生长动力学15,16,17。因此，为了在活体环境中合理设计并预测合成网络的行为，必须建立一个涵盖宿主与回路特异性动态过程的综合模型18。

一种可用于细胞宿主之外的合成网络表征的可行替代方案，是体外转录与翻译（IVTT）技术的应用。作为合成网络的试验平台，反应在包含实现基因表达所需全部组分的溶液中进行19,20,21。通过这种方式，可构建一个具有生物学相关性但属人工的环境，用于测试合成网络22,23,24,25,26,27,28。使用IVTT溶液的一个主要优势在于能够在用户指定的条件下进行反应，研究人员可精确调控每个反应的组分2。此外，无细胞方法能够实现对合成网络的高通量测试，因为它免除了耗时的细胞克隆步骤。因此，连续的设计—构建—测试循环周期显著缩短29,30,31,32。通过采用无细胞克隆技术（如Gibson组装）快速构建新型网络，以及使用线性DNA模板构建网络（与体内测试所需的质粒不同，线性模板可通过聚合酶链式反应（PCR）扩增），可进一步加快设计周期33,34。

批量反应是进行体外转录翻译（IVTT）反应的最简单方法，仅需使用一个反应容器，将所有反应组分混合其中35。此类反应适用于蛋白质表达和基本回路测试，但在研究网络长期动态行为时则显得不足。在批量反应过程中，试剂会逐渐耗尽或发生降解，导致转录和翻译速率持续下降。此外，随着反应进行，副产物不断积累，可能干扰甚至完全抑制网络的正常功能。最终，批量反应器的使用限制了可观测的动态行为，尤其难以实现负调控5,36。

IVTT系统的多功能性支持多种替代方法来实现长时间的IVTT反应，这些方法包括连续流动、基于液滴的方法以及更简单的透析方法2,30,37,38,39,40。微流控装置的应用使用户能够更精确地控制反应过程，同时提高通量并降低成本35,41,42，每种具体方法都有其独特优势。连续流动法可轻松优化以提高表达产量，但难以有效去除特定反应产物，使得对动态行为的研究变得复杂39。尽管基于液滴的微流控系统可用于新型网络的高通量筛选，但由于难以向反应体系持续补充新鲜试剂，这些液滴实际上类似于小体积的批次反应43。基于透析的反应器允许引入新鲜试剂并去除部分反应产物，但RNA分子和较大的蛋白质会在反应器内积累，因其分子过大而无法通过膜孔扩散。此外，维持长时间反应需要消耗大量试剂30,44。2013年，Maerkl等人提出了一种专为长时间IVTT反应设计的多层微流控装置36,45。多层微流控装置的使用可直接控制流体流动，实现流路的重定向以及在装置特定区域对流体的隔离46,47。这些被隔离的区域可作为独立的纳升级反应腔室，用于进行IVTT反应。在单次IVTT反应过程中，通过周期性地向反应器注入新鲜试剂，以补充IVTT组分和DNA模板；同时，等体积的旧反应液被排出，从而清除反应产物。通过这种方式，维持一个非平衡环境，使基础转录和翻译速率保持在稳态，延长IVTT反应的持续时间，并促进丰富的动态行为发生。采用该方法，研究人员能够研究特定电路中各个过程的动力学速率，有助于新型基因网络的正向设计。例如，Niederholtmeyer等人应用此方法对遗传环形振荡器的多个元件进行了表征，并确定了其动力学速率36。在后续研究中，Yelleswarapu等人表明，在批次条件下测定的σ因子28（σ28）的动力学速率不足以描述基于σ28的振荡器的行为，而加入基于流动的数据后显著改善了对网络行为的模型预测22。

本文的目标是提供一种用于制备可进行长期体外转录翻译（IVTT）反应的多层微流控装置的完整方案。此外，本文还将介绍执行长时间IVTT反应所需的所有硬件和软件。微流控装置的驱动——即对其内部流体流动的控制——通过一系列气动阀实现，这些气动阀经由管路直接连接至微流控装置。而气动阀则通过一个自行设计的虚拟控制界面进行调控。微流控装置内的流体流动由商业化的压力调节系统提供的持续压力驱动。IVTT反应通常在29 °C至37 °C之间进行，反应过程中使用显微镜培养箱来调控温度。然而，IVTT混合物在高于4 °C条件下储存时，其活性会逐渐下降。因此，本文将详细阐述所采用的片外冷却系统，该系统用于在将IVTT混合物注入微流控装置前对其进行冷却。总之，本文全面概述了利用微流控流动反应器成功开展长时间IVTT反应所需的操作流程，使其他研究人员能够相对容易地复制该技术。

方案

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1. 晶圆制备

注意：本实验方案专用于本研究中所使用的 40 XT 正性光刻胶和 SU8 3050 负性光刻胶。虽然可使用其他类型的光刻胶，但具体的旋涂速度、烘烤温度和烘烤时间将有所不同。Niederholtmeyer 等人36 提供的微流控装置设计可在材料表中找到链接。

  1. 放置两片洁净的硅晶圆（直径100 mm， <1-0-0> 将晶圆（取向：特定方向，厚度：525 µm）放入预热至 250 °C 的烘箱中，脱水过夜（约 16 h）。
    注意：也可以使用 HMDS 蒸汽沉积对晶圆进行预处理；但如果晶圆已充分脱水，则此步骤并非必需。
  2. 从烘箱中取出一片硅片，待其冷却至室温后，再进行旋涂。将 3–4 mL 的 40 XT 光刻胶滴加到硅片中心。
  3. 为获得25 μm的特征高度，请执行以下旋涂程序：以500 rpm（110 rpm/s）旋转20秒，将转速升至3100 rpm（300 rpm/s）并保持30秒，然后以200 rpm/s的减速度将晶圆减速至0 rpm。使用超细纤维布小心去除旋涂过程中可能产生的边缘堆积物。
  4. 使用两个分别设定为 70 °C 和 120 °C 的加热板，按以下方式软烘烤：将晶圆置于 70 °C 加热板上静置 30 秒；然后将晶圆转移至 120 °C 加热板，静置 3.5 分钟，再将晶圆返回 70 °C 加热板继续静置 30 秒。从加热板上取下晶圆，并避免突然的温度冲击，使其冷却至室温。
  5. 将流层光掩模（乳剂面朝下）放置在光刻胶膜上，使用紫外灯对晶圆进行曝光，直至总曝光量达到 200 mJ/cm2 实现。
  6. 使用两块加热板（70 °C 和 105 °C）进行曝光后烘烤，步骤如下：先将晶圆置于 70 °C 加热板上静置 20 秒，随后转移至 105 °C 加热板上保持 40 秒。最后将晶圆返回 70 °C 加热板继续烘烤 20 秒，完成曝光后烘烤过程。
  7. 将晶圆放置在一层微纤维织物上，冷却至室温。将晶圆转移至盛有726 MIF光刻胶显影液的培养皿中进行显影，以启动显影过程。若在台式摇床中进行显影，并将整个晶圆浸没于显影液中，可加快显影速度。
  8. 用去离子水冲洗晶圆，并使用体视显微镜检查晶圆表面是否存在光刻胶残留。若观察到光刻胶残留，则将晶圆重新放入显影液中。
  9. 将晶圆置于设定为 110 °C 的热板上加热 25 分钟，使正性光刻胶重新流动。该过程将形成圆角形貌，并退火在制备过程中可能出现的任何裂纹。随后按照步骤 1.17 所述对晶圆进行硅烷化处理。
  10. 从烘箱中取出第二片硅片，待其冷却至室温后，再进行旋涂。将5 mL SU8 3050光刻胶滴加至硅片中心。
  11. 为获得30 μm的特征高度，请执行以下旋涂程序：以500 rpm（110 rpm/s）旋转20秒，将转速升至4,000 rpm（330 rpm/s）并保持42秒，然后以200 rpm/s的减速度将晶圆减速至0 rpm。使用无尘布小心去除旋涂过程中可能产生的边缘堆积物。
  12. 使用两个独立的加热板（65 °C 和 95 °C）进行软烘，具体步骤如下：将晶圆置于 65 °C 加热板上静置 30 秒，随后转移至 95 °C 加热板上静置 14 分钟，再将晶圆返回 65 °C 加热板上继续静置 30 秒。从加热板上取下晶圆，使其冷却至室温。
  13. 在曝光前测量紫外灯的强度，并据此确定达到260 mJ/cm总曝光剂量所需的曝光时间2将光掩模（乳剂面朝下）放置在光刻胶膜上，并将晶圆置于紫外光源下方。使用紫外灯照射晶圆，直至总曝光量达到260 mJ/cm²。2 实现。
  14. 使用两块加热板（65 °C 和 95 °C）进行曝光后烘烤，步骤如下：先将晶圆置于 65 °C 加热板上静置 60 秒，随后转移至 95 °C 加热板上保持 4.5 分钟。最后将晶圆返回 65 °C 加热板继续烘烤 30 秒，完成曝光后烘烤过程。
  15. 将晶圆放置在一层微纤维组织上，冷却至室温。将晶圆转移至盛有 mrDev-600 光刻显影液的培养皿中进行显影，以启动显影过程。若在台式摇床中进行显影，并将整个晶圆完全浸入显影液中，可加快显影速度。
  16. 用异丙醇冲洗晶圆，并使用体视显微镜检查晶圆表面是否存在光刻胶残留。若观察到光刻胶残留，则将晶圆重新放入显影液中继续显影。显影完全后，将晶圆置于150 °C的热板上烘烤1小时，对光刻胶进行坚膜处理。
  17. 对两片晶圆进行硅烷化处理，以防止在软光刻过程中聚二甲基硅氧烷（PDMS）发生粘附。进行硅烷化时，用移液器将2–3滴硅烷试剂（每片晶圆）加入一个小玻璃小瓶中。将该小瓶与晶圆一同放入干燥器内，抽真空5–10分钟。随后密封干燥器，使晶圆在真空条件下静置12–16小时。
    注意：硅烷具有毒性，不可吸入。操作硅烷时应在通风橱中进行，并佩戴腈类手套。包括在对干燥器抽真空时，应将真空泵置于通风橱内。
  18. 从干燥器中释放真空，取出硅烷化晶片。用水冲洗，并用氮气流吹干。2 干燥晶圆。此时，晶圆可存放在储存环境中，直至需要时取出使用。

2. 微流控装置的制备

注意：用于制备基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的多层微流控装置的软光刻工艺可分为三个独立步骤：1）流体层和控制层的PDMS制备，2）两层PDMS的对准与键合，3）装置的最终完成。

  1. PDMS 制备
    1. 在塑料烧杯中将PDMS基液与固化剂混合，并用搅拌棒搅拌至完全均匀，制备两种PDMS预聚物溶液。控制层需使用20 g基液和1 g固化剂（20:1比例），流体层需使用40 g基液和8 g固化剂（5:1比例）。将配制好的溶液置于真空干燥器中脱气。
    2. 将流道层硅片放入培养皿中，并将按5:1比例混合的PDMS溶液倒入硅片上。对PDMS抽真空处理30分钟，以去除气泡。
    3. 将控制层晶圆（使用负性光刻胶 SU8 3050 制备）以 20:1 比例的 PDMS 进行旋涂。在晶圆中心加入 5–10 mL PDMS，执行以下旋涂程序（剩余 PDMS 保留以备后续使用）：以 500 rpm 转速旋转 15 秒（加速度 100 rpm/s），随后将转速提升至 1450 rpm（加速度 300 rpm/s）并持续 45 秒，最后以 200 rpm/s 的减速度将晶圆减速至 0 rpm。
    4. 为确保PDMS薄膜厚度均匀，将涂有PDMS的晶圆置于水平表面，并放入密闭的培养皿中（以避免灰尘污染）。静置30分钟。
    5. 从干燥器中取出流体层，将流体层和控制层一同放入烘箱（80 °C）中。在80 °C下固化28–30分钟，待PDMS变得足以操作但仍有轻微黏性时取出。立即进行对准操作。
  2. 对齐与键合
    1. 使用手术刀从流动层硅片上的聚二甲基硅氧烷（PDMS）中取出四个装置。将PDMS层从硅片上取下后，立即用透明胶带覆盖其结构面，以防止灰尘颗粒污染。
    2. 通过目视粗略对齐流体层模块与控制层，将器件的功能面与控制层PDMS接触。随后，在立体显微镜下观察并辅助调整每个流体层模块的精确位置，使流体层的通道与控制层的通道对齐。
    3. 按压以去除两层PDMS之间的气泡。将之前保留的剩余20:1比例PDMS倒在已对齐的流体层模块周围。在每个装置上放置100 g砝码，以确保键合过程中充分接触。
    4. 将对齐的装置（包括配重）放回80 °C的烘箱中，使其键合至少1.5小时，但不超过6小时。
  3. 完成装置
    1. 从烤箱中取出晶圆，从控制层晶圆上分离出各个独立的器件，并用透明胶带覆盖每个器件的特征面。
    2. 逐次为每个装置的9个流体层入口、24个控制层通道入口以及单个流体层出口各打一个孔。打孔时，将装置带有微结构的一面朝上，并利用摄像头确保孔位于微结构边界的范围内。
    3. 对于每个装置，使用异丙醇和丙酮清洁一张显微镜载玻片，并在氮气流下干燥载玻片2随后，将显微镜载玻片置于设定为150 °C的加热板上加热15分钟。
    4. 使用氧气等离子体灰化法将PDMS装置与玻片键合，灰化功率设为50 W，持续45秒。灰化时确保装置的结构面朝上。完成后，将装置的结构面朝下放置于玻片上，并施加压力以排除表面间滞留的气体。
    5. 将键合好的器件置于设定为 110 °C 的加热板上加热 1 小时。可在器件上方放置重物以增强器件的粘附性。

3. 硬件设置

注意：为了实现对微流控芯片的控制，需要安装并连接多种硬件设备。所需硬件分为三个不同类别：1）用于控制通道的气动控制系统，2）用于控制装置内反应试剂流动的气动压力调节器，3）在将体外转录翻译（IVTT）反应溶液注入微流控装置前对其进行冷却的冷却系统。图1展示了硬件配置的总体示意图。需要说明的是，此处提供的方案力求尽可能通用，但在本研究中仍会提及某些特定设备。所有硬件均可由具备相同功能的替代设备替换。在此类情况下，本文方案可用于概述系统搭建所需的一般步骤以及各组件的功能要求。Brower 等人48和 White 与 Streets49已提出了其他可行的硬件配置方案。

  1. 气动控制系统（见图2）
    1. 根据制造商的协议，在现场总线控制器与用户工作站之间建立TCP连接。使用控制软件（作为补充文件提供）编写通过TCP连接发送至控制器的MODBUS指令，以驱动电磁阀。
    2. 使用八个4通道数字输出模块扩展现场总线控制器，每个使用的电磁阀对应一个模块。每个电磁阀控制一个连接针。将正极导线连接至数字输出模块上的四个正极输出端口之一，同时将负极导线连接至数字输出模块的接地端口之一。
      注：为确保系统正常工作，电磁阀应系统化连接，即第一个电磁阀连接至第一个输出端口，第二个电磁阀连接至第二个输出端口，依此类推。在本系统中，使用了两个阀阵列，分别包含8个和22个电磁阀。输出端口1-8连接至8阀阵列，输出端口9-30连接至22阀阵列。
    3. 使用1/4”管路将两个阀阵列连接至压缩空气源。使用压力调节器将22阀阵列的压力设定为3 bar，8阀阵列的压力设定为1 bar。
  2. 流体压力调节（见图3）
    注：为使流体流经微流控装置的流体层，采用一种市售的4端口压力调节器。各端口的输出压力通过压力控制器配套软件进行调节。使用提供的USB连接线将压力调节器连接至计算机。
    1. 将压力调节器连接至压缩空气源，确保供气压力不超过调节器允许的最大压力。
    2. 将每个压力调节器的四个雌性鲁尔锁输出端口分别连接一个雄性鲁尔转3/32”卡套接头。将一段软管（外径：3 mm，内径：1 mm，长度：10 cm）连接至卡套接头。
    3. 在软管的另一端连接另一个雄性鲁尔转3/32”卡套接头，并将其连接至流体储液池的连接端口。
    4. 使用配套软件设定流量调节器各出口的所需压力，使储液池中的试剂在压力作用下流入微流控装置。储液池与微流控装置的连接将在第4.2节中详细说明。
  3. 芯片外冷却系统（见图4）
    1. 使用PVC管路（外径：10 mm，内径：6 mm）通过压缩接头将水冷系统连接至冷板水冷块。向水冷系统的液体储液池中加入冷却液，并轻轻倾斜设备以排出滞留空气，持续添加冷却液以确保储液池保持充满。当系统内所有气体排尽后，将储液池填充至其最大容积的约90-95%。
    2. 将PTFE管路（外径：0.042”，内径：0.022”）缠绕在帕尔贴元件的冷面上，并用胶带固定。确保PTFE管路的一端连接至流体层压力控制系统中的储液池（如第4.3节所述）。PTFE管路的另一端从帕尔贴表面伸出不超过1 cm。将一段5–10 cm长的PEEK管路（外径：0.794 mm，内径：0.127 mm）插入PTFE管路的伸出端。管路的填充及与微流控装置的连接将在第4.3节中进一步说明。
    3. 将帕尔贴元件的热面放置在水冷块的冷板上，并在两个接触面之间涂抹足够的导热硅脂。确保管路、帕尔贴元件和冷却块始终彼此直接接触。
    4. 将帕尔贴元件通过串行总线连接器连接至温度控制器，以便调节供给帕尔贴元件的电压。将热敏电阻牢固地放置在帕尔贴元件表面，并将其输出端连接至温度控制器。开启水冷机后，调节供给帕尔贴元件的电压，直至温度稳定在4 °C。
      注：在此设置中，帕尔贴元件的温度通过手动调节供电电压进行控制，而热敏电阻仅用于监测温度。

4. 实验准备

注意：在开始实验之前，必须对微流控装置进行准备，并将反应试剂插入正确的管路中，以便注入装置。本节将讨论以下内容：1）控制通道管路与装置的连接，2）未冷却进样试剂与装置的连接，以及3）冷却进样试剂与装置的连接。

  1. 连接控制通道管路
    1. 针对微流控装置的每个控制通道，截取一段管路（外径：0.06”，内径：0.02”）。在一端插入23 G、1/2”鲁尔接头针脚，在另一端插入不锈钢连接针（外径：0.65 mm，内径：0.35 mm，长度：8 mm）。
    2. 将鲁尔接头连接至公鲁尔转3/32”尼龙卡套接头。将该接头的卡套端插入一段聚氨酯管路（外径：4 mm，内径：2.5 mm）。将此聚氨酯管路直接插入电磁阀之一。
    3. 将一个23 G、1/2”鲁尔接头连接至注射器，并插入一段短管（3–4 cm）（外径：0.06”，内径：0.02”）。将该管路的开口端置于超纯水储液池中，并用超纯水填充注射器。
    4. 如图5所示，对微流控装置的每个控制通道进行编号。对于每个通道（不包括1至3号控制通道，这些通道不注水），找到对应的管路（已连接至电磁阀），并将金属针插入连接在注射器上的管路开口端。向控制通道管路中注入水，直至填充至管路长度的一半。
    5. 将管路从注射器上断开，并将不锈钢连接针插入微流控装置对应的孔中。对所有控制通道重复此操作。
    6. 使用控制界面打开所有电磁阀。这将使控制通道管路内的液体加压，推动液体进入微流控装置，并关闭装置内所有基于膜的阀门。装置中膜处于开启和关闭状态的示例如图6所示。
  2. 将未冷却试剂连接至装置
    1. 针对每种未冷却试剂，截取一段管路（外径：0.06”，内径：0.02”），用于连接储液池出口与微流控装置的入口。
    2. 取管路的一端插入储液池，确保管路到达储液池底部。应拧紧储液池的管路出口，以实现气密性密封。将不锈钢连接针（外径：0.65 mm，内径：0.35 mm，长度：8 mm）插入管路的开口端。
    3. 将一个23 G、1/2”鲁尔接头连接至小型（1 mL）注射器末端。在鲁尔接头上连接一段短管（外径：0.06”，内径：0.02”）。将管路末端置于所需试剂溶液中，用该试剂填充注射器。
    4. 将不锈钢连接针插入与注射器相连的聚氨酯管路中，并用试剂填充管路。当使用小反应体积时，试剂不会进入储液池，此时管路本身即作为储液池。断开注射器，并将连接针插入微流控装置的某一流动层入口孔中。
    5. 使用压力调节软件对每个储液池施加压力，以推动试剂进入微流控装置。
  3. 将冷却流体连接至微流控装置
    1. 确保水冷机和帕尔贴元件已开启，并将帕尔贴表面温度设定为4 °C。将冷却装置尽可能靠近微流控装置安装，以最小化帕尔贴与装置入口之间的未冷却体积。
    2. 使用不锈钢连接针（外径：0.65 mm，内径：0.35 mm，长度：8 mm）将PTFE管路的开口端与连接至某一液体储液池的管路相连（如第4.2节所述）。
    3. 将小型注射器（1 mL）连接至鲁尔接头（23 G，1/2”），并在末端连接一段短管（外径：0.06”，内径：0.02”）。用待冷却试剂（此处为IVTT反应溶液）填充注射器。
    4. 通过连接管路将PEEK管路连接至注射器，并对注射器施加持续压力，使试剂流经PEEK管路并进入PTFE管路。将PEEK管路从注射器上断开，并直接插入微流控装置的某一流动通道入口。当通过压力调节软件施加压力时，冷却后的试剂将被推入微流控装置。

5. 实验

注意：在进行实验之前，应完成第3和第4节方案中详述的所有硬件和管路连接，并将所有试剂连接至设备。实验流程可分为四个独立部分：1）微流控装置的加载，2）显微镜的准备，3）设备的校准，以及4）实验的实施。本研究中使用的自定义虚拟控制界面（见图7）已作为补充资源通过材料清单提供。

  1. 加载微流控装置
    1. 将微流控装置连同所有控制层和流体层管路一起放置于显微镜载物台上，并关闭培养箱的所有开口。将培养箱的环境温度设置为 29 °C。在实验开始前，确保冷却系统已开启并设定为 4 °C。
    2. 确保所有流体通道和控制通道均处于加压状态。将控制通道1-3的压力设为1 bar，控制通道9-29的压力设为3 bar。通过压力调节软件对流体储液池施加20至100 mbar的压力，以驱动试剂流动。
    3. 使用其中一种试剂去除微流控装置中的空气。关闭装置的出口（加压控制通道29），同时对控制通道1-3和15-28进行减压。然后选择性地对多路复用器的控制通道减压，使选定的试剂流入装置。使用显微镜监测空气的去除过程。
      注意：如果试剂无法正常加载到装置中，或气泡无法被有效去除，可将压力增加至最高350 mbar。
    4. 确保所有试剂流动顺畅，避免引入空气——使用 冲洗 通过在控制软件中使用该功能，可通过先加载荧光染料并监测其被各试剂置换的情况，从而简化对流体流动的监测。
  2. 准备显微镜
    1. 使用显微镜在微流控装置内定位任意感兴趣的位点（每个反应器内定位一个位点即可），并记录其坐标。这些位点将在校准和实验过程中进行成像。
      注意：在控制软件包含的校准和实验流程中，显微镜会被指令定期在先前存储的坐标位置采集图像。为实现此功能，控制软件会与显微镜软件通信，通知其记录新图像。此类通信方式因显微镜系统的配置而异，因此该功能已在提供的软件界面中进行了相应调整。随附一个虚拟可执行文件，终端用户可根据自身显微镜系统的兼容性对其进行修改。
  3. 校准微流控装置
    1. 通过执行软件包中提供的校准程序，确定在单次流入步骤期间（由15-17号蠕动驱动控制通道按顺序执行6个MODBUS指令所构成的泵序列控制）每个反应器排出的流体体积。
    2. 在控制软件中设置以下数据字段： 洗脱缓冲液通道, 荧光团通道，稀释循环次数 （默认为10个稀释度） 流入步骤数 （默认为 15 个步骤）， 混合循环次数 （默认为 4 个循环），以及 混合周期之间的时间 （默认为 0 秒）。通过按下启动校准 进行校准实验。
      注意：校准过程中，所有反应器均填充荧光染料并记录图像。随后进行一系列稀释操作，根据设定的流入步数将洗脱液定量加入反应器中，从而置换荧光染料。充分混合后，采集新的图像。此过程按设定的步数重复进行 稀释循环次数.
    3. 校准完成后，按照控制软件提示的步骤，完成校准实验的分析。
      注意：该分析将为用户提供 刷新 比率 根据每个反应器中记录的荧光减少情况，针对每个反应器进行 稀释 循环该数值表示由设定值所置换的反应器体积比例。 数量 的 流入 步骤该数值将在实验中用于确定置换特定反应器体积所需的流入步数。
  4. 进行实验
    1. 在虚拟控制界面中为所需实验设置相应的参数值。关键的是 刷新 组分 [%] 即每个实验周期内置换的反应器体积，应设定在15%至40%之间。
      注意：具体的实验方案将决定在启动实验前应设置控制界面中的哪些参数。对于新型实验，需进行少量编码以调整控制界面。
    2. 通过按下启动实验方案 进行实验 控制界面中的按钮。
      注意：该软件未经修改时，将启动简单的蛋白质表达。反应器1和8用作对照，反应器2-7则进行相同的实验。其中，反应器体积的75%为IVTT溶液，25%为超纯水或2.5 nM线性DNA溶液。每15分钟进行一次稀释，每次置换反应器体积的30%。每次稀释周期结束时记录图像。

6. 数据分析

注意：已提供用于图像分析的脚本（参见补充文件或该 材料表），利用 ‘bfopen’ 分析软件包，该软件包是审阅‘.nd2’ 文件（由我们的显微镜系统提供）。

  1. 运行分析脚本“calibrationScript.m”，当系统提示时，选择所需的“.nd2”文件。将显示单个反应器图像，用于确定正确的图像强度。使用滑块优化图像强度，使微流控通道的边缘清晰可见。
  2. 将显示反应器的图像。在此图像中，选择反应器通道内部的一个区域，用于测定其荧光强度。
    注意：每个反应器在每张记录图像中的荧光强度将被测定，结果将以简单图表形式显示，便于直观查看结果。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了验证多层微流控平台在体外转录翻译（IVTT）实验中的有效性，采用所述装置表达 deGFP 蛋白。实验使用一种 commercially available30 的 IVTT 反应体系——包含所有必需的转录和翻译组分——并添加了反应底物和 DNA 模板。实验在 29 °C 下进行，该温度被证实为 IVTT 蛋白表达的最适温度。

该微流控装置具有九个独特的入口，其中本实验使用了四个。第一个入口含有 commercially obtained IVTT 反应混合物。IVTT 反应混合物包含了成功表达蛋白质所需的所有组分，但在加载到微流控装置之前，向该反应混合物中添加了纯化的 GamS 蛋白，使其终浓度为 1.3 µM。添加 GamS 蛋白的作用是在实验过程中最小化线性 DNA 分子的降解。关键的是，IVTT 混合物被注入缠绕在帕尔贴元件上的聚四氟乙烯（PTFE）管路中，该元件表面温度为 4 °C，以在注入微流控装置前对溶液进行冷却，从而防止反应溶液在使用前发生降解。采用微孔聚醚醚酮（PEEK）管路连接离开帕尔贴元件表面的 PTFE 管路与微流控装置，以减少未被冷却的 IVTT 反应混合物体积。注入装置的第二种溶液是编码 deGFP 的线性 DNA 模板，溶于超纯水中，浓度为 10 nM。第三种溶液为超纯水，在实验过程中具有多种用途。主要用途是确保每次稀释所置换的体积在所有反应器中保持一致，在对照反应中作为 DNA 的替代物。此外，超纯水还用于设备校准过程中荧光染料的稀释，以及在更换试剂时冲洗装置的死体积。最后注入装置的溶液是纯化的 FITC-葡聚糖溶液（25 μM），用于执行初始设备校准。DNA、水和荧光染料溶液均被注入管路（内径 0.02 英寸，外径 0.06 英寸）中，随后可按照方案第 4.2 节所述插入微流控装置的一个进样通道中。因此，这些溶液在整个实验过程中均保存在 29 °C 条件下。

微流控装置控制通道的驱动通过定制的控制软件实现，其中每个控制通道均可独立驱动。长时间的体外转录翻译（IVTT）反应无法通过此手动过程完成，必须使用控制软件中集成的自动化协议。在为实验准备微流控装置时，可利用类似的自动化协议执行多项有用的操作：用新试剂冲洗装置的死体积、在环形反应器内混合试剂，以及在向反应器中加载新试剂的同时置换出等体积的当前溶液。此外，还提供两种复杂操作：装置校准的实施，以及长时间无细胞蛋白表达的执行。上述所有操作均可通过主界面轻松执行，同时可配置多个参数以调整特定操作的设置，例如流入通道、流入体积和混合时间。

由于压力波动以及微流控装置制造过程中的不完美性，单次注射循环中所置换的流体体积在不同装置之间可能存在差异。因此，在进行体外转录翻译（IVTT）实验之前，需先确定每次注射循环中反应器的置换体积（更新分数）。该校准过程要求将全部八个反应器充满荧光参考溶液，本实验中使用的是纯化的荧光素标记葡聚糖溶液（25 μM）。随后，用超纯水对反应器进行10倍稀释。通过测量每个反应器在每次稀释循环中荧光强度的下降值，可计算出单次注射循环所置换的流体体积。在校准软件中，该数值（即 更新比率）将被记录，并用于后续IVTT实验。关键的是，为考虑装置内流速的差异以及各个反应器体积的偏差，每个反应器的 更新比率 均需单独测定并存储。反应器的填充与稀释过程由控制软件中的 执行校准 程序自动完成。校准实验的结果如 图8 所示。

最复杂的预设程序用于执行长时间的体外转录翻译（IVTT）实验，允许用户启动实验后无需看管，直至实验结束。在整个实验过程中，反应器1和5作为空白对照，稀释时仅向其中加入水。反应器2和6作为阴性对照，仅包含IVTT反应溶液和超纯水。其余反应器（3、4、7和8）则含有IVTT反应溶液以及2.5 nM编码deGFP基因的线性DNA。反应器的初始化通过将所有反应器（除1和5外）完全充满IVTT反应溶液实现，随后用超纯水置换出25%的反应器体积。此后，开始周期性地向反应器中注入试剂。实验设置为每14.7分钟向反应器注入一次新试剂，每次稀释循环置换30%的反应器体积。每次注入的试剂组成为：75%为新鲜IVTT溶液，其余25%为DNA或超纯水。每次加入新试剂后，反应器持续混合，随后利用显微镜记录每个反应器的荧光图像。反应连续运行68个循环，总实验时长为16.5小时。该实验结果见图9。

在进行长时间的体外转录翻译（IVTT）实验时，反应失败主要有两个原因：空气进入微流控装置，或IVTT反应溶液发生降解。微流控装置中出现空气通常直接源于流入溶液中存在的微小气泡，这些气泡随后被注入微流控装置中。一旦进入装置，空气的存在会阻碍液体的正常流动，导致反应体系无法周期性更新，从而在反应器环中形成批次式反应。在某些情况下，通过反复冲洗试剂可缓慢将空气从装置中清除，之后反应可按预期继续进行（如图9所示）。而在其他情况下，空气会持续滞留，只能通过中止实验，并对微流控装置的流体层施加持续（较高）压力来清除，该操作类似于方案第5.1节中描述的填充过程。在实验过程中，细胞裂解液被储存在连接于帕尔贴元件上的聚四氟乙烯（PTFE）管路中，并将温度冷却至4 °C。这两项措施均有助于延缓IVTT反应溶液随时间发生的降解：惰性的PTFE管路可最大限度减少管路材料与反应溶液之间的相互作用，低温环境则有助于维持执行IVTT所必需的功能性（生物）分子组分的活性。如果由于冷却不足或反应溶液与储存环境之间发生非预期相互作用而导致反应溶液发生降解，则实验上会表现为蛋白质表达水平随时间逐渐降低。一旦发生降解，IVTT反应溶液无法恢复，必须重新准备新的实验。

显微镜培养箱装置，包含流体储液池、压力调节器、帕尔帖冷却装置及温度控制。
图1. 实现连续体外转录翻译（IVTT）反应所需的硬件装置。A) 硬件装置示意图。B) 本研究中所用装置的实际照片。实现用于连续IVTT反应的多层微流控装置，需要复杂的硬件系统，以调节流体压力、驱动控制通道、对反应体系和试剂进行加热或冷却、储存液体，并在实验过程中对装置进行成像。实验在30 °C下进行，通过将显微镜置于设定为此温度的培养箱内来实现。为防止IVTT反应溶液降解，将其储存在缠绕于帕尔帖元件冷面的聚四氟乙烯（PTFE）管路中。帕尔帖元件的温度设定为4 °C，并通过水冷器和水冷块维持该温度。无需冷却的试剂则储存在显微镜培养箱外的流体储液池中。这些储液池通过计算机控制的压力调节器施加恒定压力。通过这种方式，液体被推动流经储液池的出口管路，直接连接至微流控装置的进样通道。微流控装置的每个控制通道均连接至一个气动阀。整个阀门阵列处于恒定压力下。打开阀门时，可使气动阀与微流控装置控制通道之间的连接管路中的流体加压，从而控制微流控装置内部聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜的开启与关闭。气动阀通过用户界面控制，由现场总线控制器（未显示）指令特定气动阀的开启与关闭。图改编自Yelleswarapu等22。请点击此处查看该图的放大版本。

气动控制系统示意图；标注的组件；聚氨酯管、连接件；压缩空气。
图2. 气动阀装置及控制通道连接概览。 图示为一个8阀阵列，其中阀门1、2和3已连接三个控制通道。可通过1/4英寸管路向阀阵列供应压缩空气。控制通道的驱动使用两种压力：1 bar用于低压控制通道（1、2和3），3 bar用于高压控制通道（9至30，本图未显示）。管路可填充超纯水，并使用不锈钢连接针插入其中一个控制通道入口。请点击此处查看此图的放大版本。

微流控系统示意图、压力控制器、DNA分离过程、管路、储液池。
图3. 商用流体压力调节器与储液系统概览。 使用市售的压力调节器将液体注入多层微流控装置的流体层。将压力控制器连接至计算机，可调节用于液体注入的压力。试剂可储存于流体储液池中，该储液池直接连接至压力调节器。对储液池施加压力后，液体通过出口管路被推出。该出口管路可通过不锈钢连接针直接连接至微流控装置的任一液体入口。若试剂体积不足以到达流体储液池，出口管路本身可作为试剂的临时储液空间。请点击此处查看此图的放大版本。

用于温度控制的微型流体冷却系统示意图，包含珀尔帖元件和管路装置。
图4. 用于冷却反应试剂的冷却系统概览。（左）独立的冷却装置；（右）置于显微镜内并与微流控装置连接的冷却系统。在将体外转录翻译（IVTT）反应溶液注入微流控装置之前，使用珀尔帖元件对其进行冷却。试剂储存在聚四氟乙烯（PTFE）管中，该管缠绕于珀尔帖元件的冷端表面。采用一段聚醚醚酮（PEEK）管将冷却后的流体输送至微流控装置，其较小的内径（0.005英寸）可最大限度减少未持续冷却的试剂体积。在缠绕的PTFE管旁放置一个热敏电阻，用于实时监测珀尔帖元件表面的温度。调节施加于珀尔帖元件的电压，使其表面温度维持在0 °C至4 °C之间。为有效移除珀尔帖元件产生的多余热量，将其热端紧贴于水冷块上，并涂抹不含硅油的散热脂以确保两接触面之间实现最佳热传导。请点击此处查看该图的放大版本。

微流控芯片示意图，控制层与流体层设置；用于流体动力学分析。
图 5. 微流控装置设计概览。 用于连续体外转录翻译（IVTT）反应的微流控流动反应器包含八个反应环，每个反应环体积为 10.7 nL。九个入口允许九种不同的反应溶液流入装置。24 条控制通道用于调节装置内的流体流动。控制通道 9 至 14 构成一个复用器。这些控制通道应始终保持加压状态，以阻止流体流入装置。同时释放两个控制通道的压力可允许单一试剂流入。控制通道 15、16 和 17 用于以受控方式通过蠕动泵将试剂泵入装置。控制通道 18 至 25 分别控制装置内八个反应器中的每一个的入口。控制通道 26 可关闭冲洗通道，从而迫使流体进入反应器。控制通道 27 有助于反应器的均匀填充。控制通道 28 和 29 分别调节环形反应器的出口以及装置唯一的总出口。最后，控制通道 1、2 和 3 用于在环形反应器内通过蠕动泵驱动流体，从而实现试剂的混合。该微流控装置的设计及本图均改编自 Neiderholtmeyer 等人29。请点击此处查看此图的放大版本。

微流控通道设计、流体动力学研究的流控示意图、实验装置分析。
图6. 微流控装置中的基于膜的阀门。A) 微流控装置内的流体通道。背景中可见两条控制通道。这些通道未加压，因此阀门处于开启状态（流体可流动）。B) 与流体层通道相交的两条控制通道已被加压，从而关闭了阀门（即阻碍了流体流动）。当控制通道加压时，分隔流体层与控制层通道的薄PDMS膜向上弯曲（控制层位于流体层下方），从而关闭流体层通道。流体层通道的圆角设计对于确保弯曲的膜完全封闭流体通道至关重要。请点击此处查看该图的放大版本。

用于DNA浓度分析的自动化光谱控制界面，包含混合与校准设置。
图7. 用于控制微流控装置的用户界面。 在本研究中，使用了定制的控制界面来调控微流控装置内的流体流动。该界面允许用户单独激活各个控制通道（编号为1-3和9-29），或执行复杂的操作程序，以实现试剂的冲洗与加载、微流控装置的校准以及实验的运行。请点击此处查看该图的放大版本。

每个反应器的荧光强度和更新率图、稀释步骤、数据分析结果。
图 8. 校准实验结果。在校准实验过程中，先将荧光染料（25 µM FITC-葡聚糖）注入各反应器，随后记录荧光强度。接着进行一系列稀释操作，通过设定数量的进液步数（15步）向反应器中注入超纯水。每次稀释后，混合试剂并测量荧光强度。每步稀释中荧光强度的下降程度反映了在设定进液步数下反应器环路中被置换的体积，该值称为更新率。 A) 所有八个反应器的平均强度及标准差以红色表示，各个反应器的强度轨迹以灰色表示。B) 每个稀释步骤的平均更新率及标准差以红色表示，每个单独反应器的更新率以灰色表示。可以看出，八个反应器中有七个表现出非常相似的行为，但其中一个反应器在第七次稀释循环后显示出更新率的波动。这表明，为每个反应器分别设定独立的更新率是必要的，而不应使用单一的平均更新率来控制试剂向所有反应器的注入。请点击此处查看该图的放大版本。

表达 deGFP 的荧光强度图，时间与强度关系，显示空气暴露点。
图 9. 表达 deGFP 蛋白的 IVTT 实验结果。 进行了一次延长的 IVTT 反应，每 14.6 分钟置换反应器体积的 30%。该反应持续运行超过 16 小时后终止。微流控装置中的两个反应器作为空白对照，整个实验过程中仅通入超纯水（反应器 1 和 5）。其余所有反应器包含 75% 的 IVTT 反应溶液和 25% 的超纯水（反应器 2 和 6），或 2.5 nM 编码 deGFP 表达的线性 DNA 模板（反应器 3、4、7 和 8）。在所有四个加入 DNA 的反应器中，均观察到明显的 deGFP 表达。其中三个反应器的荧光强度相似，一个反应器的荧光信号较低，这可能是由于流体流动不均导致进入反应器的 DNA 较少，或反应器尺寸存在差异所致。14 小时后，含 DNA 的反应器信号突然升高，这是由于空气泡进入微流控装置的流动层所致，可能源自某一进样溶液。微流控装置中滞留的空气显著限制了流体在通道中的流动，导致在气泡通过之前无法向反应器中添加或移除新鲜试剂。当流动恢复后，实验的荧光强度恢复至先前水平。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件。 请点击此处下载这些文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

已展示一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的多层微流控装置，并证明了其能够长时间维持体外转录翻译（IVTT）反应。尽管该技术特别适用于此具体示例，但理论上还可用于众多其他应用。对流体流动的额外控制，结合持续补充反应试剂并同时去除反应产物（或副产物）的能力，使其非常适用于连续合成反应、多种动态行为的研究，以及同一反应的多个不同条件的并行开展。

尽管基于PDMS的器件制备过程相对简单，但其使用需要复杂的硬件系统，包括阀阵列、压力调节器、压力泵、培养箱和冷却装置。从制备到实际应用的过渡并非易事，且需要较大的初期投入。此外，要稳定地搭建系统并成功开展实验，还需投入大量时间；本文旨在解决这一问题。然而，一旦系统建立，整个装置可根据不同需求进行调整。此外，该硬件系统包含多个模块化组件，每个组件均可扩展，从而支持更复杂的微流控器件设计。同时，模块化设计还允许用户用功能相似的替代组件替换原有硬件，因此使用者并不局限于本文所描述的具体配置48,49。

不同设备之间以及外部条件（如压力波动）的差异可能导致使用这些设备进行实验时产生误差。为解决此问题，每次实验前应对系统进行校准，为每个反应器提供一个独特的Refresh Ratio。尽管校准能够补偿设备间及实验间的差异，但该过程耗时且并非完全精确。当不同黏度的流体在相同压力下暴露时，其流动速率并不相同，因此使用多种试剂进行校准时可能无法获得相同的Refresh Ratios。 通过采用三个控制通道以蠕动泵方式将试剂泵入微流控装置，而非仅通过调节供压来控制流速，可在一定程度上减弱这一影响。在试剂黏度差异极大的极端情况下，作为最后手段，可通过开展多次校准实验，为每种试剂单独设定相应的Refresh Ratio。

使用蠕动泵将试剂注入微流控装置可减弱因使用不同黏度溶液而产生的影响，但同时也会引发另一个问题。由于采用离散的步骤将流体泵入微流控装置，导致向单个反应器中注入试剂的分辨率受限于单次泵送循环所注入的体积。在本研究中，该值在标定过程中确定，约为1%，即单次泵送循环可置换约1%的反应器体积（约0.1 nL）。因此，置换30%的反应器体积需要执行30次泵送循环，其中加入23次IVTT反应溶液，仅加入7次DNA或超纯水。尽管该方案足以满足本研究需求，但在尝试添加更多种类的独特试剂、使用更低的更新比例，或向反应器中添加更小体积的单一试剂时，其他实验方案可能会遇到困难。在此类情况下，可调整微流控装置的设计，以提供体积更大的反应器。Niederholtmeyer 等人36已报道了此类设计的一个实例。

关键的是，本文所述装置能够使反应持续较长时间，从而实现稳态的转录和翻译速率。通过定期向反应器中注入新的试剂并移除反应产物（或副产物），可维持反应的持续进行，并监测复杂的动态行为。通过这种方式，构建出一个在某种程度上模拟细胞环境的平台。此外，该平台还可通过调整注入的时间间隔以及注入试剂的具体组成，来探索系统的动态特性。因此，这种多层微流控装置成为表征和优化具有复杂动态行为的新型合成网络的有力工具。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到了欧洲研究理事会（ERC）（项目编号 677313 BioCircuit）、荷兰科学研究组织（NWO）的 NWO-VIDI 资助（NWO，723.016.003）、荷兰教育、文化和科学部（引力计划，024.001.035 ＆ 024.003.013）、人类前沿科学计划（Human Frontier Science Program）资助 RGP0032/2015、欧盟“地平线 2020”研究与创新计划下的欧洲研究理事会资助 723106，以及瑞士国家科学基金会资助 200021_182019 的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
丙酮VWR20063.365
AZ 40 XT默克股份公司（德国达姆施塔特）-正性光刻胶
AZ 726 MIF 显影剂默克股份公司（德国达姆施塔特）-正性光刻胶显影液
异丙醇默克股份公司（德国达姆施塔特）109634
显微镜载玻片VWRECN 631-1550
mr Dev 600Microresist Technology GmbH（德国柏林）-负性光刻胶显影液
无硅散热膏电路工坊CW7270导热硅脂
硅片硅材料-<1-0-0> 取向，100 mm 直径，525 µm 厚度
SU-8 3050Microchem 公司（美国马萨诸塞州牛顿市）-负性光刻胶
Sylgard 184 弹性体试剂盒（PDMS）陶氏化学公司01317318
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷Sigma-Aldrich448931-10G
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>仪器设备
4通道数字输入/输出模块WAGO Kontakttechnik GmbH750-5048x
相机镜头The Imaging Source-
压缩接头Koolance, Inc.FIT-V06X10适用于内径6mm、外径10mm的管路接头。4个
控制器末端模块WAGO Kontakttechnik GmbH750-600
连接管路的装置圣戈班高性能塑料AAD041030.02" ID，0.06" OD，Tygon 管道（ND-100-80）
设备连接器引脚Unimed SA（瑞士洛桑）200.010-AAISI 304 管材，内径 0.35 mm，外径 0.65 mm，长度 8 mm
以太网控制器WAGO Kontakttechnik GmbH750-881
母头连接器EncitechDTCK15-DBS-K15针母头总线连接器
液体储库FluigentFluiwell-4C
Fluigent 压力控制系统FluigentMFCS-EZ0 - 345 mbar
Hg短弧灯Advanced Radiation Corporation-350W
加热板Torrey Pines ScientificHP61
倒置显微镜尼康仪器公司Eclipse Ti-E
LabVIEW 软件de Greef 实验室，埃因霍温理工大学https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
液体冷却剂Koolance, Inc.LIQ-705CL-B
鲁尔接头Instech Laboratories, Inc.LS23
雄性鲁尔接头转卡套式接头Cole Parmer45505-323/32" ID
Matlab 软件de Greef 实验室，埃因霍温理工大学https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
微型相机The Imaging SourceDMK 42AUC03
显微镜相机滨松光子学OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
轨道摇床Cole ParmerEW-513000-05
烘箱赛默飞世尔科技Heraeus T6P 50045757
氧气等离子体灰化器Quorum TechnologiesK1050X
PDMS 打孔器SYNEOAccu-Pucnh MP10
PEEK 管特拉扬1301005001-5F0.005" ID，1/32" 光密度，红色
帕尔帖元件欧洲热力学APH-127-10-25-S
帕尔帖温度控制器Warner InstrumentsCL-100
光刻掩模CAD/Art服务有限公司-
光刻掩模设计Maerkl 实验室，洛桑联邦理工学院https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
气动阀阵列FESTO-1个22阀阵列和1个8阀阵列，常闭型阀门。
电源适配器Koolance, Inc.ADT-EX004S110/220V 交流电源适配器
聚四氟乙烯管Cole Parmer06417-21#24 AWG 薄壁聚四氟乙烯
冲孔针SYNEOCR0320245N21R4OD：0.032" （0.8128 毫米），内径：0.024" (0.6090 mm)
PVC管Koolance, Inc.HOS-06CL6 mm 内径，10 mm 外径
单边刀片GEM Scientific-
软管Fluigent-配备流体储液槽（内径 1 mm，外径 3 mm）
旋涂仪Laurell Technologies CorporationWS-650MZ-23NPPB
体视显微镜奥林巴斯株式会社SZ61
热敏电阻电缆Warner InstrumentsTA-29带珠状热敏电阻的电缆
紫外光暴露系统ABM，美国-近紫外曝光系统，350W
真空泵Vacuumbrand GmbHMD1C
水冷式冷板模块Koolance, Inc.PLT-UN40F
饮水机Koolance, Inc.EX2-755
体重秤赛多利斯M-prove

参考文献

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