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方法文章

利用荧光大体显微镜通过完整小鼠颅骨在体成像脑脊液运输

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DOI：

10.3791/59774

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2019年7月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Translational Neuromedicine, University of Rochester Medical Center, 2Center for Translational Neuromedicine, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

经颅光学成像技术能够通过完整颅骨对活体小鼠大脑皮层中的脑脊液运输进行宽场成像。

摘要

啮齿类动物中的脑脊液（CSF）流动主要通过离体示踪剂定量方法进行研究。双光子显微镜和磁共振成像（MRI）等技术实现了脑脊液流动的活体定量，但分别受限于成像体积较小和空间分辨率较低。近期研究发现，脑脊液通过围绕啮齿类动物皮层软脑膜及穿支动脉的血管周围间隙网络进入脑实质。这种血管周围脑脊液进入是类淋巴系统（glymphatic system）的主要驱动力，该通路参与清除有毒代谢溶质（例如：β-淀粉样蛋白）。本文介绍一种新型宏观成像技术，可在活体小鼠完整颅骨条件下实现荧光脑脊液示踪剂的实时、介观水平成像。这种微创方法支持多种实验设计，可用于单次或重复检测脑脊液动力学。宏观成像系统具有高空间和时间分辨率，其大尺寸机架和工作距离允许在行为学装置上执行操作的同时进行成像。该成像方法已通过双光子成像验证，由此获得的荧光信号测量值与离体荧光检测及放射性标记示踪剂定量结果高度相关。在本方案中，我们描述了经颅宏观成像技术如何用于评估活体小鼠的类淋巴转运功能，为更昂贵的成像手段提供了一种可及的替代方案。

引言

脑脊液（CSF）包围着大脑和脊髓，在维持内环境稳态、提供营养物质以及调节颅内压方面发挥重要作用1。位于蛛网膜下腔的脑脊液通过围绕皮质软脑膜动脉的血管周围间隙（PVS）网络进入大脑，随后沿穿支小动脉向下流动2。进入脑实质后，脑脊液与组织间液（ISF）进行交换，将有害代谢产物（如淀粉样蛋白-β（Aβ）和tau蛋白聚集体）通过低阻力的白质通路和静脉周围间隙运输出脑2,3。该通路依赖于星形胶质细胞的水通道蛋白-4（AQP4），因此被称为胶质淋巴系统（glymphatic system）4。神经组织的代谢废物最终通过颅神经附近及脑膜中的淋巴管，从脑脊液-组织间液系统清除，并引流至颈部淋巴结5。该系统的功能障碍已被认为与多种神经系统疾病相关，包括阿尔茨海默病6,7、创伤性脑损伤3以及缺血性和出血性卒中8。 

通过向小脑延髓池（CM）注入示踪剂，可以实现脑脊液（CSF）运输的可视化9,10，以往的类淋巴系统研究主要采用双光子显微镜4,11,12,13、磁共振成像（MRI）14,15,16,17以及离体成像3,6,11,18来评估示踪剂的动力学。双光子显微镜因其具有高空间分辨率，适用于对血管周围间隙（PVS）和脑实质中脑脊液示踪剂进行精细成像，但其视野狭窄，且需要侵入性颅窗或颅骨变薄处理。结合免疫组织化学的离体成像可实现从单个细胞到全脑范围的多层次分析19。然而，用于观察死后组织的灌注固定过程会引起脑脊液流动方向的显著改变，并导致血管周围间隙塌陷，从而显著影响示踪剂的分布与定位12。最后，尽管MRI能够追踪整个小鼠和人脑中的脑脊液流动，但其在血管周围流动的时空分辨率方面仍存在不足。

一种新技术——经颅宏观成像——通过实现对活体小鼠整个背侧皮层的血管周围脑脊液运输进行宽场成像，克服了上述部分局限性。此类成像采用落射荧光宏观显微镜，配备多波段滤光片组、可调谐LED光源和高效率CMOS相机10。该系统能够分辨颅骨表面下深达1-2 mm的血管周围间隙（PVS），并在完全保留颅骨完整性的前提下，检测到皮层表面下深达5-6 mm的荧光标记物10。多波段滤光片和可快速调节激发波长的LED光源使得可在同一实验中使用多种荧光标记物，从而利用不同分子量和化学性质的示踪剂对脑脊液进行标记。

该操作需要进行一种简单且微创的手术，以暴露颅骨并安装轻质头固定板，从而在成像过程中稳定动物头部。示踪剂可被递送至脑池（CM）中，而无需钻开颅骨或使用移液管或套管穿透皮质组织9,20。脑池套管和头固定板可在数天至数周内保持稳定，相较于传统的终点法可视化技术，能够支持更复杂的实验设计。本方案描述了如何利用经颅宏观成像技术，在麻醉/睡眠或清醒小鼠的脑池内急性或慢性注射荧光脑脊液（CSF）示踪剂后，研究类淋巴系统功能。

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方案

所有实验均经罗切斯特大学动物资源委员会（UCAR，方案编号：2011-023）批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。

1. 准备小脑延髓池插管、头颅固定板和头颅固定装置

  1. 手术前对所有外科器械和头板进行灭菌。
    注意：荧光示踪剂通过小脑延髓池插管直接注入脑脊液。有关该操作的详细说明，请参见 Xavier 等人9。
  2. 简而言之，使用持针器将一根 30G × 12.7 mm（½ 英寸）针头的尖端从约 ¾ 处折断，并将针头的钝端插入一段聚乙烯 10（PE10）导管（长约 45 cm）的一端。确保仅有斜面部分从 PE10 导管边缘突出。
  3. 将另一根 30G 针头的斜面端约 ¼ 处折断，并将剩余部分的钝端插入 PE10 导管的另一端，此时塑料鲁尔锁接头仍保持连接。
  4. 用 100 µL 玻璃注射器吸取无菌人工脑脊液（aCSF：126 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、2 mM MgSO4、2 mM CaCl2、10 mM 葡萄糖和 26 mM NaHCO3）。
  5. 将注射器连接至导管末端，并用 aCSF 充满导管，直至液体到达斜面针头的尖端。务必确保注射器内充满 aCSF 而非空气，因为气柱更容易导致灌注体积不稳定。
  6. 对于慢性实验，保持导管内充满 aCSF，并跳过第 1.7 步。
  7. 对于急性实验，将注射器安装在输注泵上，回抽约 5 mm 空气以防止混合。随后，回抽实验所需示踪剂的总体积（建议额外多取 20%，以补偿死腔损失）。
    注意：PE10 导管应足够长，以确保在加载示踪剂时气泡不会进入玻璃注射器的塑料套管内。在典型实验中，本方案使用 10 µL 牛血清白蛋白偶联 Alexa Fluor 647（BSA-647）溶于 aCSF 中，终浓度为 0.5%。
  8. 确认头板能适配头夹，并且尺寸适合所用小鼠。用于判断适配的解剖学标志包括：窗口上缘与两眼连线对齐，后缘位于枕骨嵴前方。
    注意：不锈钢头板可灭菌后重复使用。大多数氰基丙烯酸盐粘合剂可用丙酮溶液去除。

2. 手术步骤

  1. 称重并麻醉小鼠（例如，使用氯胺酮/赛拉嗪；氯胺酮100 mg/kg，赛拉嗪10 mg/kg；腹腔注射）。
  2. 当小鼠对脚趾夹捏不再有反应时，用无菌水湿润其颈部和头部，并使用电推剪剃毛。剃毛完成后，再次用酒精棉片擦拭该区域，以清除残留的毛发。
    注意：在剪毛前将毛发湿润可显著减少切口后成像窗口中的毛发残留量。
  3. 将小鼠置于立体定位仪上，放置于温度控制垫上方，并在小鼠眼睛上涂抹石油基眼用软膏，以防止眼睛干燥。
  4. 使用氯己定棉片清洁暴露的皮肤。2分钟后，用酒精棉片擦去氯己定。最后，涂抹碘溶液并使其自然干燥。
  5. 在颅骨顶部和颈部皮下注射镇痛剂（0.25%盐酸布比卡因）。
  6. 从覆盖枕骨嵴的颈部区域开始，在皮肤上做正中切口，并向前延伸至眶间线。向侧方切开至颞肌插入颅骨的边界处。移除梭形切口范围内的全部皮肤，以暴露额骨和顶骨。
    警告：眶后窦位于眼球后方，而面后静脉的较大分支位于耳廓前方。在切开时需小心避免损伤这些结构。若发生损伤，应使用无菌棉签压迫止血数分钟，待止血后再继续操作。
  7. 用无菌生理盐水冲洗颅骨，并用棉签清洁表面，确保无碎屑和毛发残留，因为这些杂质会影响成像质量。为最大限度保持颅骨透明性，应保留骨膜及其上方的筋膜组织。
    注意：若这些结构被意外去除，颅骨可能随时间推移变得干燥且不透明。此时可重新用人工脑脊液（aCSF）润湿，或在急性实验中使用石蜡油与甘油混合物以降低颅骨反射率21。
  8. 继续进行小脑延髓池插管操作——有关该手术的详细步骤，请参见Xavier等人的研究9。
  9. 插入小脑延髓池导管后，在颅骨固定板腹侧边缘周围涂抹牙科水泥与氰基丙烯酸酯胶的混合物，并将固定板置于颅骨上，确保固定板前缘与鼻骨后端对齐，后缘与顶间骨前部对齐，同时保证矢状缝（正中线）相对于成像窗口居中且平直（图1B）。
  10. 使用数滴胶水加速剂固定颅骨固定板的位置。用胶-水泥混合物填充剩余缝隙，并用加速剂固化。
    警告：确保氰基丙烯酸酯不接触小鼠眼睛，也不阻塞成像窗口。
  11. 将小脑延髓池导管粘附于颅骨固定板上，以防止在运输或小鼠苏醒过程中发生脱落。
  12. 对于急性实验，跳至步骤2.16。
  13. 对于慢性实验，小心在暴露的颅骨上涂抹一层透明干燥的氰基丙烯酸酯胶，注意避免产生气泡，因为气泡会干扰成像。该胶层可保护颅骨，且不会影响成像效果。需确保胶层完全覆盖暴露的颅骨，直至切口边缘的皮肤处。
  14. 使用止血钳夹住距离小脑延髓池导管2-3 cm处的PE10导管（内含aCSF），并用高温电灼头切断导管。分离后，压平熔化的PE10导管末端以封闭导管。
    警告：必须在导管完全封闭后才能松开止血钳，并确认导管无泄漏，以防止脑脊液瘘形成。
  15. 给予卡洛芬（5 mg/kg，每24小时一次，连续3天；腹腔或皮下注射），然后将小鼠放回温度可控的单笼饲养环境中，在成像前至少恢复24小时。在小鼠恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。完整的颅窗可保持数周稳定。
    注意：慢性实验可在此暂停。
    警告：一些术后并发症包括头颅血肿/皮下腱膜下血肿、脑脊液瘘和感染。
  16. 对于急性实验，使用颅骨固定板将小鼠放入头部固定装置，使颅骨处于固定位置。务必检查麻醉深度，并在小鼠身下放置加热垫。此时小鼠已准备好转移至宏成像系统进行成像。
    警告：应小心将小鼠与输液泵一同置于推车上运输。若小脑延髓池插管发生移位，将导致颅内压下降，任何脑脊液泄漏均会改变实验结果。

3. 准备用于成像的小鼠

注意：该方案根据成像实验是在麻醉小鼠（从步骤 3.1 开始）还是清醒小鼠（从步骤 3.2 开始）上进行而有所不同。

  1. 麻醉小鼠
    1. 将头部固定器放置在体视显微镜的载物台上，确保从注射泵到CM导管的管路无扭曲，且不要拉得过紧，以免影响示踪剂的灌注。
    2. 观察呼吸频率及黏膜粉红色泽，以评估良好的氧合状态。必要时皮下注射生理盐水以维持充分的水合水平。检查动物是否处于足够麻醉状态，必要时追加麻醉剂量。
    3. 打开宏观成像相机和LED，启动实时成像模式。
    4. 确认成像视野的放大倍数，使视野顶部的鼻额缝和底部的人字缝能够清晰可见，且矢状缝与图像中线平行并居中。图1C固定到位后，用胶带将头部固定器固定在显微镜载物台上。
    5. 将体视显微镜对焦于暴露的颅骨。尽管体视显微镜具有相对较大的景深，但小鼠颅骨的曲率仅允许特定区域处于焦点范围内。当焦平面位于冠状缝后方顶骨的外侧区域时，可获得最佳成像效果。
      注意：此处为大脑中动脉（MCA）的位置，大部分脑脊液由此处流入图1D,E)10.
  2. 清醒小鼠
    1. 成像实验前，让动物从头板手术中恢复至少24小时；建议更长的恢复期（5–7天）。在此期间，每天在限制管中将小鼠头部固定于成像台上，训练0.5–1小时，持续整个恢复期。
      注意：习惯化训练可使小鼠在无麻醉状态下固定于头部固定装置，从而减少实际实验过程中的应激与焦虑。若此操作不可行，且麻醉不影响实验结果，可使用吸入性麻醉剂进行诱导麻醉（例如，1–2 L/min 氧气流速下给予 2% 异氟烷）2 流速可用于快速将小鼠固定在头部固定装置上。
    2. 将小鼠固定在头部固定装置并放入束缚管后，按照步骤 3.1.1–3.1.5 操作。

4. 荧光脑脊液示踪剂的灌注

  1. 急性小脑延髓池插管
    1. 由于示踪剂已在步骤1.6中置入小脑延髓池前预先装入插管，此时将输注泵设定至所需的流速和体积。常规使用的输注方案为5–10 µL，流速1–2 µL/min，但具体参数可根据实验需求、动物体型或年龄进行调整。
  2. 慢性小脑延髓池插管
    1. 在开始成像实验前，参照急性实验的步骤1.2–1.7，准备输注管路以输送示踪剂。
    2. 管路准备完成后，使用止血钳夹住慢性小脑延髓池插管的封闭端并剪开。取步骤4.2.1中准备好的管路上的针头，轻轻插入插管中。松开止血钳，通过注射泵以实验所需的输注速率（例如，2 µL/min）推进脑脊液示踪剂，直至示踪剂到达小脑延髓池内的植入针头处。
      警告：若连接管路时针头刺穿管壁，应立即取出针头，剪除被刺穿的部分，并重复此步骤。PE10管任何撕裂均会导致泄漏，影响实验结果。

5. 设置成像实验

  1. 根据所灌注的荧光示踪剂，确定每个通道的激发波长和曝光时间。选择能够观察到示踪剂所需的最短曝光时间，以最大化延时成像的时间分辨率。此曝光时间将用于后续所有旨在比较不同动物之间脑脊液（CSF）转运的实验。
    注意：一种方法是使用CM通路中的示踪剂来调整曝光时间。尽管这是一种有用的初步方法，但仍需在后续实验中逐步优化。
  2. 选择实验持续时间以及图像采集的时间间隔。实验通常持续30至60分钟，具体时长取决于所关注的类淋巴系统转运阶段。对于大多数实验，每分钟1帧或更快的帧速率已足够。
  3. 设置文件名和保存路径。
  4. 如果成像需与其他变量（例如心电图、动脉血压、电生理信号）同步采集，则可对宏视镜和泵进行编程，使其由数据采集软件触发。在进入下一步之前，请确认宏视镜上的触发功能设置正确。

6. 经颅光学成像实验

  1. 同时开始示踪剂输注和成像。
  2. 定期检查小脑延髓池（CM）导管和PE10管路是否有泄漏迹象。如果在CM处出现示踪剂泄漏，则该实验结果必须排除。
    注意：如果示踪剂开始在小脑积聚，而未沿大脑中动脉（MCA）的类淋巴通路运行，则很可能CM导管已插入小脑。此类数据不应纳入分析。
  3. 对于急性实验，在完成实验后，将小鼠从显微镜下取出，并确认其仍处于充分麻醉状态。迅速将小鼠断头并取出脑组织，将脑组织在4%多聚甲醛（PFA）中于4 °C下浸没固定过夜。
    1. 对于慢性实验，在成像完成后，从小鼠体内移除CM导管中的导管线，用无菌人工脑脊液（aCSF）冲洗，并使用高温电灼头封闭CM导管。将小鼠从头部固定架上取下并放回笼中。重复此过程直至不再需要进一步成像，然后执行步骤6.3。

7. 数据分析

注意：基于 Matlab 的分析方法（如脑脊液前沿追踪）可从这些成像数据集中的示踪剂前沿提取大量定量数据10,22。然而，这些文件类型也可轻松导入并使用开源图像分析软件（如 Fiji）进行分析23。

  1. 使用 Bio-Formats 导入工具将图像序列导入 Fiji。此功能将保留文件元数据，包括时间与像素分辨率信息。将图像序列保存为 .tiff 文件。
  2. 使用多边形选择工具手动在颅骨或感兴趣区域周围绘制感兴趣区（ROI）。例如，在 图1G 在创伤性脑损伤后，分别对同侧和对侧半球单独绘制感兴趣区域。请确保将感兴趣区域添加到 感兴趣区域 经理 (分析>工具>ROI 管理器）并保存。
    注意：脑脊液运输可通过两种主要方式进行量化：1）随时间变化的平均荧光强度，或 2）流入区域占感兴趣区域（ROI）或总面积的百分比（mm2）在应用阈值后。后一种方法（图1H将在下一步中描述。
  3. 在荧光信号最强的帧上设置阈值（选择图像>调节>阈值…）。自动阈值方法，例如 大津法 通常对脑脊液示踪剂检测效果良好。应用阈值。
  4. 在继续之前，请确保 分析>设置测量参数， 选项 面积 和 面积 组分 进行选择。然后在 感兴趣区域 经理，选择 更多>多参数测量.
  5. 转换 %面积 将数值转换为毫米2 使用 面积 从输出中获取感兴趣区域（ROI）的值。 %面积 数值反映脑脊液示踪剂在背侧皮质表面所占的百分比。
  6. 绘制脑脊液示踪剂流入量（单位：mm）2 随时间变化。

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结果

脑脊液流入通过落射荧光宏观显微镜成像（图1A），该设备可实现小鼠大脑皮层脑脊液示踪剂运输的介观成像。完整的颅骨头板可清晰显示鼻骨前部、中央区域的双侧额骨和顶骨，以及尾侧顶间骨的前部（图1B）。在成像过程中，鼻额缝、矢状缝、冠状缝和人字缝可被清晰识别（图1C）。当脑脊液示踪剂开始注入小脑延髓池（CM）后（图1D），首先可在基底池、嗅额池以及松果体隐窝附近的四叠体池等蛛网膜下腔较大的脑脊液腔隙中观察到示踪剂荧光信号（图1E，左）。随后，脑脊液示踪剂沿大脑中动脉（MCA）皮层软脑膜分支的血管周围间隙进入脑实质（图1E，右）。

经颅光学成像可用于研究创伤性脑损伤（TBI...

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讨论

我们已描述了一种使用市售荧光大体显微镜和示踪剂在活体小鼠中进行经颅脑脊液成像的详细方案。该技术简单、微创，且具有定量性。体内成像结果与敏感的检测方法（如脑池内给予放射性标记示踪剂3H-葡聚糖和14C-菊粉后的液体闪烁计数）以及离体冠状切片定量分析均具有良好相关性10,18。通过双光子显微镜验证表明，在大体显微镜下观察到的沿皮层血管分布的脑脊液示踪剂主要位于大脑中动脉（MCA）及其分支的血管周围间隙中10。这些脑脊液流入通路是类淋巴系统的关键组成部分19。尽管本方案未涵盖，但该实验装置还可用于成像脑脊液清除通路，例如脑膜淋巴管和颈部淋巴管25,26。

头板设计的改进使得能够对同一只小鼠进行长期、稳定的宽场成像。头板...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立神经疾病与卒中研究所和美国国立衰老研究所（美国国立卫生研究院；项目编号 R01NS100366 和 RF1AG057575，授予 MN）、勒杜克基金会跨大西洋卓越网络计划以及欧盟“地平线 2020”研究与创新计划（资助编号 666881；SVDs@target）资助。我们还要感谢 Dan Xue 在图形插图方面提供的专业协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 盐酸布比卡因罗切斯特大学动物实验中心
100 µL 耐化学腐蚀注射器，型号 1710 TLL，PTFE 鲁尔锁Hamilton 公司81020
A-M Systems 牙科水泥粉末费舍科学公司NC9991371
卡洛芬罗切斯特大学动物实验中心
氯己定PrevanticsB10800
CMOS 相机滨松光子学株式会社ORCA Flash 4.0
头固定板罗切斯特大学无目录编号由罗切斯特大学机械加工车间定制制作
高温电灼器Bovie 医疗公司AA01
Insta-set 加速剂Bob Smith 工业公司BSI-151
异氟烷 - FlurisoVet One502017罗切斯特大学动物实验中心
氯胺酮斯特罗格纪念医院药房
Krazy Glue 瞬干胶Elmer's 产品公司无目录编号，参见评论中的链接https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
美皮护外科胶带费舍科学公司19-027-761
多聚甲醛Sigma-aldrichP6148
PE10 - 聚乙烯管，每英尺 .011" x .024"，连续 100 英尺布雷因特里科学公司PE10 100 FT
Pump 11 Elite 双注射器输注泵哈佛仪器公司70-4501
PURALUBE VET 眼膏Dechra
Puritan PurSwab 棉签清洁棒费舍科学公司22-029-553
研究用宏观变倍显微镜奥林巴斯公司MVX10
小鼠用简易头固定板Narishige 国际美国公司MAG-1
一次性使用针头，BD 医疗VWRBD305106
无菌酒精消毒片费舍科学公司22-363-750
可调 LED 光源PRIOR Lumen 1600-LED
赛拉嗪罗切斯特大学动物实验中心

参考文献

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