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使用 ElectroMap 进行光学标测数据的高通量分析

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DOI：

10.3791/59663

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2019年6月4日

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1Institute of Cardiovascular Sciences, University of Birmingham, 2EPSRC Centre for Doctoral Training in Physical Sciences for Health, School of Chemistry, University of Birmingham, 3School of Computer Science, University of Birmingham, 4Institute of Clinical Sciences, University of Birmingham, 5Institute of Microbiology and Infection, School of Biosciences, University of Birmingham

本文内容

摘要

本方案描述了 ElectroMap 的设置与使用方法。ElectroMap 是一个基于 MATLAB 的开源软件平台，用于分析心脏光学标测数据。ElectroMap 提供了一种多功能、高通量的工具，可用于分析多种心脏实验模型中的光学标测电压和钙数据集。

摘要

光学标测是一种成熟的技术，可用于在多细胞组织样本中以高时空分辨率研究心脏电生理学。本文以逐步指导的方式，介绍如何使用 ElectroMap 对光学标测获得的高分辨率电压和钙信号数据集进行分析、量化和标测。ElectroMap 提供多种关键电生理参数的分析选项，其图形用户界面支持对预处理步骤和参数定义进行简便修改，使其适用于多种实验模型。我们展示了内置的起搏频率检测和信号分段功能如何实现对完整实验记录、急性反应以及单次心跳间变异性的高通量分析。此外，ElectroMap 包含自动多心跳平均功能，可提升噪声数据集的信号质量；本文演示了该功能如何帮助揭示在单心跳分析中可能被忽略的电生理变化。软件内置了用于传导分析、单列分析和交替性（alternans）研究的自定义模块，本文对此进行了展示。该软件平台可用于促进并加速复杂心脏电生理数据的处理、分析与标测。

引言

光学标测利用电压和/或钙浓度的荧光报告分子，在多细胞样本中研究心脏电生理学（EP）和钙处理，其空间分辨率高于传统技术1,2,3。因此，光学标测已成为一项重要且日益广泛应用的技术，为心脏的生理和病理生理电活动提供了关键见解3,4,5,6,7,8。然而，光学标测实验所获得数据的有效处理与分析受到多种因素的复杂影响。由于光学标测数据集具有高时空分辨率的特性，原始视频文件通常包含数千帧图像，每帧由大量独立像素组成，导致数据量庞大，必须依赖高通量和自动化的处理方法9。微小的像素尺寸、染料加载不均或效率低下以及荧光信号的微小相对变化，会导致光学信号信噪比（SNR）较低，因此在有效分析前需进行预处理10。此外，若采用光遗传学起搏方案，即利用光照引发细胞激活，可能干扰荧光传感器记录的信号，进一步增加数据处理与分析的复杂性11,12。再者，数据处理完成后，研究者常采用多种不统一的技术和定义来测量感兴趣的参数，而最合适的方法往往因实验设置、模型和科学问题的不同而异2,10,13。这些局限性阻碍了该技术的进一步推广，并限制了真正客观分析的实现。

为了克服这些局限性，多个研究团队已针对各自的实验模型、研究问题和硬件设备设计了定制化的数据处理流程7,14,15,16。另一些研究者则使用商业化的专有软件，但其底层算法可能难以获取4,17。因此，迫切需要一个可免费获取的开源软件平台，用于光学标测数据的处理与分析。该软件应为开源形式，易于使用，可灵活调整参数，适用于具有不同电生理特性的多种实验模型，并且关键的是，能够对光学标测技术可研究的心脏参数范围进行直接且可调节的量化分析。

我们近期发表并发布了一个综合性的软件平台ElectroMap，用于高通量、半自动地处理、分析和绘制心脏光学标测数据集13。本文中，我们提供了一个关于ElectroMap使用的视频操作指南，并展示了如何利用该平台处理、分析和绘制多个光学标测数据集。我们重点介绍使用ElectroMap量化标准电生理（EP）和钙处理参数的方法，并演示独立的传导速度、单文件分析和交替性（alternans）模块的应用。

方案

1. 光学图谱数据采集

  1. 采用多种实验模型进行心脏光学标测，包括完整且离体的全心脏6,18、离体心房14,19、心室楔形组织20、心脏切片21,22以及细胞单层23。有关从这些样本中采集原始光学标测数据的实验设计，请参见相关参考文献。只要所获得的数据可转换为 TIFF 图像序列或保存为 .MAT 文件，即可使用 ElectroMap 进行分析。这包括不同维度（方形/矩形）和分辨率（目前最大测试为 2048 像素 × 2048 像素）的数据。

2. 软件安装与启动

注意：以下是安装和运行 ElectroMap 的两种详细方法——可通过 MATLAB 运行源代码（.m 文件）或作为独立可执行文件（Windows 的 .exe 文件）运行。两种安装方式下的最终软件及其功能完全相同（仅在目录导航方面存在少量差异）。因此，选择安装版本的主要考虑因素是是否具备 MATLAB 及所需工具箱的访问权限，以及是否需要访问源代码。在条件允许的情况下，建议使用 MATLAB 版本，因其具有更快的启动速度、更短的处理时间以及更便捷的错误报告功能。

  1. 设置 1：在 MATLAB 中运行 Electromap
    1. 安装 MATLAB。ElectroMap 是在 MATLAB 2017a 中设计的，但该软件已在 MATLAB 后续所有版本中测试通过（撰写本文时已测试至 2018b）。需要以下工具箱：图像处理工具箱、信号处理工具箱、统计与机器学习工具箱，以及曲线拟合工具箱。
    2. 从 GitHub 仓库（https://github.com/CXO531/ElectroMap）下载或克隆 ElectroMap 最新“源代码”版本中的所有文件。将下载的内容解压缩至指定位置。
    3. 打开 MATLAB，导航至存放 ElectroMap 源代码的文件夹。然后打开文件 ElectroMap.m，在编辑器中点击运行，或在命令窗口中输入 ElectroMap 并按下 RETURN 键。这将启动 ElectroMap 用户界面，图 1A。
  2. 设置 2：独立运行的 .exe 文件
    1. 下载安装程序文件：https://drive.google.com/open?id=1nJyI07w9WIt5zWcit0aEyIbtg31tANxI。
    2. 按照安装程序中的说明操作，安装程序将从网络下载运行 ElectroMap 软件所需的 MATLAB 运行时环境。
    3. 运行 ElectroMap.exe。
      注意：独立版本的启动时间可能需要数分钟。

3. 图像加载与预处理

  1. 点击Select Folder，浏览至待分析数据文件所在位置。这将使左侧列表框中显示该目录下所有正确文件类型（.tif 或 .MAT）的文件。.MAT 文件中只能包含图像堆栈变量。
    注意：在浏览目录选择器时，仅文件夹会显示，不会显示单个文件。
  2. 在界面中选择要加载的文件，然后点击Load Images。
    1. 加载后，第一帧图像将显示，红色轮廓表示图像的自动阈值分割。如需，可通过选择Save/Load ROI重新加载先前使用的感兴趣区域（ROI）。在此情况下，跳过步骤 3.3。
    2. 默认情况下，阈值分割基于第一帧的像素强度。如需，可在Image for threshold下拉菜单中更改选项，以基于信号时间过程的幅值进行阈值分割。请注意，一旦选定阈值方法，将应用于整个图像堆栈。
  3. 如需，可将阈值选项更改为manual，以激活滑块手动调整图像阈值。此外，可通过在阈值选项下方选择相应的复选框，裁剪图像（Crop Image）和/或绘制自定义感兴趣区域（Custom ROI）用于分析。请注意，从顶部菜单的ROI Selection中可获取感兴趣区域选择的高级选项，例如区域数量。
  4. 应用合适的阈值后，点击Process Images以执行处理。处理设置详见下文（步骤 3.4.1–3.4.5）。此时，请确保已输入正确的相机设置，包括以 µm 为单位的Pixel Size（重要：此为图像像素尺寸，而非成像设备芯片或等效硬件的物理像素尺寸）以及以 kHz 为单位的Framerate。
    1. 对于信号反转，勾选Invert Data复选框以启用。若报告的荧光信号与目标参数呈反比关系（如常用的膜电位染料），可对信号进行反转。
    2. 对于空间滤波，从核函数菜单中选择Gaussian或Average。空间平均区域的大小由Kernel下拉菜单旁的Size输入框控制（例如，输入 3 表示使用 3 像素 × 3 像素的滤波核）。应用高斯滤波时，还可通过Sigma输入框设置标准差。
    3. 对于基线校正，从Baseline菜单中选择Top-hat24或多项式（4次或11次）校正25。校正可对每个像素单独进行（处理时间较长），或对整幅图像取平均值进行（速度更快，但假设基线变化均匀）。Top-hat 校正还可通过在基线选择下拉菜单旁设置Top-Hat Length（单位：毫秒）进行调整。Top-hat 核的长度应大于单个动作电位/钙瞬变的时间尺度。
    4. 对于时间滤波，从Filtering菜单中选择Savitzky-Golay或无限冲激响应（IIR）滤波。
      注意：除左下角显示的组织平均信号外，时间滤波将在从集合平均图像范围进行参数量化时，对每个像素单独应用。此设计旨在通过仅在需要时对小段数据进行滤波，以减少整体处理时间。
    5. 关于帧移除，若选中Remove Frames选项，则可从图像集中移除幅度大于目标信号的大幅峰值。此功能在光学起搏数据集中可能有用，例如光遗传学起搏，其中去极化由视蛋白（如 channelrhodopsin 211,12）的光学激活引发。
      注意：由于帧移除可能在图像信号中引入非生理性的阶跃变化，时间滤波可能因此产生伪影，故此处不推荐使用。
  5. 请注意，一旦选择Process Images，信号将根据Segmentation options下的选项进行分割，但可在不重新处理整个数据集的情况下快速更改（参见第 4 节）。

4. 数据分割与集成平均

注意：文件处理完成后，组织平均信号中的峰（右下角轨迹，图1A）将被检测并以红色圆圈标记。仅当峰超过设定阈值（轨迹上的蓝色线，由峰阈值设定）时才会被计数。此外，仅当峰相对于前一个峰具有足够延迟时才会被计数，该延迟由最小峰间距输入值设定。随后，根据检测到的峰对信号进行分段。首先，通过测量当前峰与下一个峰之间的时间来计算每个峰的有效周期长度（CL）。如果一定数量的峰（由最小峰数量输入值设定）具有相似的CL（相似性阈值由最小边界输入值设定），则将这些峰归为一组，并计算这些峰的平均CL。

  1. 如需进一步分割数据，请按 信号分割子分割选项包括： 无 – 所有具有相同CL的峰被归为一组； 全部 – n的片段峰 在恒定的CL时间范围内（n峰 由 片段大小 输入）被识别； 最后 – 最终 n峰 在CL变化前被识别并归类的所有项进行分析，其余项均不分析； 单次搏动 – 这相当于施加了 全部 使用 n 进行分割峰 = 1，因此不进行分组或集合平均（见4.5）。可通过选择 单次搏动 按钮。
    1. 通过放大感兴趣的时段并选择，对信号进行自定义分割 信号分割。这将添加一个名为 放大区域 到对应所选时间点的节列表框中。
  2. 分割结果将显示在组织平均信号旁边的列表框中，显示节段编号和估计的CL值。所有已分割的时间节段以不同颜色表示。从列表框中选择一个节段，该节段将以红色高亮显示。这也将自动触发对该节段的分析，如同 生成地图 按钮被选中（见第5节）。
  3. 对分组峰的分析将在“集成平均”数据上进行。这包括将片段中的峰与参考时间（即步骤4.2中识别出的峰）一起进行平均。通过修改时间窗口来更新平均范围 之前 和 之后 输入和按压 信号分割.

5. 动作电位/钙瞬变持续时间与传导速度分析

  1. 图像处理完成后， 生成地图 按钮将变为可用状态。按下 生成地图 应用动作电位时程（APD）、激活时间、传导速度和信噪比（SNR）分析。默认情况下，分析将应用于第一个信号片段。从列表框中选择其他片段可将分析应用于所选片段。
    注意：分析结果在结果表中显示，包括均值、标准差、标准误、方差以及第5至第95百分位数分析。持续时间图称为“APD”图，但使用相同设置处理的钙信号将用于测量钙瞬变持续时间。
  2. 选择 获取像素信息 以查看图像中任意像素信号的详细显示，以及 比较像素 可同时绘制最多6个位置的信号。
    1. 使用 信号处理 用于调整持续时间分析设置的面板。这些包括： 持续时间 – 从峰值开始测量复极化/衰减百分比所需的时间； ‘APD’ 基线 – 用于幅度测量的参考基线所定义的信号时间段；以及 ‘APD’起始时间 – 持续时间测量的起始时间。这些选项与决定等时图激活时间的选项相同（下文讨论），称为：起始（d2F/dt2­­最大­），上升支（dF/dt）最大­），去极化中点（50% 振幅时的时间），峰值（最大振幅时的时间）。这些定义适用于小鼠和豚鼠动作电位，如图所示 图2A.
      注意：更改上述任意选项将自动更新持续时间图和结果表。还可调整地图比例尺和离群值剔除选项。
  3. 传导速度也在主软件界面中自动测量，该方法采用 Bayly 等人提出的多向量法。26 由所选激活参数定义的等时图（见步骤5.4讨论）。按下 激活点 生成激活图谱的三维表示。
  4. 多向量传导速度测量法将等时图在空间上划分为若干区域 n x n 像素。设置该值为 n 使用 局部窗口大小 输入，并设置激活时间范围以应用分析 拟合激活时间 输入。
    注意：对于每个局部区域，采用一个多项式曲面， f，最能准确描述激活时间与空间位置之间关系的拟合曲线，（x,y）。梯度向量， 简历局部该表面的面积随后按如下公式计算：
    静态平衡方程：CV_local = ∇f(x,y)；与梯度场分析相关。 (1)
    其中 静力平衡图；力矩方程 Στ=0；力学稳定性分析 表示二维笛卡尔空间微分算子26.
  5. 在等时图的每个像素点上，计算代表传导速度和方向的局部矢量。选择 等时线图与矢量 从显示下拉菜单中选择以查看此分析。
  6. 信噪比（SNR）通过计算信号最大振幅与基线期信号标准差的比值获得。该分析在完成所有数据处理步骤后进行。按压 信噪比计算 在顶部菜单中编辑将信号定义为基线的时间段的设置。

6. 传导分析模块

  1. 点击传导以进入传导速度的详细分析。这将打开一个独立模块，可在其中使用与主界面相同的Bayly多向量法、单向量法以及激活曲线法对传导进行量化。
  2. 点击单向量，使用单向量法分析传导，该方法通过两点之间的激活时间延迟来计算传导速度（CV）。可通过自动或手动方法进行，具体选项位于单向量按钮下方。
    1. 对于自动单向量法，选择一个距离和起始点以测量传导。软件将从选定的点进行360度扫描，以1度为增量测量各个方向的时间延迟，并计算相应的传导速度。分析结果将显示在图谱旁边的图表中，最慢传导方向以红色标出。
    2. 对于手动单向量法，从等时图中选择起点和终点以计算传导速度。如需重新选择起点，请点击清除起点。
  3. 点击局部向量以应用多向量法，其设置与主界面中的设置一致。在传导模块中，可显示传导速度的分布、计算向量的角度分布以及传导速度的角度依赖性。
  4. 点击激活曲线，绘制随时间变化的组织激活百分比。100%激活所需时间将自动显示，同时可自定义测量所用的最小（蓝色）和最大（红色）激活百分比范围。

7. 其他分析与模块

  1. 除了自动进行的持续时间与传导速度分析外，还可使用 ElectroMap 量化其他多个参数。这些分析可通过显示图上方的下拉菜单进行选择。选择其中任意一项即可执行相应分析，结果将显示在 4th 结果表格的每一行：1） 舒张间期 – 从90%复极化至下一个动作电位激活时间的时间间隔；2) 优势频率 – 使用快速傅里叶变换计算每个像素的频率谱，并将功率最大的频率定义为优势频率。通过选择可获取优势频率分析的高级范围和窗口设置。 频率图谱; 3) 达峰时间 – 动作电位去极化相或钙离子释放过程中，用户选定的两个百分比值（默认为10%至90%）之间的上升时间。可通过选择更改百分比数值 TTP 设置；以及 4） 弛豫常数 (τ– 通过拟合如下形式的单指数衰减曲线来计算弛豫常数：
    用于分析衰减过程的指数衰减方程 F(t) = F₀e⁻ᵗ/τ + C，公式。 (2)
    时间点的荧光水平 t 取决于峰值荧光强度， F0，以及随后的衰变（C 是一个常数）27可在主 ElectroMap 用户界面中选择用于拟合方程 2 的数值范围，以及基于 r 的拟合优度排除标准2 值
  2. 按压 单文件分析 用于打开一个专用模块，对文件中每个已识别片段进行高通量时程和传导分析。分析可在整幅图像上进行（时程、传导和激活时间），也可在选定的感兴趣区域或感兴趣点上进行（目前仅支持时程）。结果将输出至 .csv 文件。
    注意：对于整幅图像的 APD 值，.csv 文件中的第一列为均值，第二列为标准差。
  3. 按压 交替现象 启动一个独立模块，用于专门分析和绘制逐搏变异图谱。参见 O’Shea et al. 201913 有关交替处理和分析选项的详细信息。具体而言，该模块旨在识别被称为交替的二周期振荡。持续时间和振幅交替均被计算并输出。
    注意：通过比较从一个峰到下一个峰的持续时间来测量持续时间交替；即，如果峰一和峰二的APD1 和 APD2 分别为，随后计算交替性持续时间（ΔAPD）
    ΔAPD=|APD₁−APD₂| 公式；心脏传导分析；用于说明差异计算的方程 (3)
    持续时间的测量通过主界面中的设置来完成。同时，幅度交替可在多细胞样本中进行量化和绘图，以绝对变化值表示（定义为百分比，其中0%表示相邻两次搏动间的幅度相同）。此外，通过测量和比较，可进一步研究钙负荷等现象的影响。 加载 和 释放 交替现象，正如先前报道的那样28。如果 L 定义为大幅搏动（即振幅大于前一次搏动的搏动）的峰值振幅， S 小搏动的幅度，以及色谱法；液相色谱装置示意图；蛋白质纯化过程D 小搏动的舒张期负荷，释放交替现象静力学平衡，力学中的 ΣFx=0、ΣFy=0 方程，受力平衡示意图。) 定义为：
    用于科学分析的释放率公式示意图，ALT_release = 1 - (S/L)。 (4)
    相反，负荷交替（load alternans）静态平衡；ΣFx=0 方程；教学示意图。) 定义为：
    静力平衡方程：ALT_load = D/L。用于详细分析的公式。 (5)
    跨整个组织可进行交替现象测量，分析结果会显示在模块的右下角。首次使用该模块时，分析将在整个实验文件上进行，所显示的结果为整个文件中所有搏动间差异的平均值。然而，可通过取消选择来限制对文件中特定时间点的分析。 保持缩放，放大特定时间段，并进行选择 分析放大区域这将更新结果面板，以显示所选时间段的分析结果。
    1. 选择播放以显示逐拍的交替分析视频。此外，选择 生成平均图 导出由该功能弹出菜单中设定的选定时间点平均得到的交替行为图谱。
  4. 按压 相位图 启动相位映射模块。对每个时间点的信号进行希尔伯特变换，以计算其瞬时相位（介于 -π 和 +π 之间）。点击播放按钮或拖动滑块以可视化相位随时间的变化行为，点击任意像素点可生成相应的相位图。

8. 导出数据

  1. 数据可通过多种格式从 ElectroMap 中导出。点击导出数值可保存主界面中当前显示图谱的数值。测量值可保存为保留像素位置的图谱形式，或压缩为单一列表，并可保存为 .csv、.txt 或 .MAT 文件。
  2. 点击导出图谱将弹出包含当前显示图谱的窗口，该图谱可保存为多种图像格式。图谱的显示选项可通过选择图谱设置进行控制，也可在点击导出图谱后进行编辑。例如，可通过顶部菜单选择相应图标添加颜色条，通过选择编辑 > 颜色映射设置比例尺。
  3. 点击激活序列视频可生成激活序列的动画，并可保存为动态 .gif 文件。
  4. 点击分段视频可保存当前显示的各识别段落参数的 .avi 视频文件。

结果

本研究中开展的所有工作均遵循英国《1986年动物（科学程序）法》以及欧洲议会《关于用于科学目的动物保护的2010/63/EU指令》所规定的伦理准则。实验已获得英国政府主管部门（小鼠：PPL 30/2967 和 PFDAAF77F，豚鼠：PPL PF75E5F7F）以及伯明翰大学（小鼠）和伦敦国王学院（豚鼠）机构审查委员会的批准。本文所分析原始数据的详细采集方法见于我们此前发表的文献5,6,14,19。

对 ElectroMap 进行控制的主要界面如图 1A所示。分析数据集所需的主要步骤由加载图像、处理图像和生成图谱按钮控制，在图 1A中分别以绿色、蓝色和红色高亮显示。图 1B-D展示了选择每个按钮后执行的操作。加载图像应用用户选定的图像阈值化选项（图 1B），而处理图像（图 1C）则进行滤波和基线校正。最后，生成图谱将首先根据时间窗口和分段设置对数据进行平均（除非选择单次搏动分段），然后执行上述分析。

ElectroMap 的一个关键特性是其在相机类型和实验模型方面的灵活性。由于广泛使用的模型之间存在明显的心脏电生理（EP）和解剖学差异，这种灵活性对于光学标测软件的实用性至关重要。图2A 例如展示了使用电压敏感染料记录的小鼠心房与豚鼠心室的动作电位形态，相关方法此前已有报道6,14。尽管动作电位形态存在显著差异，并且使用了两台具有不同帧率和像素尺寸的独立光学标测相机，ElectroMap 仍可用于成功分析这两组数据。然而，这需要在用户界面中对某些参数进行调整（图2B）。需要注意的是，由于豚鼠动作电位持续时间较长，因此需要设置更大的时间窗口。此外，为防止top-hat基线校正对光学记录信号产生非生理性修饰，必须增加其时间长度，使其超过动作电位的持续时间。

ElectroMap 提供了多种处理选项，有助于提高光学记录信号的信噪比（SNR），这对于有效恢复动作电位（EP）参数可能是必需的。例如，在数据分割后对峰信号进行自动集合平均。图3A-C 展示了在孤立的小鼠左心房样本（n = 13）中，采用集合平均法相较于其他方法如何提升信噪比。该方法可减少测量的异质性以及分析失败的可能性（图3D）。例如，当未进行集合平均时，起搏频率从 3 Hz 改变为 10 Hz 并未引起动作电位时程50（APD50）的变化；然而，当使用集合平均后的数据进行测量时，则观察到在 10 Hz 起搏下 APD50 出现预期的下降29（图3E）。

图4展示了ElectroMap提供的自动起搏频率检测与分割功能的有效性和实用性。在此实验中，小鼠左心耳组织（n = 5）以120 ms的周期长度起搏，并将周期长度每次递减10 ms，直至达到50 ms。ElectroMap自动识别出起搏周期长度，并据此对组织平均峰值进行分组（图4A）。该方法在所有数据集中均实现了高精度识别（图4B）。通过对数据进行自动分割，可简便且高效地分析随起搏频率增加（周期缩短）而出现的传导速度减慢现象（图4C,D）。同时，动作电位时程APD50（图4E）和舒张期间期（图4F）均缩短。光学测量所得峰值的幅度降低，而达峰时间延长（图4G,H）。这些结果再次反映了心脏组织中预期的恢复动力学反应29,30，因此，使用ElectroMap有助于阐明在药物干预、基因修饰或疾病状态下，心脏组织对起搏频率变化的响应机制。

使用 ElectroMap 等软件时，一个重要的考虑因素是原始数据中是否存在伪迹。图5 例如表明，运动伪迹（组织运动引起的光学记录信号失真）可能妨碍在 ElectroMap 中对激活尤其是复极化过程进行准确测量。更多讨论请参见“讨论”部分。

ElectroMap 界面示意图，展示图像阈值化、信号处理和图谱分析步骤。
图 1：ElectroMap 主要处理步骤。（A）ElectroMap 的图形用户界面，其中 加载图像（绿色）、处理图像（蓝色）和 生成图谱（红色）按钮已突出显示。（B）选择 加载图像 后可应用的图像阈值化选项。（C）用户可用的信号处理选项，包括空间和时间滤波以及基线校正，可通过点击 处理图像 应用于图像序列。（D）通过选择 生成图谱 激活的集成平均和参数量化功能（图中显示为动作电位时程测量）。该图改编自 O’Shea 等，201913。请点击此处查看此图的放大版本。

比较小鼠和豚鼠的静态平衡图；实验设置和参数设置。
图 2：使用 ElectroMap 分析小鼠和豚鼠数据。（A）从小鼠心房和豚鼠心室光学记录的动作电位，以及这些信号的一阶导数（df/dt）和二阶导数（d2f/dt2）。图中高亮显示了 ElectroMap 中可采用的激活时间和复极化时间的各种定义。（B）ElectroMap 界面中图像和信号处理设置的截图。红色框标出了在分析小鼠与豚鼠数据之间需要调整的设置。该图改编自 O’Shea 等，201913。请点击此处查看此图的放大版本。

心脏成像结果；信噪比、APD50数据分析；图表显示起搏频率的影响。
图3：通过集成平均法解析APD变化。（A）单次搏动光学动作电位的APD50图谱及单像素信号示例。（B）通过对连续10次搏动进行集成平均（峰值法）生成的光学动作电位的APD50图谱及单像素信号示例。（C）单次搏动信号与10次搏动平均信号的信噪比（SNR）比较。（D）单次搏动与10次搏动平均APD50图谱的APD50异质性（i）和测量失败次数（ii）随信噪比（SNR）的变化关系。（E）从单次搏动和10次搏动图谱测得的3 Hz和10 Hz起搏频率下的APD50值。（数据以均值±标准误表示，n = 13个左心房，****p < 0.001，经学生配对t检验）。请点击此处查看该图的放大版本。

ElectroMap 起搏分析；包括激活图、周期长度图和传导速度图。
图 4：使用 ElectroMap 研究心肌组织对起搏频率的响应。（A）ElectroMap 对起搏频率识别与分割的示例截图。（B）已知起搏周期长度与 ElectroMap 测量值的比较。（C）在 120 ms 和 60 ms 起搏周期长度下的激活图。（D–H）随着起搏周期长度从 120 ms 以 10 ms 递减至 60 ms，传导速度（D）、动作电位时程 APD50（E）、舒张期间期（F）、动作电位振幅（G）和达峰时间（H）的分组数据。 （数据以均值 ± 标准误表示，n = 5 个左心房） 请点击此处查看该图的高清版本。

APD50 和激活图，带有时间信号图的心脏电生理学示意图。
图5：运动伪影的影响。 （A）APD50 图。 （B）激活图。 （C）来自 APD 图和激活图上标记位置（十字标记）的示例信号。在以红色十字标记的组织区域，收缩未能成功解耦，导致测得的光学信号发生畸变。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文提供了一个逐步指南，用于使用开源软件 ElectroMap 对心脏光学标测数据集进行灵活且多变量的分析。要成功使用 ElectroMap，成像数据必须为 .tif 或 .MAT 格式。ElectroMap 包含多个可修改的用户设置。如图 2A所示，由于不同实验模型与成像硬件之间存在广泛异质性，这些设置的调整十分必要。这意味着软件中的默认设置并不总是最优的，因此使用该软件的一个关键步骤是用户需根据其特定的实验条件调整参数。这些参数包括相机设置和时间尺度，如图 2B所示。一旦找到最佳设置，用户可通过选择配置文件将其保存，并在后续使用时重新加载。

自动化的CL测量和信号分割功能是该软件的关键优势。这些功能可实现对实验记录中急性反应的分析，并将分析范围从孤立的单次搏动扩展到更广泛的数据。在完成所需的分割后，单文件分析模块可对每个独立片段（包括单次搏动）进行自动化分析，从而实现对整个记录过程中多个变量的高通量分析，并将结果输出至单个.csv文件中。同时，ElectroMap可自动对分组峰信号进行集合平均处理，这是提高噪声信号质量的有效方法。然而，集合平均并非在所有情况下均有益，例如在研究搏动间变异性时。因此，ElectroMap集成了单次搏动分割功能以避免集合平均，提供了多种替代处理选项（如空间和时间滤波）以改善信噪比（SNR），并包含交替波分析模块，用于进一步研究和绘制搏动间变异性图谱。

光学标测数据常出现基线漂移和运动伪影等伪迹。同时，由于像素尺寸小、曝光时间短以及荧光变化比例低等因素，所获得的信号质量可能较差2。这些因素会阻碍对潜在电生理行为的有效且准确的分析。如前所述，ElectroMap 提供了多种数据处理策略以克服这些问题。然而，若将这些算法应用于本质上质量差或严重失真的数据，仍无法实现有效分析。因此，信噪比（SNR）是 ElectroMap 中测量并显示的参数之一。同样，用户可通过 Pixel Info 和 Compare 模块选择并比较样本中特定区域的信号，从而识别如 图5 所示的运动伪影等现象，并对相关数据进行合理剔除。

目前，ElectroMap 尚不支持以基线校正相同的方式从原始数据中去除运动伪影。因此，软件未来可能的发展方向之一是引入通过计算方法去除运动伪影的功能，此类方法已有文献报道31,32。此外，ElectroMap 目前仅限于单一光学信号的研究。然而，对于比率型染料以及电压和钙染料的同时使用27，需要对两个波长通道进行同步处理。因此，整合双信号分析功能将是软件一项重要的未来扩展。增加适用于心律失常数据集的分析选项，例如相位奇点追踪，也将进一步拓展软件的应用范围33,34。最后，文中描述的若干分析功能也可用于电极标测数据的分析。事实上，尽管电生理信号波形存在差异，ElectroMap 已被用于分析电极标测数据20,35，进一步优化将扩大其在此类模态中的应用。

披露

P.K. 接受多家从事心房颤动治疗的药物和器械公司的研究资助，并从其中多家公司获得过酬金。L.F. 获得过欧洲联盟（EU）、英国心脏基金会（BHF）、医学研究理事会（MRC）、德国研究基金会（DFG）和吉利德公司（Gilead）的机构研究资助。 P.K. 和 L.F. 是伯明翰大学持有的两项专利的发明人（心房颤动治疗专利 WO 2015140571，心房颤动生物标志物专利 WO 2016012783）。

其他所有作者均声明不存在潜在的利益冲突。

致谢

本工作由EPSRC博士生奖学金（Sci-Phy-4-Health博士培训中心L016346）资助D.P.、K.R.和L.F.；D.P.还获得惠康信托种子奖（109604/Z/15/Z）以及英国心脏基金会基金（PG/17/55/33087、RG/17/15/33106）的支持；P.K.和L.F.获得欧盟资助（资助协议编号633196 [CATCH ME]）以及英国心脏基金会基金（FS/13/43/30324）的支持；P.K.和A.H.获得英国心脏基金会基金（PG/17/30/32961）的支持；P.K.还获得勒杜克基金会资助。J.W.由英国心脏基金会（FS/16/35/31952）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MATLAB 和 Simulink R2018aMathworks, Inc, Natick, MAMATLAB 软件

参考文献

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