经颅光学成像技术能够通过完整颅骨对活体小鼠大脑皮层中的脑脊液运输进行宽场成像。
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方法文章
利用荧光大体显微镜通过完整小鼠颅骨在体成像脑脊液运输
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
啮齿类动物中的脑脊液（CSF）流动主要通过离体示踪剂定量方法进行研究。双光子显微镜和磁共振成像（MRI）等技术实现了脑脊液流动的活体定量，但分别受限于成像体积较小和空间分辨率较低。近期研究发现，脑脊液通过围绕啮齿类动物皮层软脑膜及穿支动脉的血管周围间隙网络进入脑实质。这种血管周围脑脊液进入是类淋巴系统（glymphatic system）的主要驱动力，该通路参与清除有毒代谢溶质（例如：β-淀粉样蛋白）。本文介绍一种新型宏观成像技术，可在活体小鼠完整颅骨条件下实现荧光脑脊液示踪剂的实时、介观水平成像。这种微创方法支持多种实验设计，可用于单次或重复检测脑脊液动力学。宏观成像系统具有高空间和时间分辨率，其大尺寸机架和工作距离允许在行为学装置上执行操作的同时进行成像。该成像方法已通过双光子成像验证，由此获得的荧光信号测量值与离体荧光检测及放射性标记示踪剂定量结果高度相关。在本方案中，我们描述了经颅宏观成像技术如何用于评估活体小鼠的类淋巴转运功能，为更昂贵的成像手段提供了一种可及的替代方案。
引言
脑脊液（CSF）包围着大脑和脊髓，在维持内环境稳态、提供营养物质以及调节颅内压方面发挥重要作用1。位于蛛网膜下腔的脑脊液通过围绕皮质软脑膜动脉的血管周围间隙（PVS）网络进入大脑，随后沿穿支小动脉向下流动2。进入脑实质后，脑脊液与组织间液（ISF）进行交换，将有害代谢产物（如淀粉样蛋白-β（Aβ）和tau蛋白聚集体）通过低阻力的白质通路和静脉周围间隙运输出脑2,3。该通路依赖于星形胶质细胞的水通道蛋白-4（AQP4），因此被称为胶质淋巴系统（glymphatic system）4。神经组织的代谢废物最终通过颅神经附近及脑膜中的淋巴管，从脑脊液-组织间液系统清除，并引流至颈部淋巴结5。该系统的功能障碍已被认为与多种神经系统疾病相关，包括阿尔茨海默病6,7、创伤性脑损伤3以及缺血性和出血性卒中8。
通过向小脑延髓池（CM）注入示踪剂，可以实现脑脊液（CS....
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方案
所有实验均经罗切斯特大学动物资源委员会（UCAR，方案编号：2011-023）批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。
1. 准备小脑延髓池插管、头颅固定板和头颅固定装置
- 手术前对所有外科器械和头板进行灭菌。
注意：荧光示踪剂通过小脑延髓池插管直接注入脑脊液。有关该操作的详细说明，请参见 Xavier 等人9。 - 简而言之，使用持针器将一根 30G × 12.7 mm（½ 英寸）针头的尖端从约 ¾ 处折断，并将针头的钝端插入一段聚乙烯 10（PE10）导管（长约 45 cm）的一端。确保仅有斜面部分从 PE10 导管边缘突出。
- 将另一根 30G 针头的斜面端约 ¼ 处折断，并将剩余部分的钝端插入 PE10 导管的另一端，此时塑料鲁尔锁接头仍保持连接。
- 用 100 µL 玻璃注射器吸取无菌人工脑脊液（aCSF：126 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、2 mM MgSO4、2 mM CaCl2、10 mM 葡萄糖和 26 mM NaHCO3）。
- 将注射器连接至导管末端，并用 aCSF 充满导管，直至液体到达斜面针头的尖端。务必确保注射器内充满 aCSF....
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结果
脑脊液流入通过落射荧光宏观显微镜成像（图1A），该设备可实现小鼠大脑皮层脑脊液示踪剂运输的介观成像。完整的颅骨头板可清晰显示鼻骨前部、中央区域的双侧额骨和顶骨，以及尾侧顶间骨的前部（图1B）。在成像过程中，鼻额缝、矢状缝、冠状缝和人字缝可被清晰识别（图1C）。当脑脊液示踪剂开始注入小脑延髓池（CM）后（图1D），首先可在基底池、嗅额池以及松果体隐窝附近的四叠体池等蛛网膜下腔较大的脑脊液腔隙中观察到示踪剂荧光信号（图1E，左）。随后，脑脊液示踪剂沿大脑中动脉（MCA）皮层软脑膜分支的血管周围间隙进入脑实质（图1E，右）。
经颅光学成像可用于研究创伤性脑损伤（TBI.......
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讨论
我们已描述了一种使用市售荧光大体显微镜和示踪剂在活体小鼠中进行经颅脑脊液成像的详细方案。该技术简单、微创，且具有定量性。体内成像结果与敏感的检测方法（如脑池内给予放射性标记示踪剂3H-葡聚糖和14C-菊粉后的液体闪烁计数）以及离体冠状切片定量分析均具有良好相关性10,18。通过双光子显微镜验证表明，在大体显微镜下观察到的沿皮层血管分布的脑脊液示踪剂主要位于大脑中动脉（MCA）及其分支的血管周围间隙中10。这些脑脊液流入通路是类淋巴系统的关键组成部分19。尽管本方案未涵盖，但该实验装置还可用于成像脑脊液清除通路，例如脑膜淋巴管和颈部淋巴管25,26。
头板设计的改进使得能够对同一只小鼠进行长期、稳定的宽场成像。头板.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立神经疾病与卒中研究所和美国国立衰老研究所（美国国立卫生研究院；项目编号 R01NS100366 和 RF1AG057575，授予 MN）、勒杜克基金会跨大西洋卓越网络计划以及欧盟“地平线 2020”研究与创新计划（资助编号 666881；SVDs@target）资助。我们还要感谢 Dan Xue 在图形插图方面提供的专业协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 盐酸布比卡因 | 罗切斯特大学动物实验中心 | ||
| 100 µL 耐化学腐蚀注射器，型号 1710 TLL，PTFE 鲁尔锁 | Hamilton 公司 | 81020 | |
| A-M Systems 牙科水泥粉末 | 费舍科学公司 | NC9991371 | |
| 卡洛芬 | 罗切斯特大学动物实验中心 | ||
| 氯己定 | Prevantics | B10800 | |
| CMOS 相机 | 滨松光子学株式会社 | ORCA Flash 4.0 | |
| 头固定板 | 罗切斯特大学 | 无目录编号 | 由罗切斯特大学机械加工车间定制制作 |
| 高温电灼器 | Bovie 医疗公司 | AA01 | |
| Insta-set 加速剂 | Bob Smith 工业公司 | BSI-151 | |
| 异氟烷 - Fluriso | Vet One | 502017 | 罗切斯特大学动物实验中心 |
| 氯胺酮 | 斯特罗格纪念医院药房 | ||
| Krazy Glue 瞬干胶 | Elmer's 产品公司 | 无目录编号，参见评论中的链接 | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| 美皮护外科胶带 | 费舍科学公司 | 19-027-761 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 - 聚乙烯管，每英尺 .011" x .024"，连续 100 英尺 | 布雷因特里科学公司 | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite 双注射器输注泵 | 哈佛仪器公司 | 70-4501 | |
| PURALUBE VET 眼膏 | Dechra | ||
| Puritan PurSwab 棉签清洁棒 | 费舍科学公司 | 22-029-553 | |
| 研究用宏观变倍显微镜 | 奥林巴斯公司 | MVX10 | |
| 小鼠用简易头固定板 | Narishige 国际美国公司 | MAG-1 | |
| 一次性使用针头，BD 医疗 | VWR | BD305106 | |
| 无菌酒精消毒片 | 费舍科学公司 | 22-363-750 | |
| 可调 LED 光源 | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| 赛拉嗪 | 罗切斯特大学动物实验中心 |
参考文献
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochemi....
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重印与许可
