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方法文章

体内正向遗传筛选以鉴定新型神经保护基因 黑腹果蝇

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DOI：

10.3791/59720

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2019年7月11日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alabama, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison

本文内容

摘要

我们介绍一种利用正向遗传学方法筛选表现出神经退行性变的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）突变体的实验方案。该方案结合了攀爬实验、组织学分析、基因定位和DNA测序，最终用于鉴定与神经保护过程相关的新基因。

摘要

关于神经退行性疾病的发病机制及其进展过程，仍有许多问题有待阐明，其中包括负责这些疾病的潜在基因。利用化学诱变剂进行正向遗传学筛选，是一种将突变表型与基因进行关联的有效策略，适用于果蝇（Drosophila）及其他与人类具有保守细胞通路的模式生物。如果目标突变基因在果蝇早期发育阶段不致死，则可开展攀爬实验，以筛选出脑功能下降的表型指标，例如攀爬速率降低。随后，可通过脑组织的次级组织学分析，评估神经退行性病变表型，从而验证该基因的神经保护功能。基因定位策略包括减数分裂定位和缺失定位，这些方法依赖于上述表型分析，并可进一步结合DNA测序，以鉴定目标基因中可能存在的核苷酸变化。

引言

神经元在大多数情况下是终末分化的，无法进行分裂1,2。在大多数动物中，存在神经保护机制，以在整个生物体生命周期内维持这些细胞的功能，尤其是在老年阶段，此时神经元最容易受到损伤。通过正向遗传学方法，可以在表现出神经退行性变的突变体中鉴定出这些保护机制所依赖的基因，因为神经退行性变是神经保护功能丧失的表型标志。使用化学诱变剂（如甲磺酸乙酯（EMS）或N-乙基-N-亚硝基脲（ENU））进行的正向遗传筛选特别有效，因为它们可诱导随机的点突变，从而提供一种内在无偏倚的方法，已帮助揭示了真核模式生物中大量基因的功能3,4,5（相比之下，X射线诱变会导致DNA断裂，可能引起基因组重排而非点突变6）。

常见的果蝇Drosophila melanogaster是此类筛选的理想对象，原因在于其基因组序列质量高且注释完善，作为模式生物具有悠久的研究历史和高度成熟的遗传学工具，更重要的是，其与人类具有共同的进化历史7,8。本实验方案应用中的一个限制因素是突变基因导致的早期致死效应，这会阻碍对老年个体的检测9。然而，对于非致死性突变，可采用攀爬实验——利用果蝇的负向地性——作为一种简单但全面的方法来量化运动功能障碍10。果蝇表现出足够的运动反应能力依赖于神经功能，以确定方向、感知自身位置并协调运动。因此，果蝇无法充分响应刺激而攀爬，可能提示存在神经系统缺陷11。一旦鉴定出特定的攀爬缺陷表型，可进一步通过次级筛选（如脑组织的组织学分析）来识别攀爬缺陷果蝇中的神经退行性病变。随后可通过基因定位揭示携带目标缺陷性神经保护基因的染色体区域。为缩小目标染色体区域范围，可利用携带已知染色体位置的显性标记基因的突变果蝇品系进行减数分裂定位。标记基因可作为突变位点的参考点，两个位点之间的重组频率可提供可测量的距离，用于推断基因的大致位置。最终，将突变品系与携带目标减数分裂定位区域平衡缺失的品系杂交，可进行互补测试：若已知表型得以表达，则可验证目标基因的存在5。通过测序该基因并与Drosophila基因组序列比对，可评估其中的多态性核苷酸序列，这些序列可能引起氨基酸序列的改变。对目标基因的进一步表征可包括额外突变等位基因的检测、突变回补实验以及对其他表型的观察。

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方案

1. 果蝇的准备与老化

  1. 获取或构建6一批拟用于遗传筛选的Drosophila突变体。本实验中使用的是经ENU诱变、定位在第二染色体上并以CyO作为平衡染色体的品系。
  2. 将实验基因型品系置于25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环条件下，在玉米粉-糖蜜培养基上扩增培养。
  3. 从每种实验基因型中收集约20只成虫羽化后0-2天内的纯合子后代。为避免性别偏差，应始终选择同一性别的果蝇（雄性或雌性）进行收集。
  4. 将果蝇置于29 °C条件下，在玉米粉-糖蜜培养基上按所需时间进行老化培养，并每隔2-3天更换一次培养管，以确保果蝇始终生活在新鲜培养基上。在本实验所展示的筛选中，果蝇老化时间为10-12天。
  5. 使用两个培养管和胶带组装一个攀爬行为检测装置，组装方法如前所述10。两个培养管应在两端开口处连接。使用直尺在装置一端标记一条5 cm的参考线。

2. 方案1：攀爬实验（改编自 Ali 等人10）

  1. 验证爬行实验。本研究中，根据 Ali 等人先前描述的方法10，使用表现出较低爬行通过率的 ElavC155>UAS-TauR406W 果蝇，以及 ElavC155>UAS-GFP（对照）和 ElavC155>UAS-mCherry（对照）果蝇进行爬行实验测试。
  2. 将果蝇逐管转移至测试装置中（一次测试一个品系），避免使用 CO2 麻醉，并让其在装置中恢复 5 分钟。若实验在不同日期进行，应于每天同一时间开展测试。本研究中，所有爬行实验均在下午进行，以控制昼夜节律对运动能力的影响12。
    注意：测试过程中应避免果蝇暴露于直射阳光下，否则会影响其爬行能力。
  3. 将测试装置（标记面朝下）用力敲击放置于坚固表面的鼠标垫上 3 次，使所有果蝇均从底部开始实验。观察果蝇在 10 秒内的运动行为。
  4. 记录在此时间内到达或越过 5 cm 标记线的果蝇数量，以及测试的果蝇总数。每管至少重复 3 次实验，每次重复之间间隔 1 分钟。
    注意：本研究中，初始筛选（雄性果蝇）每管果蝇数量为 2 至 19 只，突变缺失分析（杂交雌性品系，第 5.3 节）每管为 6 至 21 只。

3. 方案2：筛选 果蝇 用于进一步分析的菌株

  1. 将攀爬实验数据输入 Microsoft Excel 或类似软件，并计算每条果蝇品系在所有重复实验中的攀爬通过率（以百分比表示）。
  2. 使用 R 软件包进行统计分析，以检测与所有品系平均攀爬百分比存在显著差异的突变品系13。
    1. 读取为 R 软件整理好的数据文件（.csv 或 .txt 文件，每一列代表一个变量或因子，每一行代表具体的数值）。
      注意：此处，雄性果蝇（初始实验）和雌性果蝇（第 867 号品系与缺失品系杂交）的数据分别输入到不同的 .xlsx 工作表中，包含两列：一列为突变品系名称及实验重复次数，另一列为每瓶果蝇重复实验的平均攀爬成功率（以百分比表示）。
    2. 使用以下代码将数据读入 R：
      mali<-read.csv("../male_init.csv")
      femdef<-read.csv("../fem_def_cross.csv")
      注意：路径中的 ".." 表示从用户计算机根目录开始的绝对路径，需由用户根据其计算机的实际目录路径进行指定。
    3. 执行线性建模
      1. 在 R 中使用 lm 函数进行虚拟变量回归。在对突变品系的初步分析中，评估各因子水平（突变品系）对攀爬成功率百分比的影响是否显著，响应变量（成功率百分比）以总均值为中心化为零均值。
        注意：在 3.2.3.2 节的 lm 函数调用末尾添加 "-1" 可移除截距项，从而允许我们将所有因子水平与攀爬通过率百分比的零均值中心化均值进行比较。
      2. 使用 R 的 summary 函数将结果输出到屏幕：
        mali_anova<-lm(scale(mali$P_Success)~mali$Mutant_line -1)
        summary(mali_anova)
      3. 若有对照品系，可将其作为基线，使用以下 R 代码测试各因子水平的影响：x<-relevel(femdef$Mutant_line, ref="a867_plus")
        femdef_anova<-lm(femdef$P_success~x)
        summary(femdef_anova)
        注意：第一行代码重新排序因子水平，使阴性对照品系成为基准截距项，其余所有因子水平（突变品系）均通过 lm 函数内置的 t-检验与其进行比较。
  3. 根据测试时果蝇的年龄选择候选品系的阈值。为确定该阈值，可使用已知在神经系统中过表达人类神经退行性疾病相关基因 Tau 的 Drosophila 品系作为模型，在目标年龄下进行初步测试，比较其与野生型对照果蝇的神经退行表型和较低的攀爬通过率10。
    注意：对于 10 日龄果蝇，低于 50% 的通过率可能是合适的，此前已有报道10。对于更年长的果蝇，应设定更高的通过率阈值，因为随着年龄增长，果蝇的运动能力自然下降，神经退行程度预期更高。

4. 方案3：组织学分析

  1. 佩戴手套，使用手术刀在完成攀爬实验后切下果蝇头部，并用画笔轻轻将其放入含有1 mL Carnoy固定液（100%乙醇:氯仿:冰醋酸按6:3:1比例配制）的1.5 mL微量离心管中，于4 °C过夜固定。确保头部完全浸没于固定液中。
  2. 次日将固定液更换为1 mL 70%乙醇，并将样本继续保存在4 °C，以备后续分析。
    注意：本实验方案可在此步骤暂停。
  3. 将步骤4.2中获得的头部样本每至多五个置于一个微型活检盒中。立即将活检盒放入盛有70%乙醇的容器内，并将容器储存在4 °C，待后续运送至组织学实验室进行处理及石蜡包埋。若具备组织处理与包埋设备，可继续执行步骤4.4。
  4. 将头部样本进行石蜡包埋以便切片：
    1. 按照表1中列出的顺序，设置自动组织处理仪的程序，对头部样本进行脱水、透明及石蜡浸润处理。
    2. 使用石蜡包埋仪，在60 °C加热条件下，将样本转移至适配活检盒的金属底模中。
    3. 使用精细镊子在底模中调整头部方向（前后方向朝上），以便切片后能清晰观察脑组织。如需调整，可在60 °C重新加热石蜡后重新定位。
      注意：金属底模可用一次性底模替代。
    4. 将活检盒置于对应的底模上方，轻轻移至石蜡包埋仪的冷藏侧（4 °C）。待石蜡块完全硬化后再从仪器中取出。
    5. 通过轻轻分离模具与活检盒的方式取出石蜡块。
  5. 在切片前对每个石蜡块进行修整，以减少需切片的表面积。
  6. 将切片机设置为对每个石蜡块切取5 µm厚的切片。
  7. 将含有组织的石蜡切片带放入加热的水浴（35 °C）中，最多不超过5分钟。
  8. 将多聚赖氨酸包被的载玻片（有助于组织附着）浸入加热的水浴中，使用木制涂布棒将切片带转移至载玻片上。让载玻片在室温下自然干燥过夜。
  9. 使用载玻片加热器在63 °C加热载玻片15分钟。
  10. 将载玻片置于染色架上，在通风橱内按照以下步骤进行苏木精-伊红（H&E）染色。
    1. 将染色架放入Histochoice溶液（一种无毒替代二甲苯的试剂，用于去除样本中的石蜡）中5分钟。
    2. 将染色架转移至盛有Histochoice的容器中，继续处理5分钟。
    3. 将染色架转移至盛有100%乙醇1的容器中5分钟。
    4. 将染色架转移至盛有100%乙醇2的容器中5分钟。
    5. 将染色架转移至盛有95%乙醇的容器中3分钟。
    6. 将染色架转移至盛有70%乙醇的容器中3分钟。
    7. 将染色架转移至盛有蒸馏H2O的容器中5分钟。
    8. 将染色架转移至盛有Harris苏木精液的容器中染色2–5分钟。
    9. 将染色架从苏木精液中取出，置于流动自来水下冲洗10分钟。
    10. 将染色架快速浸入盛有蒸馏水的容器中进行短暂漂洗。
    11. 将染色架转移至盛有伊红液的容器中染色1–2分钟。
    12. 将染色架快速浸入盛有95%乙醇的容器中进行短暂漂洗。
    13. 将染色架转移至盛有95%乙醇的容器中5分钟。
    14. 将染色架转移至盛有100%乙醇的容器中5分钟。
    15. 将染色架再次转移至盛有100%乙醇的容器中5分钟。
    16. 将染色架转移至盛有Histochoice（或二甲苯）的容器中5–10分钟，直至所有载玻片完成封片。
    17. 进行封片操作：使用镊子将载玻片从Histochoice或二甲苯溶液中取出，在其表面涂上一层薄薄的封片介质，然后轻轻盖上盖玻片（尺寸为24 mm × 60 mm），尽量避免产生气泡。
    18. 将已封片的载玻片置于通风橱中过夜，使封片介质完全硬化后再进行分析。
    19. 将染色后的载玻片存放于室温下的玻片盒中保存。
  11. 在光学显微镜下以20倍放大倍数观察载玻片上所有连续切片，定量评估神经退行性变。全面检查整个脑组织，并定性记录连续三个切片中出现的空泡大小和数量。
  12. 使用配备成像软件的光学显微镜，在脑部中段区域获取代表性脑切片图像。

5. 方案4：隐性突变表型的基因定位

  1. 将候选品系与野生型 CantonS（BL_ 9517）或其他野生型或同源纯合品系（例如 OregonR （BL_ 2376）、w1118（BL_5905）或 yw （BL_ 6599））进行杂交，以确定表型为显性或隐性。
    注意：    此步骤的结果将指导后续定位实验。若表型为隐性，则可进行缺失定位分析。
    1. 使用画笔将感兴趣的突变品系（5只雄蝇）和 CantonS 品系（10–15只未交配雌蝇）的 CO2 麻醉果蝇放入含食物的培养管中。将培养管置于 25 °C 环境中。
    2. 收集杂合的 F1 子代，并重复进行攀爬实验和组织学分析。
    3. 将所得结果与对照品系及纯合突变体进行比较。若杂合突变体表现出与野生型果蝇相似的表型，则提示该表型可能为隐性。
  2. 进行减数分裂定位，利用带有已知细胞学位置的显性标记品系 wgSp-1 J1 L2 Pin1/CyO（BL_3227）或类似品系，粗略估计位于第二染色体上的突变位置。本研究中该突变已知位于第二染色体上。
    1. 使用画笔将感兴趣的突变品系（5只雄蝇）和 wgSp-1 J1 L2 Pin1/CyO 品系（10只雌蝇）的 CO2 麻醉果蝇放入含食物的培养管中。将培养管置于 25 °C 环境中。
      注意：本杂交的目的是产生携带新突变染色体和标记染色体的杂合雌性子代，使其在减数分裂过程中发生重组6,14。选择雌性 F1 子代而非雄性，是因为雄性果蝇不发生重组。
    2. 收集至少 15 只携带新突变染色体和标记染色体的未交配雌性子代，并将其与携带另一可见显性标记的平衡品系（例如 CyO/snaSco（BL_2555）或类似品系）的 5 只雄蝇进行杂交。
    3. 从第 5.2.2 步的杂交中收集携带 Sco 或 CyO 以及潜在重组染色体的杂合雄性子代，并分别与携带突变染色体的品系中的未交配雌蝇交配。
    4. 收集第 5.2.3 步所述最终杂交的子代，并在 29 °C 下老化果蝇（本研究中果蝇老化 10–14 天）。
    5. 收集果蝇头部，按照方案 3 所述进行组织学分析，并观察脑切片以评估神经病理学程度，方法见第 4.11 步。由于某些表型（如 Jammed (J)，可导致翅膀积液15）可能影响攀爬实验结果，因此采用组织学分析而非运动行为分析。
  3. 在染色体已缩小的区域内进行缺失定位，利用攀爬实验进一步精确定位隐性突变。每种缺失品系均缺失染色体的不同区域，可用于互补测试。
    1. 首先使用覆盖减数分裂定位所确定区域的大片段缺失品系，再通过更小片段的缺失品系进一步缩小范围。若缺失分析结果显示多个候选基因，建议使用 RNA 干扰（RNAi）品系对这些基因进行靶向验证。
    2. 使用本研究中的第二染色体 Drosophila 缺失试剂盒16（DK2L）中的品系进行杂交，检测是否出现目标表型的非互补现象（本研究中：攀爬通过率为 8.5%，对应于作为阳性对照的 867 品系纯合果蝇的通过率）。
    3. 按照第 4 节（方案 3）所述方法，通过组织学验证确认神经退行性表型。

6. 方案5：DNA测序与分析

注意：需注意，ENU诱变会引入点突变11。

  1. 设计引物序列，扩增 brat 基因外显子编码区两侧的片段，用于聚合酶链式反应（PCR）扩增目标区域（以867号品系为例，扩增一个大小为3,247 bp的DNA片段用于测序17）。
  2. 从单只果蝇中提取DNA18：
    1. 使用P100或P200移液器吸头，在含有50 µL裂解缓冲液（10 mM Tris-Cl pH 8.2、1 mM EDTA、25 mM NaCl和200 µg/mL蛋白酶K；每次使用前需将酶从冷冻储备液中新鲜稀释）的0.5 mL微量离心管中轻轻压碎果蝇。
    2. 在37 °C下孵育30分钟。
    3. 将离心管置于95 °C加热2分钟，以灭活蛋白酶K。
      注意：提取的DNA可在4 °C下保存数月。
  3. 使用高保真DNA Taq聚合酶进行PCR反应（本研究使用的试剂和热循环条件分别见表 2和表3），遵循制造商说明书操作，并将PCR产物在含Invitrogen SYBR Safe DNA凝胶染料的1%琼脂糖凝胶上电泳，该染料是溴化乙锭的无毒替代品。
  4. 用手术刀切下凝胶中大小正确的条带，使用Wizard SV凝胶和PCR纯化系统（Promega）或等效试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物。
  5. 设计用于DNA测序的正向和反向引物，尽可能覆盖整个目标区域。对上一步纯化后的DNA进行测序，以鉴定点突变。自动荧光Sanger测序的高准确性可达到约700 bp。
    注意：Ex Taq聚合酶（TaKaRa）可用于从基因组DNA模板扩增长达20 kb的PCR产物。
  6. 使用A plasmid Editor（ApE，M. Wayne Davis开发）或类似软件分析获得的DNA序列，通过序列比对，并与参考品系（例如原始诱变品系）同一基因组区域的测序结果进行比较。
    1. 用ApE打开测序文件。作为参考，使用从Flybase下载的FASTA格式的brat基因基因组共识序列的ApE文件，或使用遗传背景对照的测序结果文件（例如原始诱变的Drosophila品系）。
    2. 进入工具，然后选择比对序列。使用鼠标选中所有待比较的序列。请记住在下拉菜单中指定用于比对的参考序列。
    3. 检查测序区域相对于参考序列的核苷酸变化。如需要，可点击文本，然后选择保存，将比对结果以.rtf格式保存至计算机。
      注意：若未发现突变，则需重新进行DNA测序和分析流程，使用设计覆盖基因非编码区的引物。

7. 方案6：候选基因功能的进一步分析

  1. 在神经母细胞中进行挽救实验以确定该基因的功能 brat 负责神经退行性表型。
    1. 双平衡 a UAS-brat19 以及神经母细胞特异性的 worniu-Gal4 (wor-G4携带第三染色体上构建体的品系，以及该基因的突变品系867 brat 位于第二号染色体上。
      1. 通过将5只雄性分别放入三个含有食物的不同小瓶中，进行三次独立的杂交实验 UAS-Brat, wor-G4 和 867 将果蝇品系与各组雄蝇杂交，并向每组雄蝇中加入10–15只携带第二和第三染色体标记基因及平衡染色体的 virgin 雌蝇（Sp/CyO；Dr/Tm3,sb；BL_59967)
      2. 从具有以下基因型的各杂交组合F1代中收集10–15只 virgin 雌性个体： +/CyO；UAS-brat/Tm3,sb, +/CyO；wor-G4/Tm3,sb 和 867/CyO；+/Tm3,sb 以及以下每种基因型的5只雄性： +/Sp；UAS-brat/Tm3,sb，+/Sp；wor-G4/Tm3,sb 和 867/CyO；+/Dr.
      3. 交叉收集 +/CyO；UAS-brat/Tm3,sb 处女雌性 +/Sp; UAS-brat/Tm3,sb 雄性；在另一个小瓶中进行第二次杂交 +/CyO；wor-G4 /Tm3,sb 处女雌性 +/Sp；wor-G4/Tm3，sb 雄性 然后在第三个离心管中进行交叉 867/CyO;+/Tm3,sb 处女雌性与 867/CyO；+/Dr 雄性
      4. 从每次杂交的F1代中，收集具有以下基因型的雄性和雌性个体： Sp/CyO；UAS-brat/Tm3,sb 从第一次杂交开始 Sp/CyO；wor-G4/Tm3,sb 来自第二次杂交 867/CyO；Dr/Tm3,sb 来自第二次杂交。
      5. 从每个F1子代中收集兄弟姐妹进行最后一次互交，以建立所有三个品系的永久双平衡品系。
    2. 结合 UAS-brat 和 wor-G4 与 867 突变
      1. 收集足够数量（约20-30只）的处女雌蝇 867/CyO；Dr/Tm3,sb 双倍平衡品系用于进行两次杂交。
      2. 将10-15只处女雌性与约5只雄性放在一起 Sp/CyO；UAS-brat/Tm3,sb （杂交 #1）以及在第二个试剂瓶中，10-15 只处女雌蝇与约 5 只雄蝇杂交 Sp/CyO；wor-G4/Tm3,sb 雄性
      3. 收集具有以下基因型的各杂交组合F1代的兄弟姐妹： 867/CyO；UAS-brat/Tm3,sb 来自杂交 #1 和 867/CyO；wor-G4/Tm3，sb 来自杂交#2。利用每次杂交所获得的F1代子代，通过兄妹交配建立永久品系。
        注意： 完成此最后步骤后，即可制备储存液 867/CyO；UAS-brat/Tm3,sb 和 867/CyO；wor-G4/Tm3,sb 应生成.
    3. 进行挽救实验。
      1. 收集约15–20只处女雌蝇 867/CyO；wor-G4/Tm3,sb 储备液 并与来自品系的5-10只雄性小鼠交配 867/CyO；UAS-brat/Tm3,sb作为对照，选取约15-20只未交配雌蝇与 867/CyO；wor-G4/Tm3,sb 约15-20只处女雌性 867/CyO；UAS-brat/Tm3,sb 线到 867/CyO 单独一行。
        注意： 867 果蝇携带一种温度敏感型等位基因 brat 救援杂交应在 29 °C 下进行。
      2. 从每次杂交中仔细去除标记的平衡染色体，收集以下F1代子代： 867/867；wor-G4/UAS-brat （挽救） 867/867；wor-G4/+ （对照）和 867/867；UAS-brat/+ （对照）
      3. 根据需要在29 °C下培养果蝇至相应年龄，并按照第4节（方案3）所述方案对脑组织进行组织学分析，以检测神经退行性变。
  2. 对867个突变体进行年龄依赖性神经退行性分析。
    1. 收集 867；pcna-GFP 和 yw 对照果蝇，携带一个报告基因（pcna-GFP在25°C下具有活力，且在此温度下相较于单独的867品系，其神经退行性表型的外显率和表达强度均更高17.
    2. 将果蝇按第1.4节所述分别培养至5、15和25日龄，并按照第4节（方案3）的实验步骤进行后续组织学分析。

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结果

在本文中，我们介绍了用于鉴定基因的步骤 脑肿瘤 (brat在成年果蝇中对维持神经元完整性（例如，神经保护）起作用17；一种可用于鉴定参与神经保护的基因的方法。我们采用正向遗传学方法（该策略的流程如图所示） 图1A）以使用攀爬实验筛选经化学诱变的果蝇群体（本实验所用装置如图所示 图1B在235个纯合品系中，约37%的品系在10-12日龄测试时表现出低于50%的攀爬通过率（图1C）。在使用单因素方差分析（one-way ANOVA）将各测试品系的爬行通过率（CPR）百分比与所有测试品系的平均爬行百分比进行比较后，发现58%的品系表现出显著不同的爬行行为。图1D随后对爬行通过率最低的51个品系进行组织学筛选，结果显示其中29个品系的脑神经毡中可见明显空洞（程度...

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讨论

在Drosophila中进行的正向遗传筛选已被证明是鉴定参与多种生物学过程（包括年龄依赖性神经保护）基因的有效方法5,23,24,25。利用这一策略，我们成功地鉴定出brat是一个新的神经保护基因17。

本方案中的一个关键步骤是组织学分析时头部的正确摆放方向（如第4.4.3节所述）。此外，用于减数分裂定位的标记不应干扰新突变的表型（本研究中为神经退行性变）。我们建议首先进行测试，以确认所选标记本身不会引起神经退行性变。例如，Jammed (J) 会导致翅泡表型，可能会影响果蝇的攀爬能力，类似于过表达淀粉样前体蛋白（APP）且具有翅泡的果蝇26。Lobe (L) 会...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们特别感谢 Barry Ganetzky 博士，遗传筛选实验在其实验室中完成，从而实现了对神经保护基因 brat 的鉴定与表征。我们感谢 Steven Robinow 博士慷慨提供了本文所述遗传筛选中所使用的 ENU 诱变果蝇品系。我们感谢 Ganetzky 实验室的成员，包括 Grace Boekhoff-Falk 博士和 David Wassarman 博士，在本项目整个过程中提供的有益讨论；感谢 Ling Ling Ho 和 Bob Kreber 提供的技术支持；感谢 Aki Ikeda 博士提供威斯康星大学的切片机设备，以及 Kim Lackey 博士和阿拉巴马大学光学分析平台的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>主要设备
组织学用通风橱
光学显微镜尼康Eclipe E100成像的首选物镜为 20x
成像软件尼康
显微镜相机尼康
热循环仪Eppendorf
<强>果蝇推动与攀爬实验
VWR® 果蝇小瓶，窄口VWR75813-160
VWR® 通用实验室标签胶带VWR89097-912
标准小鼠垫
体视显微镜MoticModel SMZ-168
CO2 麻醉工作站（吹管、脚踏阀、Ultimate Flypad）Genesee Scientific54-104, 59-121, 59-172没有’t iinclude CO2 气罐
细头刷SOLO HORTON BRUSHES, INC.
黑腹果蝇 培养箱VWR89510-750
<强>基因定位
CantonS布卢明顿果蝇品系中心9517
w1118布卢明顿果蝇品系中心5905
yw 布卢明顿果蝇资源中心6599
黑腹果蝇 用于重组定位的品系布卢明顿果蝇品系中心3227基因型：wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3
CyO/sno[Sco] 布卢明顿果蝇品系中心2555用于重组定位的果蝇平衡染色体品系
2L号染色体缺陷试剂盒布卢明顿果蝇资源中心DK2L库克等人，2012
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乙醇（100%）赛默飞世尔科技A4094
氯仿赛默飞世尔科技C298-500
冰醋酸赛默飞世尔科技A38-500
Fisherbrand™ 优质微量离心管：1.5 mL赛默飞世尔科技05-408-129
Histochoice 透明剂 1xVWR生命科学97060-934
哈里斯苏木精VWR95057-858
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赛默飞世尔科技™ Richard-Allan Scientific™ 封片剂赛默飞世尔科技™ 411222-110-610CyO/sna[Sco]
Unifrost 多聚-L-赖氨酸载玻片，75 mm × 25 mm × 1 mm，EverMark Select PlusAzer Scientific
Fisherbrand™ 盖玻片：矩形Fisherbrand12-545M尺寸：24 mm × 60 mm
可追溯计时器VWR
载玻片加热板Barnstead International型号 26025
载玻片托盘和支架DWK生命科学用于放置20张载玻片的支架
Fisherbrand™ 通用型超长镊子Fisherbrand10-316A
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6 英寸普里敦采样拭子缅因州吉尔福德市硬木产品公司807-12
VWR® 剃刀刀片VWR55411-050
用于组织学液体的特百惠或玻璃容器16 + 1 用于流动水
高轮廓包被切片刀VWR95057-834
康宁™ 带盖圆形冰桶，4 L康宁™
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切片机Leica Biosystems
<强>分子分析
向导® SV胶回收及PCR产物纯化系统PromegaA9282
Ex Taq DNA聚合酶TaKaRa5 U/μl
Invitrogen™ SYBR™ 安全™ DNA凝胶染色剂  Invitrogen™
UltraPure™ 琼脂糖 Invitrogen™
1 Kb Plus DNA Ladder Invitrogen™
ApE—质粒编辑软件可免费下载
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R 软件包
<强>进一步分析
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]布卢明顿果蝇品系中心59967

参考文献

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