哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

摘要

CRISPR-Cas9 技术提供了一种高效的方法，可精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表了一种进行全基因组遗传筛选的新手段。本文提供了一个详细方案，阐述了成功实施混合式全基因组 CRISPR-Cas9 筛选所需的各个步骤。

摘要

利用CRISPR-Cas系统进行基因组编辑极大地提升了精确编辑多种生物基因组的能力。在哺乳动物细胞中，该技术为功能基因组学研究提供了开展全基因组遗传筛选的新手段。针对所有开放阅读框的向导RNA（sgRNA）文库，使得在单一细胞池中可简便地产生数千种遗传扰动，并可通过筛选特定表型，以无偏倚且系统化的方式揭示基因功能及细胞过程。CRISPR-Cas筛选为研究人员提供了一种简单、高效且低成本的方法，用于解析细胞表型的遗传基础。此外，对不同细胞系或不同类型癌症中开展的筛选进行差异分析，可鉴定在肿瘤细胞中具有情境依赖性必需性的基因，从而揭示特异性抗癌治疗的潜在靶点。在人类细胞中开展全基因组筛选可能具有挑战性，因其涉及数千万细胞的操作以及大规模数据的分析。这些筛选的诸多细节，例如细胞系的特征鉴定、CRISPR文库的选择，以及在分析过程中对CRISPR技术局限性与能力的理解，常常被忽视。本文提供了一套详细的实验方案，用于成功实施基于混合型全基因组CRISPR-Cas9筛选。

引言

CRISPR-Cas 是成簇规律间隔短回文重复序列及其相关核酸酶（clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated nuclease）的缩写，由一种单一的核酸酶蛋白（例如 Cas9）与合成的向导 RNA（sgRNA）组成复合物。该核糖核蛋白复合物可将 Cas9 酶靶向至基因组特定位点，诱导产生双链 DNA 断裂¹。双链断裂可通过同源定向修复（HDR）途径修复，但更常见的是通过易错的非同源末端连接（NHEJ）途径进行修复，后者常导致插入和/或缺失（INDELS），从而频繁破坏基因功能¹。CRISPR 技术具有高效性和简便性，实现了前所未有的基因组靶向精度，远超以往的基因组编辑技术（如锌指核酸酶（ZNF）或转录激活因子样效应物核酸酶（TALENS）），后两者均存在设计复杂度高、转染效率低以及多重基因编辑能力受限等问题²。

基于CRISPR单导向RNA的基因组编辑技术在基础研究中的应用，使科学家能够高效且低成本地探究单个基因的功能以及遗传相互作用网络的拓扑结构。相较于早期的遗传扰动技术，如RNA干扰（RNAi）和基因捕获诱变，CRISPR-Cas系统在实现全基因组范围的功能筛选方面具有显著优势。特别是，RNAi技术存在较高的脱靶效应....

方案

以下实验应遵循研究所环境健康与安全办公室的指南。

1. 混合CRISPR sgRNA慢病毒文库质粒扩增

1. 将预制的 CRISPR sgRNA 质粒 DNA 文库用 TE 缓冲液稀释至 50 ng/μL（例如 TKOv3）。
2. 使用电转感受态细胞进行电穿孔。按照以下说明设置总共四次电穿孔反应。
   1. 将 2 μL 浓度为 50 ng/μL 的 TKO 文库加入到冰上预冷的 1.0 mm 电转杯中的 25 μL 解冻电转感受态细胞中。
   2. 按照制造商推荐的最佳条件进行电穿孔。脉冲后 10 秒内，向电转杯中加入 975 μL 恢复培养基（或 SOC 培养基）。
   3. 将电穿孔后的细胞转移至培养管中，并加入 1 mL 恢复培养基。在 37 °C、250 rpm 条件下于摇床中孵育 1 小时。
3. 设置稀释平板以滴定文库并估算转化效率。
   1. 合并所有 8 mL 回收的细胞并充分混匀。取 10 μL 混合后的细胞加入 990 μL 恢复培养基中，进行 800 倍稀释，并充分混匀。
   2. 取 20 μL 稀释液涂布于预热的 10 cm LB + 羧苄青霉素（100 µg/L）琼脂平板上。该操作相当于对转化子进行 40,000 倍稀释，用于计算转化效率。
   3. 将回收的细胞各取 400 μL 涂布于共 20....

结果

基因组规模CRISPR筛选工作流程概述

图1展示了混合CRISPR筛选的工作流程概览：首先以较低的感染复数（MOI）将靶细胞与CRISPR文库慢病毒进行感染，以确保单次整合事件及文库的充分代表性（通常为200至1000倍覆盖）。感染后，使用抗生素嘌呤霉素处理细胞，以筛选出成功转导的细胞。筛选完成后，收集基础时间点（T0）的细胞沉淀，用于评估筛选起始时文库的分布情况。剩余细胞包含遗传扰动的异质性群体，每3至4天传代一次，并始终保持所需的文库代表性，共进行15至20次细胞倍增，以使基因编辑及其效应得以显现。对于药物处理的筛选实验，通常在细胞从病毒感染和嘌呤霉素筛选中恢复后的T3或T6时间点加入药物。每次传代时，在保持所需文库代表性的条件下收获细胞，提取基因组DNA，并在预定的时间点通过高通量测序检测向导RNA的丰度。

讨论

由于CRISPR技术使用简便且具有高度可塑性，已被广泛采用作为精确基因组编辑的首选工具。混合CRISPR筛选提供了一种在单次实验中研究数千种遗传扰动的方法。在混合筛选中，sgRNA文库作为分子条形码，因为每条序列都是唯一的，并可映射至其靶向基因。通过从细胞群体中提取基因组DNA，可通过高通量测序定量sgRNA的丰度，从而确定引起特定表型的基因。采用大规模并行测序方法对样本中的sgRNA进行定量，这意味着多个独立的细胞群体可合并至同一条测序通道中，以降低测序成本。

在开展大规模筛选项目之前，拥有一个经过充分表征且技术上优化的模型至关重要。在选择用于筛选的细胞系时，遗传背景、生长速率和转导效率是需要考虑的重要因素。例如，细胞的生长速率和编辑效率将决定该模型的可扩展性及技术适用性。为了充分覆盖大规模的sgRNA文库，需要数千万个细胞，因此对于倍增时间较长或增殖能力较差的细胞系（例如原代细胞），细胞数量可能成为限制筛选可行性的因素。应根据细胞的生长速率，相应地选择适合筛选的细胞培养条件，如细胞接种密度和培养板规格。建议在实际操作和技术上可行的前提下，使用最大规格的培养容器进行细胞培养。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 微米滤膜
30°C 培养皿培养箱
37°C 摇床培养箱
37°C、5% CO2 培养箱
5 M NaCl	Promega	V4221
50X TAE 缓冲液	BioShop	TAE222.4
6 N 盐酸溶液	BioShop	HCL666.500
95% 乙醇
刃天青钠（Alamar blue）	ThermoFisher Scientific	DAL1025
蓝光透射仪	ThermoFisher Scientific	G6600
牛血清白蛋白，热激分离，第五组分，纯度 ≥98%，生物技术级	Bioshop	ALB001.250
杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modification of Eagles Medium）	Life Technologies	11995-065	细胞培养基
电穿孔比色皿	BTX	45-0134
电穿孔仪	BTX	45-0651
Endura 电转化感受态细胞	Lucigen	90293
胎牛血清	GIBCO	12483-020
HEK293T 包装细胞	ATCC	CRL-3216	建议传代数 <15
六亚甲基溴化铵（Polybrene）	Sigma	H9268	增强转导效率的阳离子聚合物
六亚甲基溴化铵（Polybrene）
含羧苄青霉素的 LB 琼脂平板
含羧苄青霉素的 LB 培养基
低分子量 DNA Marker	New England Biolabs	N3233S
Nanodrop 分光光度计	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 预混液	New England Biolabs	M0544L
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	低血清培养基
质粒大提纯化试剂盒	Qiagen	12963
pMD2.G（包膜质粒）	Addgene	质粒 #12259	慢病毒系统
psPAX2（包装质粒）	Addgene	质粒 #12260	慢病毒系统
嘌呤霉素	Wisent	400-160-UG
QIAquick 凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
Qubit dsDNA BR 定量试剂	ThermoFisher Scientific	Q32853
Qubit 荧光计	ThermoFisher Scientific	Q33226
RNA酶A（RNAse A）	Invitrogen	12091021
S.O.C. 复苏培养基	Invitrogen	15544034
SYRB Safe DNA 凝胶染料	ThermoFisher Scientific	S33102
多伦多基因敲除CRISPR文库（TKOv3）- 含Cas9	Addgene	Addgene ID #90203	全基因组CRISPR文库，包含Cas9，共71,090条sgRNA
多伦多基因敲除CRISPR文库（TKOv3）- 不含Cas9	Addgene	Addgene ID #125517	全基因组CRISPR文库，不含Cas9，共71,090条sgRNA
Tris-EDTA（TE）溶液，pH 8.0
UltraPure 琼脂糖	ThermoFisher Scientific	16500500
Wizard 基因组DNA纯化试剂盒	Promega	A1120
X-tremeGENE 9 DNA 转染试剂	Roche	06 365 809 001	脂质类转染试剂