巨噬细胞吞噬凋亡胸腺细胞的实验分析

摘要

本文介绍了一种制备凋亡胸腺细胞和腹腔巨噬细胞的方案，并分析了胞葬作用的效率以及特异性抑制剂介导的对凋亡胸腺细胞吞噬的阻断效果。该方案可广泛应用于细胞介导的其他颗粒清除研究，包括人工微球和细菌等。

摘要

细胞凋亡是一种自然过程，在胚胎发育、稳态调节、免疫耐受诱导以及炎症消退中发挥关键作用。体内凋亡碎片的积累可能引发慢性炎症反应，长期可导致系统性自身免疫性疾病。凋亡细胞清除功能受损已被认为与多种自身免疫性疾病相关。凋亡清除是一个复杂的过程，在生理条件下很少被直接检测到，其过程涉及大量表面受体和信号分子。研究凋亡细胞清除过程有助于揭示其内在的分子机制及后续生物学反应，可能为新疗法的开发提供依据。本文描述了诱导胸腺细胞凋亡、制备腹腔巨噬细胞，以及通过流式细胞术和显微镜分析凋亡细胞清除的实验方案。所有细胞在特定阶段都会经历凋亡，而许多定居细胞和循环细胞均能够摄取凋亡碎片。因此，本文所述方案可广泛应用于多种细胞类型对凋亡细胞结合与内吞能力的表征研究。

引言

人体每天会产生10亿到100亿个凋亡细胞。如此大量的凋亡细胞必须被有效清除，同时保持免疫反应处于静息状态。为了确保凋亡细胞能够被及时清除，多种组织驻留细胞和循环细胞进化出了吞噬凋亡细胞的机制¹。凋亡调控功能障碍已被证实与多种炎症性疾病和自身免疫性疾病的发病及进展相关²。凋亡还在癌症发生及其对常规治疗产生耐药性的病理过程中发挥关键作用^3,4。凋亡细胞的清除通常促进抗炎反应，这可能与免疫耐受有关⁵。凋亡细胞清除过程的紊乱会引发自身免疫反应，导致人类和小鼠系统性自身免疫性疾病的发生⁶。

当细胞发生凋亡时，会将磷脂酰丝氨酸（PtdSer）从细胞膜的内小叶暴露到外小叶。随后，吞噬细胞通过其表面受体识别PtdSer。目前已发现十余种受体可识别和/或促进凋亡细胞的吞噬。总体而言，参与凋亡细胞清除的表面受体至少包括三类：锚定受体（tethering receptors），用于识别凋亡细胞；触发受体（tickling receptors），启动吞噬过程；辅助受体（chaperoning receptors），促进整个清除过程⁷。TAM受体酪氨酸激酶（TAM RTKs）包括Tyro-3、Axl和Mer，主要在免疫系统的髓系细胞中表达⁸。TAM RTKs的主要功能是作为锚定受体，促进凋亡细胞及细胞碎片的吞噬清除。本课题组多年来一直致力于研究TAM介导的凋亡细胞清除在自身免疫中的作用。维生素K依赖性蛋白生长停滞特异性蛋白6（Gas6）和蛋白S（ProS）可结合并激活TAM受体^9,10。Gas6主要在心脏、肾脏和肺中产生，而ProS主要在肝脏中生成¹¹。TAM对凋亡细胞的识别机制为：Gas6/ProS的N端结合凋亡细胞表面的PtdSer，其C端则结合锚定在吞噬细胞表面的TAM受体。在与其他受体协同作用下，最终完成对凋亡细胞的吞噬¹²。尽管Mer可同时结合配体ProS和Gas6，但我们发现Gas6似乎是介导巨噬细胞吞噬凋亡细胞的唯一配体，该过程可被抗Mer抗体所阻断¹³。巨噬细胞是专职吞噬细胞，其快速清除凋亡细胞对于抑制炎症反应以及防止针对细胞内抗原的自身免疫反应具有重要意义。Mer受体酪氨酸激酶在巨噬细胞吞噬和高效清除凋亡细胞过程中起关键作用¹⁴。在小鼠脾脏中，Mer主要表达于边缘区和生发中心巨噬细胞¹³。

本文所述方案介绍了一种诱导细胞凋亡的基本方法，并展示了检测凋亡过程及胞葬作用效率的多种手段。这些方案可轻松加以调整，用于研究其他类型细胞对不同来源凋亡细胞的吞噬作用。

方案

实验小鼠在本单位的小鼠繁育中心进行繁育和饲养。所有动物实验均依照辛辛那提大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指南进行。

1. CFSE标记的凋亡胸腺细胞的制备

1. 通过 CO₂ 处死两只未经处理的 C57/B6 小鼠₂ 吸入10分钟，解剖打开胸腔，用弯头精细镊子将胸腺取出（拉出）至含有10 mL RPMI1640培养基的组织培养培养皿中。
2. 通过将整个胸腺在两张载玻片的磨砂端之间研磨获得单细胞悬液，然后经100 μm细胞滤网过滤。
3. 将10 mL胸腺悬液收集至50 mL离心管中，于300 ×g离心 x g 5 分钟。
4. 吸除上清液，用40 mL 1×PBS重悬细胞，并用血细胞计数板进行细胞计数。
5. 300 × g 离心 x g 5 分钟后离心并移除上清液。
6. 在50 mL离心管中用20 mL 1×PBS重悬，制成单细胞悬液，细胞数量最多可达2× 10⁸ 细胞（如果超过 2 x 10⁸ 细胞，将剩余细胞重悬于另一份20 mL的1 x PBS置于另一个50 mL离心管中。
7. 在另一个50 mL离心管中，将40 μL CFSE储存液（2.5 mM）加入20 mL 1x PBS中，配制成终浓度为5 μM的CFSE溶液，并轻轻倒置管体2–3次以充分混匀。
8. 将步骤1.7中的20 mL CFSE加入步骤1.6中的20 mL细胞悬液中（此时CFSE的终浓度为2.5 μM）。
   注意：每 20 mL 细胞悬液需要一支 20 mL CFSE 管。
9. 将细胞与CFSE混合液的离心管颠倒2-3次，在室温避光条件下孵育最多2分钟，然后加入10 mL热灭活的马血清以终止反应。
10. 将50 mL离心管中的混合物在300 × g下离心 x g 室温下孵育5分钟。
    注意：如果CFSE标记成功，细胞沉淀将呈现淡黄色。
11. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于40 mL 1×PBS中，并用血细胞计数板计数细胞数量。
12. 将细胞悬液在300 × g下离心 x g 5 分钟后弃去上清液。
13. 用40 mL RPMI1640培养基再次洗涤细胞沉淀。
14. 去除上清液，用 RPMI1640 细胞培养基（RPMI1640，20 mM HEPES，10% FBS（热灭活），20 mM 谷氨酰胺，1×青霉素/链霉素）重悬细胞，细胞浓度为 7 × 10⁶ 细胞/mL，置于100 mm组织培养皿中。
    注意：如果获得的细胞更多，则需要另用一个100 mm的组织培养皿。
15. 向细胞悬浮培养液中加入星形孢菌素，使其终浓度为 1 μM，在含 5% CO₂ 的组织培养孵箱中于 37 °C 培养 4 小时₂.

2. 腹腔巨噬细胞的制备

1. 在第0天，对两只C57B6小鼠（或实验室中任何基因改造小鼠）进行腹腔注射，每只注射1 mL 3%的陈化硫代甘油酸盐溶液。
2. 在第5天按步骤1.1实施安乐死，剪开并剥离腹部皮肤，但保持腹膜完整。使用连接18 G针头的10 mL注射器，将10 mL洗涤缓冲液（RPMI1640，2% FBS，0.04% EDTA）快速推入腹腔，冲洗腹腔。
3. 用同一针头/注射器缓慢回收冲洗液，并将冲洗液收集至50 mL离心管中（详细步骤参见Janssen实验室文章¹⁵）。
4. 用1×PBS洗涤腹腔灌洗液两次，将腹腔巨噬细胞重悬于RPMI1640培养基中，细胞密度为2 × 10⁶ 个细胞/mL，每孔分装500 μL至24孔板中。将培养板置于组织培养孵育箱中孵育2小时。
5. 通过吸除并更换新鲜培养基两次，每次500 μL，去除未贴壁的悬浮细胞。
6. 可选：根据图注中指示的浓度，向巨噬细胞培养各孔中加入TAM受体酪氨酸激酶抑制剂RXDX-106，并继续孵育2小时。

3. 腹腔巨噬细胞与凋亡胸腺细胞的共培养

1. 从步骤1中收集凋亡胸腺细胞，并用RPMI1640培养基洗涤三次。此时可使用Annexin V/7-AAD试剂盒检测凋亡诱导效率。
2. 根据实验设计，将0 - 12 × 10⁶ 个细胞（溶于500 μL培养基）分别加入第2号方案所得的巨噬细胞培养孔中（例如参见图1），使每孔总体积达到1 mL。在加入凋亡胸腺细胞前，立即向培养物中加入阻断抗体。
3. 将细胞混合物置于含5% CO₂的组织培养孵箱中，37 °C培养4小时。
4. 用含500 μM EDTA的1× PBS洗涤培养孔两次，以去除未贴壁的凋亡细胞。
5. 在此阶段，对贴壁巨噬细胞进行CD11b-PE染色。
   1. 用染色缓冲液（1× PBS，1% BSA）洗涤贴壁巨噬细胞一次。
   2. 向每孔中加入含2 μL CD11b-PE的200 μL染色缓冲液。
   3. 将培养板置于4 °C孵育20分钟。
   4. 用染色缓冲液洗涤每孔三次。
   5. 每孔加入200 μL染色缓冲液，随后在荧光显微镜下进行图像分析。
6. 或者，可通过向培养孔中加入1 mL含1%利多卡因的PBS溶液，并在37 °C孵育10分钟，使贴壁巨噬细胞脱落。
7. 通过反复吹打使贴壁巨噬细胞脱落。
8. 将每孔的巨噬细胞悬液转移至独立的5 mL圆底FACS管中。
9. 以300 × g离心5分钟。
10. 弃去上清液，向每管中加入含2 μL CD11b-PE（在染色缓冲液中按1:200稀释）的200 μL染色缓冲液。
11. 将细胞悬液在染色缓冲液中4 °C孵育20分钟。
12. 用染色缓冲液洗涤细胞悬液两次。
13. 加入200 μL染色缓冲液，随后使用流式细胞仪进行FACS分析，并检测CFSE阳性巨噬细胞的百分比。

结果

腹腔巨噬细胞介导的凋亡胸腺细胞吞噬作用分析。 按照本实验方案所述方法制备腹腔巨噬细胞和凋亡细胞，并进行共培养。将巨噬细胞剥离后，在冰上用PE标记的抗CD11b抗体染色20分钟。随后洗涤巨噬细胞，并通过流式细胞仪进行检测。如图所示，当培养体系中未加入凋亡细胞时，右下象限中无CFSE阳性巨噬细胞（图1A 和 图2，第一面板）。经巯基乙酸盐刺激获得的腹腔巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬能力存在差异。在本实验中，最多有30%的巨噬细胞在CFSE通道呈阳性，表明其已摄取了CFSE标记的凋亡细胞（图1）。值得注意的是，CFSE阳性巨噬细胞在右下象限呈弥散分布，这是由于荧光强度不同所致，提示巨噬细胞内所含凋亡细胞的数量存在差异。因此，通过显微镜观察巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬情况，对于评估巨噬细胞吞噬能力至关重要（图2）。提高凋亡细胞与巨噬细胞的比例，不仅可增...

讨论

细胞凋亡是一种高度保守的细胞死亡过程，涉及多种信号级联反应，并可诱导蛋白质的表达、分泌和转运。细胞凋亡常伴随细胞形态学的改变¹⁷。凋亡细胞会主动释放细胞因子和趋化因子，吸引吞噬细胞迁移至该部位并启动吞噬过程，这是一个在严密调控下的极为复杂的通路¹⁸。另一方面，坏死性细胞死亡会释放危险信号，从而触发炎症反应¹。若凋亡细胞的清除存在缺陷或延迟，将导致这些细胞发生继发性坏死¹⁹。因此，在实验中诱导凋亡的时机非常关键。诱导细胞凋亡的方法有多种²⁰，但诱导的持续时间和强度因细胞类型而异。我们建议设置梯度实验，以确定产生最大凋亡率（90–95%）的最佳条件。本实验室使用Annexin-V/7-AAD凋亡检测试剂盒，并严格按照说明书操作，以评估凋亡效率。过去，本实验室曾尝试两种不同的方法诱导胸腺细胞凋亡。γ射线照射似乎是更优的方法，因其在培养体系中无化学残留，且诱导的坏死性细胞死亡较少。我们将胸腺细胞暴露于500 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
红细胞裂解缓冲液	GIBCO	A10492
Annexin V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
抗Mer抗体	R&D Systems	BAF591
CD11b-PE（克隆M1/70）	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA（0.5 mM）	GIBCO	15575-020
FACS管	BD Biosciences	352017
磨砂载玻片	Fisher Scientific	12-552-343
马血清（热灭活）	Invitrogen	26050088
利多卡因	Sigma-Aldrich	L-5647	用1×PBS配制1%缓冲液
PBS，1×	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
星形孢菌素（100 mg）	Fisher Scientific	BP2541-100	将100 mg星形孢菌素溶于214.3 ml DMSO中，配制成1 mM储存液
改良布氏硫代甘油酸盐培养基	BD Biosciences	243010	用1´PBS配制3%硫代甘油酸盐缓冲液，经高压灭菌后避光保存3个月。