由单体生成α-突触核蛋白预制纤维及其在体内的应用

摘要

本文的目的是概述由单体α-突触核蛋白生成纤维、后续质量控制以及在体内使用预先形成的纤维的步骤。

摘要

体内α-突触核蛋白预形成纤维（α-syn PFF）突触核蛋白病模型正日益受到研究人员的青睐，用于模拟帕金森病的突触核蛋白病及黑质纹状体变性。为了确保α-突触核蛋白病理变化的一致性和可重复性，标准化α-syn PFF的制备及体内应用至关重要。本文提供了一项详细的实验方案，涵盖从单体α-syn蛋白生成纤维、纤维化后的质量控制步骤，以及将α-syn PFF成功注射至大鼠或小鼠脑内的建议参数。从单体α-syn蛋白开始，在最佳缓冲条件、蛋白浓度和温度下持续震荡孵育7天，即可完成纤维化过程。纤维化后的质量控制包括：通过沉降实验检测可沉淀纤维的存在，利用硫黄素T（thioflavin T）检测纤维是否形成淀粉样构象，以及通过电子显微镜观察纤维的形态。尽管上述检测的成功验证是必要前提，但仍不足以保证PFF能够在神经元中诱导α-syn包涵体的形成，因此每批PFF的促聚集活性应在细胞培养或预实验动物群体中进行测试。使用前，PFF必须在严格标准化的条件下进行超声处理，随后通过电子显微镜或动态光散射检测，确认纤维长度处于最佳尺寸范围，平均长度约为50 nm。处理后的PFF可直接加入细胞培养基中，或用于动物实验。在细胞培养和啮齿类动物模型中，分别于数天至数周后可通过免疫染色检测到磷酸化α-突触核蛋白（psyn；丝氨酸129位点）所显示的病理变化。 

引言

帕金森病（PD）在死后主要表现为两大病理特征：广泛的进行性α-突触核蛋白（α-syn）病理改变，以及黑质纹状体变性。将α-突触核蛋白预制纤维（PFFs）注射到野生型小鼠或大鼠体内后，可诱导病理性α-syn的进行性积聚，导致数月内黑质致密部（SNpc）多巴胺能神经元的慢性变性，以及感觉运动功能障碍^1,2,3,4,5,6。神经元可通过直接颅内注射或加入培养基的方式暴露于α-syn纤维。当PFFs被神经元摄取后，会通过模板机制“种子”内源性α-syn聚集，形成磷酸化包涵体^1,7,8,9。这些包涵体具有类似于路易小体的特性：包含在丝氨酸129位点磷酸化的α-syn（pSyn）、泛素和p62；经硫黄素染色呈阳性，显示其具有淀粉样蛋白四级结构；并对蛋白酶K消化具有抗性^{1,3,5,7,8,9,10,11,12}。PFF暴露可在原代神经元及部分永生化神经元培养模型中诱导α-syn包涵体形成，也可在小鼠、大鼠和非人灵长类动物的活体模型中实现^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,13}。需要注意的是，并非所有细胞培养模型都会因PFF暴露而形成α-syn包涵体，不同神经元培养体系的“种子”效率也存在差异。

另一个重要的特征是体内 α-突触核蛋白PFF模型的显著特征是在数月内出现明确的阶段性病理变化。在啮齿类动物中，经纹状体内注射后， α-syn 包涵体的形成通常在 1 至 2 个月内于黑质致密部及多个皮层区域达到高峰。此聚集高峰随后伴随出现黑质纹状体变性。 ≈2-4 个月后^1,3,5。这些不同的病理阶段为研究人员提供了研究和开发策略的平台，以 1）减少 αα-syn 聚集，2）清晰可见的已形成 α-突触核蛋白包涵体，和/或 3）阻止后续的神经退行性变。与神经毒物、转基因及病毒载体介导的模型相比，PFF 模型具有独特的优缺点 αα-syn 过表达模型，如先前综述所述⁶采用何种模型或方法应由研究者所提出的问题决定，选择最适合该科学问题的模型。

尽管许多实验室已成功应用PFF模型，但仍有一些研究团队在制备纤维及产生一致的α-突触核蛋白病理方面遇到了不一致的问题¹⁴。这些问题包括：某些PFF几乎不产生或完全不产生α-突触核蛋白病理、不同批次间种子效应效率的差异，甚至出现纤维无法形成的情况。因此，为了能够准确评估新型治疗干预措施的影响，对α-突触核蛋白预形成纤维（PFF）的制备及其在体应用进行标准化至关重要。以下方案详细说明了从α-突触核蛋白单体生成PFF的步骤、PFF形成后的体外质量控制、使用前对PFF进行超声处理和测量的方法，以及促进PFF在大鼠或小鼠体内成功注射的建议。

方案

所有涉及动物的实验方法均已获得密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 由单体形成α-突触核蛋白预制纤维（图1）

1. 将α-突触核蛋白单体在冰上解冻，轻轻弹击离心管使其重悬，并在4 °C下以15,000 × g离心10分钟。
   注意：α-syn单体必须专为纤维化设计。重组单体可从商业来源购买，或通过现场实验方案制备^4,9,14,15。若从商业来源购买，产品说明必须明确指出该α-syn单体适用于纤维生成。无论单体为购买或现场制备，每批均应执行下述质量控制步骤，以确保纤维已形成并在实验使用前具备有效接种能力。
2. 将上清液转移至洁净的1.5 mL微量离心管中，并记录转移体积。
   注意：操作时需小心避免触及沉淀，若存在沉淀，通常体积较小。
3. 通过标准双辛可宁酸法（BCA）或使用微量分光光度计测定280 nm处吸光度，测定转移上清液的蛋白浓度。
   注意：BCA法对α-syn的特异性测定不够准确，可能导致蛋白浓度高估。因此，推荐使用280 nm吸光度法测定蛋白浓度。
   1. 若采用BCA法测定，请遵循标准BCA操作流程，并对α-syn单体进行三种不同稀释度的检测。建议稀释度为1:25、1:50和1:100。
   2. 若采用A280法测定，使用无钙镁的无菌1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（dPBS），盐浓度约为100 mM NaCl，pH范围为7.0–7.3，对仪器进行空白校准（材料表）。
   3. 向仪器中加入2 µL样品，读取280 nm处的吸光度。
   4. 使用比尔-朗伯定律计算单体浓度。
      
      注意：人源α-syn的消光系数ε为5,960 M^-1cm^-1，小鼠α-syn为7,450 M¹cm^-1。光程以cm为单位。α-syn的分子量（14 kDa）按1 Da = 1 g/mol估算。
4. 用1× dPBS将单体稀释至终浓度5 mg/mL。使用下述公式计算所需添加的1× dPBS体积。
   
   注意：所有浓度单位为mg/mL，体积单位为µL。单体稀释应使用1× dPBS。用于生成纤维的总体积应在100至500 µL之间，以获得可重复的纤维化结果。
5. 短暂涡旋混匀，离心使所有液体聚集于管底。按步骤1.8.1–1.8.4所示，分装单体用于后续与纤维的质量对照比较。
6. 使用管盖锁或石蜡/塑料封膜（材料表）将微量离心管管盖密封固定。
7. 将离心管置于带盖的轨道式恒温混匀仪中，在37 °C、1,000 RPM条件下振荡7天（材料表）。
   注意：7天结束后，管内内容物应呈现浑浊状态。恒温混匀仪必须带盖，以防止管盖上形成冷凝水。
8. 轻轻弹击离心管以重悬α-syn纤维。按步骤1.8.1–1.8.4所示，分装纤维用于以下质量控制步骤。
   注意：用于质量控制的纤维可在室温下保存过夜。
   1. 分装6 µL用于沉降实验。
   2. 分装5 µL用于硫黄素T结合实验。
   3. 分装2 µL用于透射电子显微镜观察纤维形态。
   4. 至少分装10 µL用于内毒素检测。
      注意：内毒素检测使用市售的鲎试剂（LAL），按照制造商说明书操作（材料表）。纤维的内毒素水平应≤0.5 内毒素单位/mL。若未达标，可使用内毒素去除试剂盒进行处理。
9. 将剩余纤维分装并储存。如需长期保存（12–18个月），应迅速在干冰上冷冻，并于-80 °C保存。
   注意：分装体积取决于后续应用需求。体内实验通常比体外实验需要更高浓度和更多量的纤维，因此应据此规划分装体积。纤维应存放于冰箱后部，以避免因潜在的冻融循环造成损伤。本方案可在此处暂停。

2. 沉降实验

1. 在干净的微量离心管中，将 6 µL PFF 加入 54 µL dPBS 中，使纤维稀释至 1:10，用移液器吹打混匀。
   1. 在另一管中，将 6 µL 单体加入 54 µL dPBS 中，作为额外对照。
2. 在室温下以 10,000 × g 离心样品 30 分钟，将上清液转移至新的干净微量离心管中。
3. 向剩余沉淀中加入 60 µL dPBS，涡旋振荡以重悬。
4. 向每管中加入 30 µL 3× 上样缓冲液（140 µL 50% 甘油/0.1% 溴酚蓝，40 µL 10% SDS，以及 20 µL β-巯基乙醇），涡旋振荡混匀。
5. 在 100 °C 孵育样品 10 分钟，随后置于冰上冷却 5 分钟。
6. 采用标准的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方案按分子量分离蛋白质。使用包含 14 kDa 范围的蛋白 Marker（预期为单体 α-syn 的条带大小）。
7. 将凝胶转移至染色皿中，加入足量考马斯亮蓝染液（0.1% 考马斯亮蓝，20% 甲醇（v/v），10% 乙酸（v/v），溶于 ddH₂O）覆盖凝胶，室温摇动孵育 3 小时。
8. 倒去考马斯亮蓝染液，加入足量脱色液（50% 甲醇（v/v），10% 乙酸（v/v），溶于 ddH₂O）覆盖凝胶，室温摇动孵育 30 分钟。
9. 倒去脱色液，并重复脱色步骤，直至背景清晰、条带可见。
10. 用 ddH₂O 摇动洗涤凝胶 3 次，每次 5 分钟，然后成像。

3. 用于纤维可视化观察的透射电子显微镜技术

1. 称取20 mg醋酸铀酰于微量离心管中，加入1 mL ddH₂O₂O 配制 2% 的水溶液。涡旋振荡直至乙酸铀酰完全溶解，并静置过夜。
   注意：醋酸铀酰溶液应在透射电子显微镜样品制备前一天配制。光照或震荡可导致醋酸铀酰沉淀，因此含有醋酸铀酰溶液的离心管应包裹铝箔，置于避光处，且在醋酸铀酰溶解后避免摇动。
2. 向98 µL dPBS中加入2 µL PFF，使纤维稀释至1:50，然后用移液器混匀。
3. 准备一张干净的石蜡/塑料薄膜（材料表）覆盖实验台面（约50 mm × 50 mm）。将洁净的石蜡/塑料膜（材料表），添加以下内容（图2).
   1. 加入4个10 µL的ddH₂O液滴₂O.
   2. 加入1 × 10 µL稀释后的纤维或单体样品液滴。
   3. 加入2滴，每滴10 µL的2%醋酸铀溶液。
4. 使用尖头镊子夹取一个经甲醛/碳膜包被的铜网透射电子显微镜载网（材料表).
   注意：务必仅捏住载网的边缘部分，避免接触中心的网格区域（图2A如果镊子接触到网格，会使聚乙烯醇缩醛/碳涂层薄膜受损，导致该区域的网格无法成像。
5. 将铜网的聚乙烯醇/碳支持膜面（光面）朝下漂浮于第一滴去离子水上₂O. 用镊子轻轻夹住载网并向下轻压，确保整个包被表面与ddH₂O充分接触。₂O. 让载网漂浮1分钟。
6. 用镊子夹起载网，不要触碰载网的网格部分，用滤纸从侧面吸去多余的 ddH₂O₂用滤纸处理。
7. 将载网如上所述漂浮于第二滴ddH₂O上₂O 持续1分钟，用滤纸吸去ddH₂O₂O.
8. 将载网漂浮于稀释后的纤维液滴上1分钟，然后如上所述用滤纸吸去多余液体。
9. 将载网在第一滴醋酸铀酰溶液上漂浮1分钟，用滤纸吸去多余液体。
10. 将载网在第二滴醋酸铀溶液上漂浮1分钟，用滤纸吸去多余液体。
11. 将载网如上所述漂浮于第三滴ddH₂O上₂O 短暂地吸去 ddH₂O₂O.
12. 像上述操作一样，将载网漂浮在第四滴ddH₂O上₂O 短暂地吸去 ddH₂O₂O，务必尽可能去除大部分 ddH₂尽可能快。
13. 转移至网格盒中保存，直至成像。
    注意：载网在成像前应干燥至少5分钟。载网制备后至少一年内均可进行成像，期间应保存在干燥环境中。

4. 硫黄素T检测

1. 在洁净的微量离心管中，将 5 µL PFF 加入 245 µL dPBS 中，使纤维稀释至 1:50，用移液器混匀。
2. 在另一微量离心管中加入 250 µL dPBS，作为阴性对照。
3. 将 5 µL 单体加入 245 µL dPBS 中，作为单体对照。
4. 向每个样品中加入 250 µL 甘氨酸缓冲液中的硫黄素 T（25 µM 硫黄素 T，100 mM 甘氨酸，1% Triton X-100，pH 8.5），轻轻混匀。
5. 用移液器将每份样品取两份重复样，每份 200 µL，加入黑色 96 孔板中。将板置于避光环境中，防止光漂白。
6. 在室温下孵育 1 小时，使用 450 nm 激发波长和 510 nm 发射波长读取荧光值。
   注意：硫黄素 T 的读数会随时间波动。所有样品应在相同的孵育时间点进行检测。如需要，可在 1 小时孵育期间进行多次读数，并绘制随时间变化的曲线。

5. α-突触核蛋白预形成纤维的超声处理

警告：超声仪及所有超声步骤均须在生物安全柜中进行，以防止超声过程中可能产生的纤维气溶胶暴露。操作超声步骤的人员应穿戴个人防护装备，包括手套、实验服形式的衣物防护以及面部防护罩。使用杯式超声探头可降低纤维暴露风险，该装置可在超声过程中保持含有纤维的管子处于封闭状态。

注意：纤维的超声处理最佳参数取决于所使用的超声仪型号。因此，需要进行一些优化，以确保纤维达到合适的尺寸。所用超声仪详见材料表，文中所述参数基于使用该型号超声仪的先前实验结果。以下参数适用于在200–400 µL溶液中含2–4 µg/µL的PFFs样品。在将PFFs用于正式实验前，应先使用仪器进行超声测试，并分析纤维情况，以确保达到预期效果。

1. 将直径为 3.2 mm 的探头（材料表）连接至转换器，并按照以下第 5.1.1–5.1.3 步中的说明设置超声破碎仪参数。
   1. 将振幅设为 30%。
   2. 将脉冲模式设为 01 01（开启 1 秒，关闭 1 秒）。
   3. 将时间设为 0:01:00。
      注意：1 分钟的脉冲相当于 60 次脉冲，该型号超声破碎仪（材料表）会自动停止。对于其他型号的超声破碎仪，需手动计数脉冲次数。
2. 在室温下解冻原纤维，并在生物安全柜中用无菌 dPBS 稀释。
   注意：进行超声处理时，透明的 0.6 mL 微离心管效果最佳，最终原纤维浓度取决于具体用途。图示结果来自终浓度为 4 µg/µL 的原纤维样品。
3. 用浸有 70% 乙醇的实验室纸巾擦拭超声破碎仪探头以清洁表面。将探头尖端浸入 ddH₂O 中，脉冲 10 次以进一步清洗，然后用干燥的实验室纸巾擦干。
4. 将探头尖端插入稀释后的原纤维管中，并将尖端置于管底。
5. 进行 60 次脉冲（开启 1 秒，关闭 1 秒）超声处理。每次脉冲期间上下移动探头，以确保液体中的所有原纤维均被充分处理并保持均匀。
6. 完成 60 次脉冲后，将探头从 PFFs 中取出，在洁净的微离心管中将 2 µL PFF 加入 98 µL dPBS 中，使原纤维稀释 50 倍，用于透射电子显微镜检测原纤维尺寸。
   注意：理想情况下，应在体内注射前对少量原纤维进行测量；若时间允许，应进行更全面的原纤维尺寸分析。
7. 超声处理后，将 PFFs 在 2,000 ×g 条件下短暂离心 1 秒，使管壁上的液体全部沉至管底。
   警告：若管壁明显发热，应在 30 次脉冲后暂停，等待 1 分钟后再完成剩余 30 次脉冲。
   注意：超声过程中，每次脉冲开始时应将探头尖端保持在液面底部附近；若过于接近液面顶部，可能导致样品损失。
8. 将探头尖端浸入 1% SDS 溶液中，脉冲 10 次以清洁探头。取出后，再将其浸入 ddH₂O 中，脉冲 10 次。
9. 先用浸有 70% 乙醇的实验室纸巾擦拭探头，再用干燥的实验室纸巾擦干。将探头从转换器上卸下并妥善存放。
10. 使用 1% SDS 溶液擦拭生物安全柜内所有表面，随后再用 70% 乙醇擦拭。
    注意：1% SDS 溶液用于解离原纤维并清洁表面及设备¹⁶。

6. 用于测量超声处理后纤维的透射电子显微镜技术

注意：如果电子显微镜不可行，可使用硫黄素T动力学分析和动态光散射作为种子效率和纤维尺寸的间接测量方法^4,14。

1. 使用上述“纤维可视化电子显微镜”部分的方案制备样品。
2. 使用透射电子显微镜对6至10个不同网格孔区的纤维进行成像。
   注意：图像的放大倍数应足够高以测量纤维，但又需足够低以便同时观察多个纤维。最终放大倍数约为75,000倍时通常已足够。
3. 在将纤维用于实验之前，测量至少25根纤维的小样本长度。
   注意：这些测量通常可使用显微镜配套的成像软件完成。为快速验证，测量者应选择具有代表性的纤维并计算其平均尺寸。纤维长度平均应约为50 nm或更短，后续可进行更精确的测量。
4. 为获得更全面的结果，测量500根以上的纤维长度。
   注意：可使用显微镜配套的成像软件进行纤维长度测量。 alternatively，也可使用图像处理软件打开图像，并利用每幅图像附带的比例尺作为尺寸参考来测量纤维长度。

7. 立体定位注射用定制玻璃针头注射器的制备（图3）

1. 向一个洁净的 50 mL 烧杯中加入约 10 mL 硅化试剂（材料表）。
2. 将玻璃毛细管（长度 54 mm；外径：0.86 mm；内径：0.59 mm）垂直放入盛有硅化试剂的烧杯中，使毛细作用通过浸没在硅化试剂中的管底开口将试剂吸入管内。
3. 用移液器将额外的硅化试剂加入未浸没在硅化试剂中的毛细管上端开口，以完全充满玻璃毛细管。
4. 将毛细管从硅化试剂中取出，并用纸巾轻压管口两端以吸除管内的硅化试剂。让毛细管干燥至少 8 小时。
5. 将一根已硅化的玻璃毛细管放入玻璃拉针仪（材料表）中。
6. 打开加热元件，使附带的重物拉伸受热的玻璃毛细管。
7. 用剪刀在中间最细处切断被拉伸的玻璃毛细管，并从玻璃拉针仪上取下玻璃针。
   注：拉制后的针头内径和外径应分别约为 80 和 100 µm。可一次性制备多个玻璃针，并储存备用，待连接至带有金属针头的玻璃注射器时使用（材料表）。
8. 用剪刀将热缩管（平均内径 0.021"，平均壁厚 0.001"）裁剪至约 40 mm 长度，然后将其滑套在 10 µL 斜面注射器的金属针头上（材料表）。
9. 使用明火加热并粘合热缩管至针头，同时旋转针头以确保受热均匀。
10. 小心地将拉制玻璃针较粗的一端套在注射器的金属针头上。
11. 用剪刀将另一段热缩管（平均内径 0.036"，平均壁厚 0.005"）裁剪至约 40 mm 长度，小心地滑套在玻璃针上，使其覆盖玻璃针基部与注射器金属针头的连接处（材料表）。使用明火加热热缩管，以固定玻璃针与金属针头的连接。
12. 再增加一层热缩管以进一步加固玻璃针。用剪刀将一段热缩管（平均内径 0.044"，平均壁厚 0.005"）裁剪至约 40 mm 长度，小心地滑套在玻璃针上，使其覆盖玻璃针基部与注射器金属针头的连接处（材料表）。使用明火加热热缩管，以确保玻璃针牢固连接于金属针头。
13. 用剪刀修剪玻璃针，使其针尖长度约为 8 mm。
    注：针的长度必须足以靶向目标脑区（具体长度取决于背腹向坐标）。
14. 使用步骤 7.14.1 - 7.14.3 测试针头，确保无泄漏，并验证从玻璃针中吸液和排液时均有足够的液体流动。
    1. 用一个连接 26 号针头的 1 mL 注射器吸入去离子水（dH₂O）。
    2. 从定制的玻璃针注射器中取出金属推杆，将装有 dH₂O 的注射器针头插入注射器基部。施加压力，从玻璃针中排出 dH₂O。检查玻璃针与金属针头连接处是否有泄漏，并确认 dH₂O 流动稳定。
       注：如有需要，可修剪玻璃针以改善液体流动，并增加热缩管层数以封堵玻璃针基部可能的泄漏。
    3. 在微量离心管中加入 dH₂O。使用定制的玻璃针注射器吸取 dH₂O。观察针头，确认液体被顺利吸入注射器且无气泡产生。
       注：若存在气泡或 dH₂O 无法被吸入针头，可尝试修剪针头以缓解压力。
15. 将连接有玻璃针的注射器小心存放于注射器盒中，待手术时使用。
16. 采用标准立体定位手术方法，在优化的坐标位置向小鼠（单个位点：前囟前 +0.2 mm，内侧 +2.0 mm，硬膜下 -2.6 mm）或大鼠（两个位点：前囟前 +1.6 mm，内侧 +2.0 mm，硬膜下 -4.0 mm；前囟前 +0.1 mm，内侧 +4.2 mm，硬膜下 -5.0 mm）纹状体内递送 PFFs^1,14,17。
    注：上述坐标适用于 C57BL6/C3H 小鼠和 Fischer 344 大鼠。使用其他品系时，应优化坐标参数。

结果

由α-突触核蛋白单体生成纤维的起始步骤是确定单体的浓度。可使用BCA法或在280 nm处测量吸光度（A280）来测定蛋白含量；然而，BCA法测得的浓度高于A280法。来源于小鼠α-突触核蛋白单体的PFFs，其BCA值为14.05 ± 0.22，A280值为8.05 ± 0.03 µg/µL（图1）。同样，来源于人源α-突触核蛋白单体的PFFs浓度也较高，其BCA值为12.95 ± 0.38，A280值为7.83 ± 0.05 µg/µL（图1）。A280测量基于消光系数的纳入，特异性针对α-突触核蛋白，这些结果被用于在7天孵育前对单体进行稀释。

在孵育之前，含有α-syn单体的液体是澄清的，但在形成纤维后应呈现浑浊状态。透射电子显微镜观察证实存在长纤维，宽度为10–20 nm（图4）。相比之下，α-syn单体几乎不可见，且无明显形态（图4）。在通过视觉确认纤维结构后，下一步应使用硫黄素T检测来验证PFFs的淀粉样蛋白构象。硫黄素T在结合淀粉样蛋白时荧光增强，因此样品中荧光信号的增加表明淀粉样蛋白的存在。例如，dPBS中的硫黄素T产生3,287 ± 580相对荧光单位（RFU）的信号，小鼠α-syn单体产生4,174 ± 158 RFU的信号，而小鼠PFFs产生59,754 ± 6,224 RFU的信号（图5）。相比之下，人源α-syn单体产生的信号为4,158 ± 105 RFU，与小鼠单体相似，而人源PFFs产生的信号更高，达到1,235,967 ± 113,747 RFU，高于小鼠PFFs（图5）。为了评估是否存在可沉淀的纤维，进行了沉降实验。纤维在离心过程中会形成沉淀。在小鼠和人源PFF样品中，沉淀部分的蛋白含量应高于上清液部分（图6）。相反，小鼠和人源单体中的大部分蛋白存在于上清液中，沉淀中含量极少（图6）。由于PFFs在电子显微镜下可见、具有淀粉样结构且可沉淀，因此通过了所有体外质量控制步骤。

小鼠和人源PFF均经过超声处理，以获得适合诱导α-syn包涵体形成的适当长度的PFF^4,18。将PFF稀释至所需浓度（4 µg/µL）后进行超声处理。在手术前立即通过电子显微镜对25根代表性纤维进行成像并测量，以快速检查纤维长度。超声处理后的小鼠PFF长度为48.8 ± 3.1 nm，人源PFF长度为52.1 ± 4.4 nm；因此，两种物种的PFF长度均处于可有效诱导成核活性的合适范围（50 nm或更短）。对约500根纤维的更全面分析揭示了超声处理后小鼠纤维的平均长度及长度分布情况，平均长度为44.4 ± 0.6 nm，其中86.6%的PFF长度在60 nm或以下（图4）。相比之下，人源PFF的平均长度为55.9 ± 1.1 nm，其中69.6%的PFF长度在60 nm或以下（图4）。

按照先前所述方法^3,5，将超声处理的小鼠PFFs注射至大鼠纹状体内后，在术后2个月对一系列组织切片进行处理，此时已知黑质致密部（SNpc）中含包涵体的神经元数量达到峰值，用于确认磷酸化α-syn包涵体的存在⁵。携带包涵体的神经元通过pSyn免疫组织化学染色（抗体见材料表）显示，不仅存在于SNpc中（图7），也分布于其他支配纹状体的脑区（包括前嗅核、运动皮层、扣带皮层、梨状皮层、前边缘皮层、体感皮层、内嗅皮层和岛叶皮层、杏仁核及纹状体）^1,3,4,5,19。这些包涵体具有与路易小体相似的特性，例如可结合硫黄素S，且总α-syn对蛋白酶K具有抗性（图7），通过免疫组织化学染色可证实（抗体和蛋白酶K见材料表）。脑内种子效应的确认为体内质量控制已通过，因此可将同一批次中先前冻存保留的PFFs分装样品在相同参数下进行超声处理，并在更大规模实验中验证其片段长度。

图 1．α-突触核蛋白纤维的制备方法。 从 α-突触核蛋白单体生成纤维所需步骤的示意图。单体在 4 °C 条件下以 15,000 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至洁净离心管中，并通过 280 nm 处的吸光度或 BCA 法测定蛋白浓度。图中显示了人源和鼠源 α-突触核蛋白单体的浓度。柱状图表示组均值，误差线表示均值的 ±1 标准误。确定蛋白浓度后，将 α-突触核蛋白单体稀释，短暂涡旋混匀，并在 37 °C 条件下于转速设定为 1,000 RPM 的轨道摇床上振荡孵育 7 天。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2．透射电子显微镜染色方法。 电子显微镜负染色流程示意图。A) 电子显微镜样品载网示意图。载网具有哑光面或浅色面，以及光亮面或深色面。光亮/深色面涂有甲酸盐/碳支持膜。B) 染色步骤示意图。将载网光亮/深色面朝下漂浮于第一滴 ddH₂O 上 1 分钟，然后用滤纸吸去多余液体。依次重复操作：第二滴 ddH₂O、稀释的 PFFs 或单体、两滴乙酸铀酰、以及另外两滴 ddH₂O。染色后的载网可存放于载网盒中，待后续成像使用。标尺 = 3 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

图3．定制玻璃针头注射器的组装。 组装带玻璃针头注射器所需步骤的示意图。经硅化处理的玻璃毛细管被拉制后从中间切断，制成玻璃针头。使用热缩管对金属针头进行预处理，并在将玻璃针头套入金属针头时形成内密封。随后依次添加两层覆盖玻璃针头基部与金属针头的热缩管，并加热以固定玻璃针头并形成防水密封。 请点击此处查看该图的高清版本。

图 4．通过透射电子显微镜观察α-突触核蛋白单体与α-突触核蛋白纤维。 α-突触核蛋白单体与纤维的代表性显微图像。上图：小鼠和人类α-突触核蛋白单体。中图：全长的小鼠和人类α-突触核蛋白PFF。下图：超声处理后的小鼠和人类α-突触核蛋白PFF。下方图表：超声处理后的小鼠和人类α-突触核蛋白PFF长度分布。比例尺 = 500 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5．通过硫黄素T检测验证淀粉样结构。 对小鼠和人源α-syn单体及PFF样品的荧光信号进行测量。左侧：小鼠α-syn单体与α-syn PFF的结果；右侧：人源α-syn单体与α-syn PFF的结果。每张图中均显示了dPBS阴性对照。所有测量结果均以相对荧光单位（RFU）表示。柱状图表示组均值，误差线代表均值±1个标准误。请点击此处查看该图的放大版本。

图6．可沉淀α-突触核蛋白的沉降实验。 来自考马斯亮蓝染色凝胶的图像。根据蛋白ladder，所示条带大小约为14 kDa。左侧：小鼠单体和PFFs；右侧：人单体和PFFs。所有单体和PFF样品均显示重悬后的沉淀组分（P）和上清组分（S）。请点击此处查看该图的放大版本。

图7。大鼠模型中包涵体的特征，证实α-syn病理改变。 注射后2个月黑质致密部的代表性显微图像。左图：含有pSyn并用焦油紫复染的神经元。中图：硫黄素S阳性的神经元。右图：对蛋白酶K具有抗性的含α-syn的包涵体。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

生成能够引发神经元病变并导致类似路易小体包涵体的α-突触核蛋白PFFs（α-syn PFFs）的过程依赖于多个因素和步骤。其中一个关键因素是，用于生成纤维的单体必须经过专门配制以促进纤维化^4,9,14,15。如果单体未针对纤维化进行优化配制，则可能无法形成纤维，或形成的纤维无法诱导α-突触核蛋白病理改变。同样，单体所处的缓冲液也会影响纤维化的效率。因此，为获得最佳结果，盐浓度应约为100 mM NaCl，pH值应控制在7.0至7.3之间。一个可能引入变异性的初始步骤是蛋白质初始含量的测定方法，其中在A280处进行测量可能提供更准确的结果，因此是首选方法。蛋白质浓度的偏差不仅会降低纤维化过程的效率，还会影响实验中所用PFF浓度的准确性。这两者均可能导致种子效应效率下降以及不同实验批次间的差异。

初始质量控制步骤将确认PFFs的关键特征，具体包括：具有纤维状构象（透射电子显微镜检测）、含有淀粉样结构（硫黄素T检测）以及可被沉淀（沉降检测）。需要注意的是，硫黄素T检测结果会随时间波动，不能直接反映样品中淀粉样结构的含量；因此，硫黄素T检测仅应作为判断样品中是否存在淀粉样结构的指示性方法。硫黄素T通常用于体外实验，例如上述用于证明纤维含有淀粉样结构的检测。相比之下，硫黄素S则常用于组织中淀粉样结构的检测，如图7所示。关于沉降检测，其结果仅表明PFFs主要存在于可沉淀组分中。由于样品在变性条件下电泳，凝胶上仅出现一条约14 kDa的显著条带，该大小对应于α-突触核蛋白单体。这与使用天然或非变性凝胶时预期出现的多个高分子量条带不同。最后，即使成功通过上述所有初始质量控制步骤，也不能保证PFFs具备诱导α-突触核蛋白包涵体形成的活性。因此，在将PFFs用于大规模实验之前，应通过细胞培养实验或少量手术注射动物实验来验证其有效性。

超声处理是该过程中的关键步骤，其参数会因所使用的超声仪型号不同而有所差异。必须设定并验证超声参数，以证明已产生较短的PFF片段。纤维的长度会影响接种效率，较短的纤维具有更高的接种效率。尽管较短的纤维接种效率更高，但这种效应会达到平台期，最佳PFF长度约为50 nm^4,18。还需注意避免对样品过度超声以及使PFF暴露于过多热量中，因为这可能会降低接种效率。这些经超声处理的PFF在用于大规模实验之前，应先在小规模细胞培养或体内实验中测试其有效性。由于不同批次的超声处理可能引入变异性，实验分组应据此合理设计。

在体内递送PFFs时，注射位点的位置以及所用PFFs的总量可能会影响形成包涵体的神经元数量以及神经退行性变的程度^7,14。本方案中提供的坐标可作为起始参考，但应在实验室内部进行验证，以确保在大规模实验应用前，目标脑区能够出现α-突触核蛋白病理改变。如有需要，可预先使用示踪染料或荧光微珠来验证特定脑区的靶向准确性，再进行PFFs注射。不同研究团队在体内使用的PFFs剂量有所不同，大多数团队在单个或分为两个注射位点的条件下，总用量介于5至20 µg之间^{1,2,3,4,5,6,7,14}。由于注射位点的数量、位置以及注射PFFs的剂量均可能影响突触核蛋白病的实验结果和疾病进展，因此在利用该模型测试潜在干预措施或研究其时间动态特征之前，应先对所采用参数的下游效应进行充分表征。

在选择用于测试治疗手段或研究疾病进展的模型时，应根据所要回答的科学问题来选择最合适的模型。并非所有模型都具备帕金森病（PD）的某些疾病特征，或提供测试潜在干预措施所需的时间框架。PFF模型可重现PD的关键特征，例如α-突触核蛋白（α-syn）病理改变和神经退行性变，并可导致轻度运动功能障碍。该模型具有可预测且持续时间较长的病程，其中包涵体的形成早于神经退行性变数月发生。这使得研究人员能够观察并利用突触核蛋白病在长期进展过程中的不同阶段。总体而言，该模型目前及未来的应用有望在疾病进展研究和新型疗法开发中发挥重要作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher (Gibco)	14190144
抗α-突触核蛋白（丝氨酸129位磷酸化）抗体	Abcam	AB184674
抗α-突触核蛋白抗体	Abcam	AB15530
双环己酮草酰二腙（BCA）	Thermo Fisher (Pierce)	PI23228
透明医用热缩管（内径 0.036"）	Nordson Medical	103-0143
透明医用热缩管（内径 0.044"）	Nordson Medical	103-0296
硫酸铜	Thermo Fisher (Pierce)	PI23224
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	2231000574
Eppendorf ThermoTop 加热盖	Eppendorf	5308000003
Formvar/碳支持膜电子显微镜载网	Electron Microscopy Sciences	FCF300-Cu
玻璃毛细管（外径 0.53 mm；内径 0.09 mm；长度 54 mm）	Drummond	22-326223
玻璃微针拉制仪	Narishige	PC-10
Hamilton 注射器	Hamilton	80000
人源α-突触核蛋白单体（用于制备预形成纤维）	Proteos	RP-003
鼠源α-突触核蛋白单体（用于制备预形成纤维）	Proteos	RP-009
橙色医用热缩管（内径 0.021"）	Nordson Medical	103-0152
Parafilm M 封口膜	Sigma-Aldrich	P7543
蛋白酶K	Invitrogen	25530015
Qsonica 3.2 mm 探头	Qsonica	4422
Qsonica Q125 超声破碎仪	Qsonica	Q125
硫黄素S	Sigma-Aldrich	T1892
硫黄素T	EMD Millipore	596200
ToxinSensor 显色LAL内毒素检测试剂盒	Genscript	L00350C
醋酸铀	Electron Microscopy Sciences	22400