方法文章

通过甲基磺酸乙酯诱变法创制小粒谷类作物基因组定点诱导局部突变（TILLING）群体

11.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59743

⸱

2019年7月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Science and Landscape Architecture, University of Maryland, College Park

本文内容

摘要

本文描述了一种利用甲基磺酸乙酯（EMS）作为诱变剂，在小粒谷类作物中建立基因组定点诱导局部突变（TILLING）群体的实验方案。同时提供了一种使用Cel-1酶切法进行突变检测的实验方法。

摘要

靶向诱导基因组局部突变（TILLING）是一种强大的反向遗传学工具，包括化学诱变以及对目标基因序列变异的检测。TILLING 是一种极具价值的功能基因组学工具，特别适用于转化技术存在严重局限的小粒谷类作物中的基因功能验证。构建一个稳定的诱变群体是决定基于 TILLING 的基因验证研究效率的关键。若 TILLING 群体的整体突变频率过低，则需要筛选极大规模的群体才能获得目标突变；而若诱变剂浓度过高，则会导致群体死亡率过高，从而无法获得足够数量的诱变个体。在成功构建有效群体后，可通过多种方法检测目标基因的突变，平台的选择取决于实验规模和资源的可及性。利用 Cel-1 酶切分析结合琼脂糖凝胶电泳进行突变体鉴定的方法具有操作简便、可重复性强且资源需求较低的优点。该方法无需复杂的计算知识，尤其适用于在基础实验设备条件下对少量基因进行验证。本文详细描述了构建优质 TILLING 群体的方法，包括剂量曲线的制备、诱变处理与突变群体的保种，以及利用基于 PCR 的 Cel-1 酶切分析对突变群体进行筛选的技术流程。

引言

基因组中的点突变可为研究人员提供多种有用的功能。根据其性质和位置，这些突变可用于赋予基因功能，甚至确定目标蛋白的不同结构域的功能。另一方面，作为新型遗传变异的来源，可通过表型筛选选择具有理想性状的有益突变，并进一步用于作物改良。TILLING 是一种强大的反向遗传学工具，包括化学诱变以及对目标基因中序列变异的检测。该技术最初在Arabidopsis1和Drosophilia melanogaster2中建立，随后已在多种小粒谷类作物中构建并应用了 TILLING 群体，例如六倍体面包小麦（Triticum aestivum）3、大麦（Hordeum vulgare）4、四倍体硬粒小麦（T. dicoccoides durum）5、二倍体小麦（T. monococcum）6以及小麦的"D"基因组供体Aegilops tauschii7。 这些资源已被用于验证基因在调控非生物和生物胁迫耐受性8、调控开花时间9以及培育营养品质更优作物品种5中的作用。

TILLING 技术结合使用烷化诱变剂（如甲基磺酸乙酯（EMS）、叠氮化钠、N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）和甲基磺酸甲酯（MMS）），相较于其他反向遗传学工具具有多项优势。首先，诱变几乎可在任何物种或植物品种中进行10，且不受转化效率瓶颈的限制，这一点对于小粒谷物尤为重要，因其转化尤为困难11。其次，除可产生其他基因验证方法也能获得的基因敲除突变外，TILLING 还可诱导产生一系列错义突变和剪接位点突变，有助于解析目标蛋白各个结构域的功能12。此外，TILLING 能在整个基因组范围内产生永久性的突变资源库，因此单个突变群体可用于多个基因的功能验证。相比之下，其他反向遗传学工具所产生的资源仅针对所研究的特定基因13。通过 TILLING 鉴定出的有益突变可用于育种，且不受监管限制，而基因编辑技术是否属于非转基因范畴在许多国家仍不明确。这一点对于国际贸易的小粒谷物尤为关键14。

TILLING 是一种简单且高效的基因验证策略，需要构建诱变群体以研究目标基因。构建一个高效的诱变群体是决定基于 TILLING 的基因验证研究效率的关键。若 TILLING 群体的整体突变频率过低，则需要筛选极大规模的群体才能获得目标突变，这在实际操作中难以实现；而若诱变剂浓度过高，则会导致群体死亡率升高，获得的诱变个体数量不足。一旦构建出优良的群体，即可采用多种方法检测目标基因中的突变，具体平台的选择取决于实验规模和资源可及性。全基因组测序和外显子组测序已被用于表征小基因组植物 TILLING 群体中的全部突变15,16。两种小麦（普通小麦和硬粒小麦）的 TILLING 群体已开展外显子组测序，相关数据已公开，可供研究人员识别理想突变并申请获取感兴趣的突变品系17。这为获取理想突变提供了重要的公共资源；然而，在基因验证研究中，野生型亲本必须含有目标候选基因。遗憾的是，针对另一遗传背景下的少数候选基因进行基于反向遗传学的验证时，对整个 TILLING 群体进行外显子组测序仍因成本过高而难以普及。扩增子测序和基于 Cel-1 的检测方法已被用于小麦靶向群体中的突变检测，其中 Cel-1 检测操作更简便，无需计算分析知识，特别适用于仅具备基础实验设备条件下对少量基因进行验证6,18。

本文介绍了一种优良TILLING群体的构建方法，包括剂量曲线的制备、诱变处理与突变群体的保种、以及利用基于PCR的Cel-1酶切法对突变群体进行筛选。该方案已成功应用于突变群体的构建与利用 Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, 大麦， 粗山羊草7以及若干其他方法。文中包含了这些方法的具体细节，以及有助于研究人员利用EMS作为诱变剂，在任何选定的小粒谷类植物中构建TILLING群体的实用技巧。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 有效诱变剂量曲线的制备

  1. 将100粒目标基因型的种子分别放入六个250 mL的玻璃烧瓶中（每个烧瓶100粒），每瓶加入50 mL蒸馏水浸泡。在室温（RT）下以100 rpm振荡8小时，使种子充分吸胀。
  2. 在通风橱中，分别将0.167、0.249、0.331、0.415和0.498 mL的甲基磺酸乙酯（EMS）溶于蒸馏水中，配制50 mL的0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%（w/v）EMS溶液。
    注：EMS在室温下为液体，密度为1.206 g/mL。
    注意：操作EMS时需佩戴适当的个人防护装备（PPE）。
  3. 倒去其中五个烧瓶中的水，向每个含有吸胀种子的烧瓶中分别加入50 mL EMS溶液，共设置六个不同处理组，分别为0.0%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2% EMS溶液。将烧瓶在室温下以75 rpm振荡16小时。
  4. 倒去EMS溶液，用纱布分别收集各处理组的种子。通过加入等体积的EMS失活液（0.1 M NaOH，20% w/v Na2S2O3）处理废液24小时以使其失活。同时，被污染的烧瓶和移液器吸头也需用EMS失活液处理24小时。
  5. 将经EMS处理的种子在流动的自来水下冲洗2小时。将每粒种子单独移栽至装有育苗土的育苗钵中。
  6. 在20–25 °C、16小时光照周期条件下培养植株。
  7. 记录移栽后15天的植株存活数据。使用以下公式计算各处理组的存活率：
    figure-protocol-1
    注：若对照组的萌发率低于100%，则应先扣除对照组中未萌发的种子数，再计算各处理组的准确存活率。理想的诱变效果对应的存活率为40%–60%。可根据处理种子的存活情况，调整浓度进行第二轮剂量优化，直至达到理想的致死率范围（40%–60%）。

2. 诱变及突变群体的保种

  1. 将至少3,000粒种子均分为五份（每份600粒），分别浸泡于五个含有300 mL蒸馏水的1,000 mL锥形瓶中。于室温下以100 rpm振荡处理8小时，以促进吸胀。
    注意：目标群体的最终规模取决于基因型的突变频率和倍性水平，但建议六倍体至少使用 3,000 粒种子，四倍体使用 4,000 粒种子，二倍体使用超过 7,000 粒种子。
  2. 在通风橱中，用蒸馏水配制 1,500 mL 优化浓度的 EMS 溶液。
  3. 将烧瓶中的水倒出，向每个含有600粒吸胀种子的烧瓶中加入300 ml最适浓度的EMS溶液。在室温下以75 rpm振荡16小时。
  4. 将EMS倒出，并用纱布收集处理过的种子。使用EMS失活溶液对EMS溶液及处理容器进行失活，操作同步骤1.4。
  5. 用流动的自来水冲洗经EMS处理的种子2小时。将每粒经EMS处理的M1 将种子单独播种到育苗盆中。
  6. 培养 M1 植物（源自 M0 种子）在 20–25 °C 在16小时光照周期下。
    注意：可能需要在两叶期对幼苗进行6周的春化处理 4 °C，如果目标基因型具有冬季型生长习性。
  7. 让 M1 植物自花授粉，并收获M2 每株可育 M 单独收获种子1 植物
    注意：为避免可能的异花授粉，用套袋覆盖 M 的穗1 开花前用授粉袋套住植株。
  8. 种植一株 M2 每株M的种子1 植物以避免基因冗余。
  9. 从M收集组织2 在96孔架式微量离心管（每管1.1 mL）中取两叶期植株的叶片组织，每株采集约80 mm的叶片组织，并在组织取样记录表中登记各样本的编号。
  10. 使用冷冻干燥机对叶片组织进行冻干，并于 -80 °C.
  11. 维持 M2 20–的植物25 °C 在16小时光照周期下。
  12. 记录M突变体的表型数据2 定期观察植株。预期的表型包括白化、黄绿叶、草状茎、花斑叶、部分可育、不育等。
  13. 让 M2 植株自交并成熟后，分别收获并保存M3代种子2 植物（图1).
    注意：M代种子用于反向遗传学研究中表型的验证，因此应仔细编目，并在阴凉干燥条件下妥善保存。或者，若需在田间扩增种子，可为每株M代植株设置单株成行种植，分别收获并单独保存每行产生的M代种子，作为TILLING群体资源。

3. 用于突变体遗传学表征的 Cel-1 检测

  1. 使用植物DNA提取试剂盒（配备DNA纯化系统，参见材料表），按照制造商推荐的方法从M2代叶片组织中提取DNA。
  2. 使用分光光度计对DNA进行定量，并用无核酸酶水将DNA浓度标准化至25 ng/µL，置于96孔板中。
    注意：必须通过凝胶电泳检测DNA质量，因为低质量DNA（呈弥散条带）可能导致混合样品中出现假阴性结果。
  3. 通过将四个96孔板中的DNA合并至一个新板中，构建4倍DNA混合池，同时保持各样本的行列位置信息不变。向混合板的每个孔中加入来自单个样本的50 µL DNA，使每个混合板孔中总共含有来自四个不同96孔板的200 µL DNA。
  4. 以混合板-行-列格式记录混合DNA的身份信息（例如，Pool 1 A1 = Box1A1 + Box2A1 + Box3A1 + Box4A1）。
  5. 针对目标基因，使用Genome Specific Primers (GSP) 网页工具 <https://probes.pw.usda.gov/GSP>（多倍体物种使用默认设置）设计基因组特异性引物[A1]。对于二倍体物种，使用Primer 3工具 <http://primer3.ut.ee/>（采用默认设置）设计引物。如需覆盖目标基因的完整编码区，可设计多个引物。
    注意：可利用IWGSC最新基因组组装数据，通过URGI BLAST工具 <https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/BLAST> 获取小麦中目标基因的序列。理想扩增片段长度范围为800–1,500 bp。表1列出了在六倍体小麦中针对waxy基因设计引物的示例。
  6. 对混合DNA进行基因特异性引物的PCR扩增，步骤如下：
    1. 加入5 µL PCR缓冲液、各2 µL的4 µM正向和反向引物、0.1 µL DNA聚合酶（参见材料表）、5 µL混合DNA模板，再用无核酸酶水补足至总体积25 µL。
    2. 在PCR仪上采用降落PCR程序进行扩增：95 °C预变性1 min；进行7个循环，每循环为95 °C变性1 min，退火温度从67 °C逐步降至60 °C（每循环降低1 °C），72 °C延伸2 min；随后进行30个循环，每循环为95 °C 1 min、60 °C 1 min、72 °C 2 min；最后在72 °C延伸7 min。
      注意：上述PCR程序适用于大多数采用Primer 3默认设置设计的引物对小麦DNA模板的扩增。若出现非特异性扩增，应在进入下一步前优化并提高PCR条件的严谨性。
  7. 通过在PCR仪中孵育PCR产物以形成错配DNA的异源双链，程序如下：95 °C 2 min；进行5个循环，每循环为95 °C 1 s，然后从95 °C降至85 °C（每循环降低2 °C），保持1 min；再进行60个循环，从85 °C逐步降至25 °C（每循环降低1 °C）。
  8. 向已形成异源双链的PCR产物中加入2.5 µL自制的Cel-1核酸内切酶，在45 °C孵育45 min。加入2.5 µL 0.5 M EDTA（pH 8.0）以终止Cel-1反应。
    注意：Cel-1核酸内切酶可通过Till等19报道的方法从新鲜芹菜茎中提取。测试Cel-1核酸内切酶的活性及其最适用量至关重要，可使用已知突变体或市售突变检测试剂盒进行验证。
  9. 将经Cel-1处理的产物在3.0%琼脂糖凝胶中以100 V电压电泳2.5小时。含有除全长未切割条带外还出现较小且独特切割条带的孔，即含有突变DNA样本。
  10. 解码突变混合池。
    1. 对在步骤3.9中鉴定出的突变混合池所包含的各个M2代DNA样本，重复执行步骤3.6、3.7、3.8和3.9。
    2. 为确定突变体的纯合性，对单个M2代DNA样本进行两组PCR反应（方法同步骤3.6）：第一组反应包含2.5 µL M2代DNA和2.5 µL野生型DNA，第二组反应仅包含5 µL M2代DNA。若突变为杂合状态，则两组反应中均会出现额外的切割条带；若为纯合突变，则仅在第一组反应中出现额外切割条带。
  11. 为确定突变的具体性质，使用Sanger测序平台对已确认的突变体PCR产物进行测序，并遵循制造商的操作说明。

4. 突变频率的计算

注意：TILLING 群体的突变频率是指该群体个体基因组中发生一次突变的平均物理距离。例如，TILLING 群体中 1/35 kb 的突变频率意味着该群体中单个个体的基因组每 35 kb 就含有一个突变。

  1. 为确定TILLING群体的突变频率，需计算被筛查的总碱基数。
  2. 为计算被筛查的总碱基数，将PCR产物长度乘以被筛查的个体总数。
  3. 用被筛查的总碱基数除以观察到的独有突变数量，使用以下公式计算，结果表示该TILLING群体中每多少碱基区域含有1个突变：
    figure-protocol-2
    注意：由于基于琼脂糖凝胶平台在两端各存在约50 bp的分辨率限制，计算时应在产物长度中减去100 bp。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

图2展示了六倍体普通小麦品种Jagger、二倍体小麦Triticum monococcum6以及小麦基因组供体Aegilops tauschii7的剂量反应曲线。为达到理想的50%存活率，T. monococcum、Ae. tauschii和T. aestivum所需的EMS剂量分别约为0.25%、0.6%和0.7%。六倍体小麦较高的EMS耐受性归因于其基因组的缓冲能力。然而，尽管同为二倍体，T. monococcum对EMS的耐受性几乎仅为Ae. tauschii的一半。因此，这些结果强调了为特定基因型确定合适EMS剂量的重要性。

M中存在易于识别的表型2

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

TILLING 是一种极具价值的反向遗传学工具，可用于基因功能验证，尤其适用于转基因方法存在严重瓶颈的小粒谷物11。构建具有高突变频率的诱变群体是开展功能基因组学研究的关键步骤之一。建立高效 TILLING 群体最重要的步骤是确定 EMS 的最佳浓度。在小麦和大麦中，M1 代植株 40%–60% 的存活率已被证明是评估 EMS 诱变效果的良好指标4,6,18。存活植株可提供足够的突变频率，有助于发现任何目标基因中的突变。在水稻中，除 M1 代植株的存活率外，M1 植株的育性是另一个决定因素，且据报道在不同基因型间存在差异20。

由于多倍性，六倍体普通小麦和四倍体硬粒小麦在大多数基因上每个基因组都具有同源等位基因，从而能够补偿因突变导致的重...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本研究由美国农业部国家食品与农业研究所Hatch项目（项目号1016879）以及马里兰农业实验站通过MAES资助项目（项目号2956952）提供支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔 1.1 ml 微管（置于微管架中）National ScientificTN0946-08R用于采集叶片组织
琼脂糖 I（生物技术级）VWR0710-500G
Biosprint 96 植物 DNA 试剂盒Qiagen941558DNA 提取试剂盒
Cel-1 核酸内切酶按 Till 等人 2006 年所述方法提取单链特异性核酸内切酶
Centrifuge 5430 R 离心机Eppendorf
甲基磺酸乙酯Sigma AldrichM-0880-25GEMS，化学诱变剂
冷冻干燥/壳式冷冻系统Labconco用于叶片组织的冻干处理
Kingfisher Flex 核酸纯化系统Thermo Fisher Scientific5400610高通量 DNA 提取机器人系统
My Taq DNA 聚合酶BiolineBIO-21107
无核酸酶水Sigma AldrichW4502-1L
NuGenius 凝胶成像系统Syngene
Orbit Environ-shaker 摇床Lab-line
SPECTROstar Nano 全波长微体积分光光度计BMG LABTECH用于 DNA 定量的 NanoDrop 类型仪器
T100 热循环仪BIO-RAD1861096

参考文献

  1. McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
  2. Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).
  3. Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
  4. Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
  5. Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
  6. Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205(2012).
  7. Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
  8. Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
  9. Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
  10. Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
  11. Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
  12. Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
  13. Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115(2009).
  14. Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
  15. Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
  16. Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
  17. Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268(2017).
  18. Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
  19. Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
  20. Wu, J. -L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
  21. Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
  22. Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
  23. Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
  24. Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
  25. Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. Tilling by Sequencing. Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

TILLING EMS Cel 1 DNA PCR

相关文章