我们介绍一种利用正向遗传学方法筛选表现出神经退行性变的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）突变体的实验方案。该方案结合了攀爬实验、组织学分析、基因定位和DNA测序，最终用于鉴定与神经保护过程相关的新基因。
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本文内容
摘要
摘要
关于神经退行性疾病的发病机制及其进展过程，仍有许多问题有待阐明，其中包括负责这些疾病的潜在基因。利用化学诱变剂进行正向遗传学筛选，是一种将突变表型与基因进行关联的有效策略，适用于果蝇（Drosophila）及其他与人类具有保守细胞通路的模式生物。如果目标突变基因在果蝇早期发育阶段不致死，则可开展攀爬实验，以筛选出脑功能下降的表型指标，例如攀爬速率降低。随后，可通过脑组织的次级组织学分析，评估神经退行性病变表型，从而验证该基因的神经保护功能。基因定位策略包括减数分裂定位和缺失定位，这些方法依赖于上述表型分析，并可进一步结合DNA测序，以鉴定目标基因中可能存在的核苷酸变化。
引言
神经元在大多数情况下是终末分化的，无法进行分裂1,2。在大多数动物中，存在神经保护机制，以在整个生物体生命周期内维持这些细胞的功能，尤其是在老年阶段，此时神经元最容易受到损伤。通过正向遗传学方法，可以在表现出神经退行性变的突变体中鉴定出这些保护机制所依赖的基因，因为神经退行性变是神经保护功能丧失的表型标志。使用化学诱变剂（如甲磺酸乙酯（EMS）或N-乙基-N-亚硝基脲（ENU））进行的正向遗传筛选特别有效，因为它们可诱导随机的点突变，从而提供一种内在无偏倚的方法，已帮助揭示了真核模式生物中大量基因的功能3,4,5（相比之下，X射线诱变会导致DNA断裂，可能引起基因组重排而非点突变6）。
常见的果蝇Drosophila melanogaster是此类筛选的理想对象，原因在于其基因组序列质量高且注释完善，作为模式生物具有悠久的研究历史和高度成熟的遗传学工具，更重要的是，其与人类具有共同的进化历史7,8
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方案
1. 果蝇的准备与老化
- 获取或构建6一批拟用于遗传筛选的Drosophila突变体。本实验中使用的是经ENU诱变、定位在第二染色体上并以CyO作为平衡染色体的品系。
- 将实验基因型品系置于25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环条件下，在玉米粉-糖蜜培养基上扩增培养。
- 从每种实验基因型中收集约20只成虫羽化后0-2天内的纯合子后代。为避免性别偏差，应始终选择同一性别的果蝇（雄性或雌性）进行收集。
- 将果蝇置于29 °C条件下，在玉米粉-糖蜜培养基上按所需时间进行老化培养，并每隔2-3天更换一次培养管，以确保果蝇始终生活在新鲜培养基上。在本实验所展示的筛选中，果蝇老化时间为10-12天。
- 使用两个培养管和胶带组装一个攀爬行为检测装置，组装方法如前所述10。两个培养管应在两端开口处连接。使用直尺在装置一端标记一条5 cm的参考线。
2. 方案1：攀爬实验（改编自 Ali 等人10）
- 验证爬行实验。本研究中，根据 Ali 等人先前描述的方法10，使用表现出较低爬行通过率的 ElavC155&....
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结果
在本文中，我们介绍了用于鉴定基因的步骤 脑肿瘤 (brat在成年果蝇中对维持神经元完整性（例如，神经保护）起作用17；一种可用于鉴定参与神经保护的基因的方法。我们采用正向遗传学方法（该策略的流程如图所示） 图1A）以使用攀爬实验筛选经化学诱变的果蝇群体（本实验所用装置如图所示 图1B在235个纯合品系中，约37%的品系在10-12日龄测试时表现出低于50%的攀爬通过率（图1C）。在使用单因素方差分析（one-way ANOVA）将各测试品系的爬行通过率（CPR）百分比与所有测试品系的平均爬行百分比进行比较后，发现58%的品系表现出显著不同的爬行行为。图1D随后对爬行通过率最低的51个品系进行组织学筛选，结果显示其中29个品系的脑神经毡中可见明显空洞（程度.......
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讨论
在Drosophila中进行的正向遗传筛选已被证明是鉴定参与多种生物学过程（包括年龄依赖性神经保护）基因的有效方法5,23,24,25。利用这一策略，我们成功地鉴定出brat是一个新的神经保护基因17。
本方案中的一个关键步骤是组织学分析时头部的正确摆放方向（如第4.4.3节所述）。此外，用于减数分裂定位的标记不应干扰新突变的表型（本研究中为神经退行性变）。我们建议首先进行测试，以确认所选标记本身不会引起神经退行性变。例如，Jammed (J) 会导致翅泡表型，可能会影响果蝇的攀爬能力，类似于过表达淀粉样前体蛋白（APP）且具有翅泡的果蝇26。Lobe (L) 会.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们特别感谢 Barry Ganetzky 博士，遗传筛选实验在其实验室中完成，从而实现了对神经保护基因 brat 的鉴定与表征。我们感谢 Steven Robinow 博士慷慨提供了本文所述遗传筛选中所使用的 ENU 诱变果蝇品系。我们感谢 Ganetzky 实验室的成员，包括 Grace Boekhoff-Falk 博士和 David Wassarman 博士，在本项目整个过程中提供的有益讨论；感谢 Ling Ling Ho 和 Bob Kreber 提供的技术支持；感谢 Aki Ikeda 博士提供威斯康星大学的切片机设备，以及 Kim Lackey 博士和阿拉巴马大学光学分析平台的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>主要设备 | |||
| 组织学用通风橱 | |||
| 光学显微镜 | 尼康 | Eclipe E100 | 成像的首选物镜为 20x |
| 成像软件 | 尼康 | ||
| 显微镜相机 | 尼康 | ||
| 热循环仪 | Eppendorf | ||
| <强>果蝇推动与攀爬实验 | |||
| VWR® 果蝇小瓶，窄口 | VWR | 75813-160 | |
| VWR® 通用实验室标签胶带 | VWR | 89097-912 | |
| 标准小鼠垫 | |||
| 体视显微镜 | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 麻醉工作站（吹管、脚踏阀、Ultimate Flypad） | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | 没有’t iinclude CO2 气罐 |
| 细头刷 | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| 黑腹果蝇 培养箱 | VWR | 89510-750 | |
| <强>基因定位 | |||
| CantonS | 布卢明顿果蝇品系中心 | 9517 | |
| w1118 | 布卢明顿果蝇品系中心 | 5905 | |
| yw | 布卢明顿果蝇资源中心 | 6599 | |
| 黑腹果蝇 用于重组定位的品系 | 布卢明顿果蝇品系中心 | 3227 | 基因型：wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | 布卢明顿果蝇品系中心 | 2555 | 用于重组定位的果蝇平衡染色体品系 |
| 2L号染色体缺陷试剂盒 | 布卢明顿果蝇资源中心 | DK2L | 库克等人，2012 |
| <强>组织学分析 | |||
| 乙醇（100%） | 赛默飞世尔科技 | A4094 | |
| 氯仿 | 赛默飞世尔科技 | C298-500 | |
| 冰醋酸 | 赛默飞世尔科技 | A38-500 | |
| Fisherbrand™ 优质微量离心管：1.5 mL | 赛默飞世尔科技 | 05-408-129 | |
| Histochoice 透明剂 1x | VWR生命科学 | 97060-934 | |
| 哈里斯苏木精 | VWR | 95057-858 | |
| 伊红 | VWR | 95057-848 | |
| 赛默飞世尔科技™ Richard-Allan Scientific™ 封片剂 | 赛默飞世尔科技™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost 多聚-L-赖氨酸载玻片，75 mm × 25 mm × 1 mm，EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ 盖玻片：矩形 | Fisherbrand | 12-545M | 尺寸：24 mm × 60 mm |
| 可追溯计时器 | VWR | ||
| 载玻片加热板 | Barnstead International | 型号 26025 | |
| 载玻片托盘和支架 | DWK生命科学 | 用于放置20张载玻片的支架 | |
| Fisherbrand™ 通用型超长镊子 | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | 金佰利™ 专业人员 | ||
| 6 英寸普里敦采样拭子 | 缅因州吉尔福德市硬木产品公司 | 807-12 | |
| VWR® 剃刀刀片 | VWR | 55411-050 | |
| 用于组织学液体的特百惠或玻璃容器 | 16 + 1 用于流动水 | ||
| 高轮廓包被切片刀 | VWR | 95057-834 | |
| 康宁™ 带盖圆形冰桶，4 L | 康宁™ | ||
| 烧杯 | 或用于冰水和盒式容器的其他容器 | ||
| 组织浴槽 | 精准科学公司 | 66630 | |
| 切片机 | Leica Biosystems | ||
| <强>分子分析 | |||
| 向导® SV胶回收及PCR产物纯化系统 | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA聚合酶 | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ 安全™ DNA凝胶染色剂 | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ 琼脂糖 | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE—质粒编辑软件 | 可免费下载 | ||
| <强>统计分析 | |||
| R 软件包 | |||
| <强>进一步分析 | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | 布卢明顿果蝇品系中心 | 59967 |
参考文献
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure.....
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重印与许可
