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方法文章

哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

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DOI：

10.3791/59780

⸱

2019年9月4日

 ,  ,  ,  , 
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

CRISPR-Cas9 技术提供了一种高效的方法，可精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表了一种进行全基因组遗传筛选的新手段。本文提供了一个详细方案，阐述了成功实施混合式全基因组 CRISPR-Cas9 筛选所需的各个步骤。

摘要

利用CRISPR-Cas系统进行基因组编辑极大地提升了精确编辑多种生物基因组的能力。在哺乳动物细胞中，该技术为功能基因组学研究提供了开展全基因组遗传筛选的新手段。针对所有开放阅读框的向导RNA（sgRNA）文库，使得在单一细胞池中可简便地产生数千种遗传扰动，并可通过筛选特定表型，以无偏倚且系统化的方式揭示基因功能及细胞过程。CRISPR-Cas筛选为研究人员提供了一种简单、高效且低成本的方法，用于解析细胞表型的遗传基础。此外，对不同细胞系或不同类型癌症中开展的筛选进行差异分析，可鉴定在肿瘤细胞中具有情境依赖性必需性的基因，从而揭示特异性抗癌治疗的潜在靶点。在人类细胞中开展全基因组筛选可能具有挑战性，因其涉及数千万细胞的操作以及大规模数据的分析。这些筛选的诸多细节，例如细胞系的特征鉴定、CRISPR文库的选择，以及在分析过程中对CRISPR技术局限性与能力的理解，常常被忽视。本文提供了一套详细的实验方案，用于成功实施基于混合型全基因组CRISPR-Cas9筛选。

引言

CRISPR-Cas 是成簇规律间隔短回文重复序列及其相关核酸酶（clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated nuclease）的缩写，由一种单一的核酸酶蛋白（例如 Cas9）与合成的向导 RNA（sgRNA）组成复合物。该核糖核蛋白复合物可将 Cas9 酶靶向至基因组特定位点，诱导产生双链 DNA 断裂1。双链断裂可通过同源定向修复（HDR）途径修复，但更常见的是通过易错的非同源末端连接（NHEJ）途径进行修复，后者常导致插入和/或缺失（INDELS），从而频繁破坏基因功能1。CRISPR 技术具有高效性和简便性，实现了前所未有的基因组靶向精度，远超以往的基因组编辑技术（如锌指核酸酶（ZNF）或转录激活因子样效应物核酸酶（TALENS）），后两者均存在设计复杂度高、转染效率低以及多重基因编辑能力受限等问题2。

基于CRISPR单导向RNA的基因组编辑技术在基础研究中的应用，使科学家能够高效且低成本地探究单个基因的功能以及遗传相互作用网络的拓扑结构。相较于早期的遗传扰动技术，如RNA干扰（RNAi）和基因捕获诱变，CRISPR-Cas系统在实现全基因组范围的功能筛选方面具有显著优势。特别是，RNAi技术存在较高的脱靶效应和基因敲低不完全的问题，导致其敏感性和特异性低于CRISPR3,4,5；而基因捕获方法仅适用于单倍体细胞进行功能缺失筛选，限制了可研究的细胞模型范围6。CRISPR能够实现完全的基因敲除，从而提供一个生物学上更为稳健的系统，用于研究突变表型，具有背景噪声低、脱靶效应最小化以及不同试剂间活性一致等优点5。目前，靶向全人类基因组的CRISPR-Cas9 sgRNA文库已广泛可得，可在单次实验中同时实现数千个基因的敲除3,7,8,9。

我们开发了一套独特的全基因组CRISPR-Cas9 sgRNA慢病毒文库，称为多伦多敲除文库（Toronto Knock-out，TKO文库）（可通过Addgene获取），该文库结构紧凑且序列经过优化，有助于实现高分辨率的功能基因组筛选。最新的TKOv3文库利用实证数据对71,090条sgRNA进行编辑效率优化，靶向约18,000个人类蛋白编码基因10。此外，TKOv3还提供单组分文库形式（LCV2::TKOv3，Addgene编号#90294），可在同一载体上共表达Cas9和sgRNA，从而无需构建稳定表达Cas9的细胞系，使得在多种哺乳动物细胞类型中均可开展全基因组水平的基因敲除研究。TKOv3 также提供不含Cas9的载体版本（pLCKO2::TKOv3，Addgene编号#125517），可用于已表达Cas9的细胞中11。

通过将全基因组范围的CRISPR-Cas9编辑细胞群体暴露于不同的生长条件下，并利用高通量测序对随时间变化的sgRNA丰度进行定量，可检测携带可追踪遗传扰动的细胞的丢失或富集情况。CRISPR基因敲除文库可用于鉴定在受到扰动后导致细胞适应性缺陷、调节药物敏感性（例如敏感或耐药基因）、调控蛋白质表达（例如报告基因）或维持特定信号通路功能及细胞状态所必需的基因12,13,14。例如，在癌细胞系中进行差异适应性筛选，可同时识别出癌基因的耗竭或减少以及抑癌基因的富集或增加3,14,15。类似地，使用中等剂量的治疗性药物可揭示与药物耐药性和增敏相关的基因16,17。

本文提供了一种详细的基因组规模CRISPR-Cas9功能缺失筛选方案，涵盖从文库构建、筛选操作到数据分析的全过程，适用于在哺乳动物细胞中使用多伦多基因敲除文库（TKOv1或v3）进行筛选。尽管本方案已针对多伦多基因敲除文库的筛选进行了优化，但其同样可适用于所有CRISPR sgRNA混合文库，并具备可扩展性。

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方案

以下实验应遵循研究所环境健康与安全办公室的指南。

1. 混合CRISPR sgRNA慢病毒文库质粒扩增

  1. 将预制的 CRISPR sgRNA 质粒 DNA 文库用 TE 缓冲液稀释至 50 ng/μL（例如 TKOv3）。
  2. 使用电转感受态细胞进行电穿孔。按照以下说明设置总共四次电穿孔反应。
    1. 将 2 μL 浓度为 50 ng/μL 的 TKO 文库加入到冰上预冷的 1.0 mm 电转杯中的 25 μL 解冻电转感受态细胞中。
    2. 按照制造商推荐的最佳条件进行电穿孔。脉冲后 10 秒内，向电转杯中加入 975 μL 恢复培养基（或 SOC 培养基）。
    3. 将电穿孔后的细胞转移至培养管中，并加入 1 mL 恢复培养基。在 37 °C、250 rpm 条件下于摇床中孵育 1 小时。
  3. 设置稀释平板以滴定文库并估算转化效率。
    1. 合并所有 8 mL 回收的细胞并充分混匀。取 10 μL 混合后的细胞加入 990 μL 恢复培养基中，进行 800 倍稀释，并充分混匀。
    2. 取 20 μL 稀释液涂布于预热的 10 cm LB + 羧苄青霉素（100 µg/L）琼脂平板上。该操作相当于对转化子进行 40,000 倍稀释，用于计算转化效率。
    3. 将回收的细胞各取 400 μL 涂布于共 20 个预热的 15 cm LB + 羧苄青霉素琼脂平板上。在 30 °C 下孵育 14–16 小时。
      注意：在此较低温度下培养可最大限度减少长末端重复序列（LTR）之间的重组18。
    4. 为计算转化效率，计数 40,000 倍稀释平板上的菌落数（步骤 1.3.2）。将计得的菌落数乘以 40,000，得到所有平板上的总菌落数。若总菌落数代表的文库覆盖度至少达到每个 sgRNA 对应 200 倍菌落（最佳为 500–1000 倍），则可继续后续操作。
      1. 例如，TKOv3 文库（含 71,090 个 sgRNA）所需的最少菌落数为 1.4 × 107，相当于每个 sgRNA 对应 200 倍菌落。若菌落代表性不足，则根据稀释平板上的菌落数，在步骤 1.2 中增加电穿孔反应次数，以达到最低文库覆盖度。
  4. 按以下方法收集菌落
    1. 向每个 15 cm 平板中加入 7 mL LB + 羧苄青霉素（100 µg/L）培养基，用细胞刮刀刮下菌落。使用 10 mL 移液器将刮取的细胞转移至无菌的 1 L 锥形瓶或瓶中。
    2. 再次用 5 mL LB + 羧苄青霉素培养基冲洗平板，并将冲洗液转移至瓶中。
    3. 对所有平板重复上述操作，将 20 个平板的细胞汇集至一个无菌瓶中。
  5. 在室温（RT）下用磁力搅拌器搅拌收集的细胞 1 小时，以打散细胞团块。将细胞转移至预先称重的离心瓶中，在 7,000 × g 条件下离心以沉淀细菌，弃去上清液。
  6. 称量湿菌体沉淀的重量，减去离心瓶的重量，得到湿菌体沉淀的最终重量。根据每根层析柱可处理的菌体沉淀量，选用大提或超大提质粒纯化试剂盒进行质粒 DNA 的纯化。

2. 大规模CRISPR sgRNA文库慢病毒生产

注意：本方案的此部分所有步骤均须在BSL2+级设施中的II级A2型生物安全柜内进行。

  1. 根据每块15 cm培养皿通常可收获18 mL病毒液的估计值，计算病毒生产所需的15 cm培养皿数量。
  2. 通过在低抗生素生长培养基（DMEM + 10% FBS + 可选：0.1x 青霉素/链霉素）中接种HEK-293T包装细胞进行转染前准备，每块15 cm培养皿接种8 × 106个细胞，培养基体积为20 mL。将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。确保转染时细胞融合度达到70%–80%，且分布均匀。
  3. 次日，按照表1中列出的配方为15 cm培养皿配制三种转染质粒混合物。计算单次转染所需的质粒量，并为待转染的培养皿数量额外增加一份，配制总体质粒混合液。
  4. 按照表2中说明为每次转染配制脂质体转染试剂。将减血清培养基分装至若干个1.5 mL微量离心管中，数量与待转染的培养皿数一致。加入转染试剂，轻轻混匀，在室温下孵育5分钟。
  5. 孵育5分钟后，向转染试剂中加入单次转染所需的DNA量，使转染试剂与DNA的质量比为3:1（µg）。轻轻混匀后，在室温下孵育30分钟。
    注意：后续转染可分批进行，每次不超过5组，间隔5分钟，以优化时间并避免过度孵育。
  6. 30分钟孵育结束后，小心将每份转染混合物逐滴加入对应的包装细胞培养皿中。使用1 mL移液器吸头，以环形或之字形方式缓慢滴加，避免扰动细胞单层。将细胞在37 °C、5% CO2条件下继续孵育18小时。
  7. 配制病毒收获培养基：500 mL DMEM培养基 + 32 mL BSA储备液（20 g/100 mL，溶于DMEM，用0.22 µm滤器过滤除菌）+ 5 mL 100x 青霉素/链霉素。
  8. 18小时后，移除培养基（需妥善处理慢病毒废弃物，例如在丢弃前用1%次氯酸钠溶液孵育30分钟）。轻柔地向每块培养皿中加入18 mL病毒收获培养基。将细胞在37 °C、5% CO2条件下继续孵育18小时。
  9. 24小时后，检查包装细胞是否出现异常或融合的形态，作为病毒高效产生的指标。随后，收集所有上清液，转移至无菌的锥形离心管中，完成慢病毒的收获。
  10. 将含有病毒的上清液在300 ×g条件下离心5分钟，沉淀包装细胞。将上清液小心分装至无菌聚丙烯管中，注意不要扰动沉淀。
  11. 病毒可短期储存于4 °C（少于1周），或立即储存于-80 °C以长期保存。为避免反复冻融，应将大规模制备的病毒分装为单次使用体积后进行长期储存。

3. 筛选用细胞系的表征

  1. 选择所需细胞系。
    1. 测量并记录细胞的近似倍增时间。
    2. 确定在选定的组织培养容器（如15 cm组织培养皿）中培养细胞时，每3–4次细胞倍增所需的最适细胞接种密度。
  2. 确定用于筛选含嘌呤霉素抗性标记的TKO文库时，在目标细胞系中使用的嘌呤霉素浓度，步骤如下：
    1. 在12孔板中以所需密度接种细胞，使其在72小时后达到汇合，然后过夜培养（37 °C，5% CO₂2).
    2. 第二天，更换为含有不同浓度嘌呤霉素稀释梯度的培养基 0 μg/mL 到 10 μg/mL，在 0.5 μg/mL 增量。将细胞孵育48小时。
    3. 48小时后，通过细胞计数或alamarBlue染色检测细胞活力。
    4. 确定在48小时内杀死100%细胞的最低浓度，并在步骤4.6和5.2.6中使用该浓度筛选CRISPR文库转导的细胞群体。
      注意：对于倍增时间较长的细胞系，可耐受更长时间的嘌呤霉素孵育。在这些情况下，需针对所需孵育时间确定杀灭曲线 <3次细胞倍增。尽量缩短筛选前的筛选时间，以避免必需基因在筛选开始前丢失。
  3. 检测细胞对六甲溴铵（hexadimethrine bromide）的敏感性（最高至 8 μg/mL通过与测定嘌呤霉素敏感性相同的方法（步骤3.2）进行剂量反应曲线实验。若观察到毒性，则 <8 μg/mL 六亚甲基溴化物，不可使用。

4. 用于确定感染复数（MOI）的 pooled CRISPR 慢病毒文库的功能性滴定

  1. 解冻一份新鲜的混合CRISPR sgRNA文库慢病毒（例如，LCV2::TKOv3），并置于冰上保存。
  2. 设计一系列待测试的病毒体积，范围在0–2 mL之间（即0 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL和2 mL）。
  3. 收集靶细胞，并以每15 cm培养皿所需密度接种，使细胞在72小时内达到汇合状态。
  4. 针对每个待测试的病毒体积，准备两个重复培养皿。向其中加入细胞、病毒、六亚甲基溴化铵（8 µg/mL）以及培养基，最终体积为20 mL。充分混匀后，将培养皿水平放置于培养箱中，于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。
  5. 24小时后，移除含病毒的培养基并妥善处理（处理慢病毒废弃物时需采取生物安全防护措施）。可选步骤：用预温的PBS轻轻洗涤培养皿，以去除残留病毒。
  6. 对于每种病毒感染条件，向其中一个重复培养皿更换含嘌呤霉素的20 mL新鲜培养基，其浓度为第3节中确定的致死浓度；向另一个培养皿加入20 mL不含嘌呤霉素的新鲜培养基。于37 °C、5% CO2条件下继续培养48小时。
  7. 48小时后，确认经嘌呤霉素处理的未感染细胞（0 mL病毒组）已全部死亡。分别收集所有培养皿中的细胞，并通过反复轻柔吹打使细胞充分分散。
  8. 对所有培养皿的细胞进行计数，并通过比较加嘌呤霉素与不加嘌呤霉素组的细胞数量（即±嘌呤霉素）来计算每种病毒体积对应的感染复数（MOI）。
  9. 绘制结果图表，确定在相同组织培养条件下，使细胞在嘌呤霉素筛选下的存活率为30%–40%的病毒体积。在后续筛选实验中，使用该病毒体积以实现0.3–0.4的MOI。

5. 初次筛选感染、筛选与细胞传代

  1. 选择在整个筛选过程中需维持的CRISPR sgRNA文库覆盖度（推荐最低为200倍覆盖）。
    1. 根据文库覆盖度，确定每种sgRNA维持该覆盖度所需的细胞数量，以及在MOI为0.3时感染所需的细胞数量（表3）。
    2. 确定设置感染所需的培养板数量（表4）。
  2. 用CRISPR文库感染细胞
    1. 收集细胞，并将所需数量的细胞接种至每个15 cm培养皿中。
    2. 向所有培养皿中加入六甲溴铵（8 µg/mL）。
    3. 向筛选组和对照2组的培养皿中加入MOI为0.3所需的病毒感染体积；对于对照1组，不加病毒，用培养基补足相应体积。
    4. 通过倾斜轻轻混匀各培养皿，然后将培养皿放入培养箱中，确保其水平放置。
      注：可通过将病毒、培养基和六甲溴铵的主混合液加入悬浮细胞中，再进行铺板，实现批量感染。
    5. 病毒感染24小时后，吸除培养基，并向筛选组和对照1组的培养皿中加入含嘌呤霉素的新鲜培养基（浓度依据步骤3.2.4确定），向对照2组培养皿中加入不含嘌呤霉素的新鲜培养基。继续培养细胞48小时（37 °C，5% CO2）。
    6. 在加入嘌呤霉素48小时后，确认未感染的细胞（对照1组）已全部死亡，以验证嘌呤霉素的有效性，随后收集被感染的细胞。
  3. 收集感染后的细胞群体并进行传代
    1. 将所有筛选培养皿中的嘌呤霉素筛选后细胞收集至一个无菌容器中，各对照组的细胞分别单独收集。通过轻柔反复吹打使细胞分散均匀。
    2. 分别对混合后的筛选细胞、对照1组和对照2组的细胞进行计数，并计算每1 mL中的细胞数量。
    3. 按以下方式计算实际达到的MOI和覆盖倍数：
      MOI公式：每个筛选板的总细胞数 ÷ 对照板细胞数；筛选实验方法。
      覆盖倍数公式：（感染细胞数 × 最终MOI）÷ sgRNA文库大小，方程。
    4. 在达到选定文库覆盖度时，从混合细胞中收集三份细胞沉淀作为基因组DNA提取样本。以500 × g 离心5分钟，用PBS洗涤，标记试管后于-80 °C冷冻干燥（这些为T0参考样本）。
    5. 将感染后的细胞池分为三个重复组（例如重复A、重复B、重复C），同时确保每个重复组内维持文库覆盖度。以常规扩增时相同的接种密度接种细胞，每个重复组的各培养皿使用相同数量的细胞，且各重复组之间的总细胞数保持一致。
    6. 继续传代细胞，并根据细胞系特性每3–8天从每组混合感染细胞中收集三份细胞沉淀用于基因组DNA提取，持续至完成15–20次细胞倍增。每次传代时，将同一重复组内所有培养皿的细胞合并（即所有来自重复A的培养皿的细胞重新混合，所有来自重复B的培养皿的细胞重新混合，依此类推）。
    7. 为每个细胞沉淀标注时间（T）和重复编号，表示该样本相对于T0的收集天数（例如T3_A、T3_B、T3_C等）。
  4. 对于负筛选药物实验，在T0之后至少恢复一次传代再开始处理。在T3或T6时，将每个重复组（A、B、C）的细胞按步骤5.3.5中相同的接种密度分为药物处理组和对照组。
    1. 分别汇集药物处理组中每个重复所需达到文库覆盖度的细胞数量，加入中等浓度的药物（IC20–IC50），接种细胞并培养（37 °C，5% CO2）至下一次传代。
    2. 分别汇集溶剂对照组中每个重复所需达到文库覆盖度的细胞数量，加入与药物等体积的溶剂对照（<0.5% v/v），接种细胞并培养（37 °C，5% CO2）至下一次传代。
    3. 继续传代细胞，并按照步骤5.3.5所述，每3天收集一次细胞沉淀用于基因组DNA提取，每次传代时更新药物或溶剂处理。
  5. 对于正筛选或药物抗性筛选，将每个重复组按达到文库覆盖度所需的细胞数进行分组，向每个重复组加入IC90浓度的药物。在IC90浓度下，大部分细胞将被杀死。允许抗性细胞群体生长，并收集细胞沉淀（1–2 × 107 个细胞）用于基因组DNA提取。

6. CRISPR 样本制备与测序

  1. 基因组DNA纯化
    1. 将冷冻的细胞沉淀在室温下解冻5–10分钟。
    2. 向含有细胞沉淀的50 mL离心管中加入1.4 mL PBS。涡旋振荡20秒以重悬细胞，静置1分钟。如有需要，使用P1000移液器吹打15次以分散残留的细胞团块。若细胞来自15 mL或1.5 mL离心管，先用1 mL PBS重悬细胞，转移至50 mL离心管中，并用400 µL PBS冲洗原管。
    3. 向重悬的细胞中加入5 mL细胞核裂解液。使用10 mL移液器上下吹打5次，充分混匀样品。
    4. 向核裂解液中加入32 µL RNase A（20 mg/mL；终浓度为100 µg/mL），通过翻转离心管5次混匀。37°C孵育15分钟，随后在室温下冷却10分钟。
    5. 向裂解液中加入1.67 mL蛋白质沉淀液，剧烈涡旋振荡20秒。混匀后可能观察到少量蛋白团块。
    6. 在室温下以4,500 × g离心10分钟。
    7. 使用10 mL移液器将上清液转移至含有5 mL异丙醇的50 mL离心管中。轻轻翻转混匀10次，直至观察到DNA析出。
      注：DNA表现为白色、丝状的可见絮状物。
    8. 在室温下以4,500 × g离心5分钟，使DNA沉淀。
    9. 使用10 mL移液器小心移除上清液，避免扰动DNA沉淀。向DNA沉淀中加入5 mL室温的70%乙醇。轻轻旋转离心管，清洗DNA沉淀及管壁。
    10. 在室温下以4,500 × g离心5分钟。
    11. 使用10 mL移液器小心移除70%乙醇，避免扰动DNA沉淀。在室温下将基因组DNA空气干燥10分钟。
    12. 向离心管中加入400 µL TE溶液，65 °C孵育1小时以溶解DNA。每15分钟轻轻弹击管壁混匀一次。若DNA未完全溶解，可继续在65 °C孵育1小时（每15分钟轻弹一次），随后在4 °C过夜放置。
    13. 在室温下以4,500 × g离心1分钟，将基因组DNA转移至1.5 mL低吸附离心管中。
    14. 使用分光光度计（测定总核酸含量）和荧光计（测定双链DNA含量）对基因组DNA进行定量并检测纯度。
  2. 若sgRNA的下游PCR扩增存在问题，可选择性地对基因组DNA进行沉淀处理，步骤如下：
    1. 将400 µL基因组DNA转移至1.5 mL微量离心管中。
    2. 加入18 µL 5 M NaCl（终浓度0.2 M）和900 µL 95%乙醇。
    3. 翻转混匀10次，确保充分混合，随后在室温下以16,000 × g离心10分钟。
    4. 小心移除上清液，避免扰动DNA沉淀。用500 µL 70%乙醇洗涤DNA沉淀，轻轻旋转离心管以充分洗涤。
    5. 在室温下以16,000 × g离心5分钟。
    6. 小心移除上清液，避免扰动DNA沉淀。在室温下将基因组DNA空气干燥10分钟。
    7. 加入300 µL TE溶液，参照步骤6.1.12所述方法溶解DNA。
    8. 参照步骤6.1.14所述方法，对基因组DNA进行定量并检测纯度。
  3. CRISPR测序文库制备
    1. 使用总计100 μg基因组DNA，按照表5设置PCR 1反应。每50 μL反应中加入3.5 μg基因组DNA，并设置多个相同的50 μL反应以达到所需的测序覆盖度。表6列出了扩增LCV2::TKOv3测序文库的引物序列示例。表7列出了扩增pLCKO2::TKOv3测序文库的引物序列示例。
    2. 使用表8所示程序在PCR仪中扩增PCR 1反应。
    3. 取2 μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，检测PCR 1扩增结果。PCR 1产物大小为600 bp。
    4. 将每个基因组DNA样品的所有50 μL PCR 1反应产物合并，涡旋混匀。
    5. 每个样品设置一个PCR 2反应（50 μL），按照表9进行配置，使用5 μL合并后的PCR 1产物作为模板。为每个样品使用独特的index引物组合，以便后续测序文库的混合。
    6. 使用表10所示程序在PCR仪中扩增PCR 2反应。
    7. 在制胶前，使用0.1 N HCl清洗琼脂糖凝胶设备10分钟。制备含DNA染料的2%琼脂糖凝胶，用于纯化PCR 2扩增产物。
    8. 在低电压下（运行1.0–1.5小时）将PCR 2产物在2%琼脂糖凝胶上电泳。PCR 2产物大小为200 bp。
    9. 在蓝光透射仪上观察PCR产物，切下200 bp条带，使用凝胶回收试剂盒从凝胶切片中纯化DNA。使用分光光度计和荧光计对测序文库进行定量并检测纯度。
      注：典型的凝胶纯化测序文库浓度范围为5–10 ng/μL，总产量为150–300 ng。
  4. 高通量测序
    1. 在新一代测序仪上对CRISPR测序文库进行测序。
    2. 对参考T0样品进行更高深度的测序，测序深度为文库覆盖400–500倍。对剔除筛选实验的时间点样品，测序深度至少为200倍。对于强阳性筛选实验，测序深度至少50倍即可有效识别富集的sgRNA。
      注：对T0样品进行测序至关重要，可用于确定特定筛选实验中文库的代表性，并作为后续分析sgRNA随时间变化倍数的参考基准。

7. 数据分析

  1. 使用Bowtie等程序将序列读段比对到参考文库，参数设置如下：-v2（允许两个错配）和 -m1（剔除比对到文库中一个以上序列的任何读段）。
  2. 将每个样本中每个sgRNA的唯一比对读段数归一化至每样本1000万条读段，方法如下：
    标准化sgRNA序列读数方程；用于读数分析的公式，分子实验。107
  3. 计算每个时间点（Tn）每个重复样本中每条sgRNA相对于T0样本（Tn/T0）的log2倍数变化。为所有读数计数添加0.5的伪计数，以避免因零值导致的不连续性。排除在
  4. 使用基因必需性贝叶斯分析（BAGEL）算法分析倍数变化 ，使用先前定义的核心必需和非必需训练集19 用于基因必需性筛选（补充表 S1或 DrugZ 用于药物筛选20.
  5. 使用BF得分计算筛选性能评估的精确率和召回率。以步骤7.4中的必需基因集作为真实阳性列表，结合上述BF得分子集，输入Python的Scikit-learn库中的precision_recall_curve函数进行计算。或者，也可使用R语言中的PRROC包执行相同分析。
  6. 计算每个基因所有向导序列的平均倍数变化。使用 R 或等效软件对必需基因和非必需基因（见步骤 7.4）生成密度图。在 R 中，若 x.ess 是包含必需基因的对数倍数变化值的向量，x.nonEss 是包含非必需基因的对数倍数变化值的向量，则使用以下命令绘图：
    plot(密度(x.ess), xlab="平均logFC", col="red", lwd=2)
    lines(密度(x.nonEss), col="blue", lwd=2)
    注意：有关 Python 版本详情及所用软件包，请参见 scikit-learn v0.19.1：（由 Pedregosa 等人发布）21).

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结果

基因组规模CRISPR筛选工作流程概述

图1展示了混合CRISPR筛选的工作流程概览：首先以较低的感染复数（MOI）将靶细胞与CRISPR文库慢病毒进行感染，以确保单次整合事件及文库的充分代表性（通常为200至1000倍覆盖）。感染后，使用抗生素嘌呤霉素处理细胞，以筛选出成功转导的细胞。筛选完成后，收集基础时间点（T0）的细胞沉淀，用于评估筛选起始时文库的分布情况。剩余细胞包含遗传扰动的异质性群体，每3至4天传代一次，并始终保持所需的文库代表性，共进行15至20次细胞倍增，以使基因编辑及其效应得以显现。对于药物处理的筛选实验，通常在细胞从病毒感染和嘌呤霉素筛选中恢复后的T3或T6时间点加入药物。每次传代时，在保持所需文库代表性的条件下收获细胞，提取基因组DNA，并在预定的时间点通过高通量测序检测向导RNA的丰度。

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讨论

由于CRISPR技术使用简便且具有高度可塑性，已被广泛采用作为精确基因组编辑的首选工具。混合CRISPR筛选提供了一种在单次实验中研究数千种遗传扰动的方法。在混合筛选中，sgRNA文库作为分子条形码，因为每条序列都是唯一的，并可映射至其靶向基因。通过从细胞群体中提取基因组DNA，可通过高通量测序定量sgRNA的丰度，从而确定引起特定表型的基因。采用大规模并行测序方法对样本中的sgRNA进行定量，这意味着多个独立的细胞群体可合并至同一条测序通道中，以降低测序成本。

在开展大规模筛选项目之前，拥有一个经过充分表征且技术上优化的模型至关重要。在选择用于筛选的细胞系时，遗传背景、生长速率和转导效率是需要考虑的重要因素。例如，细胞的生长速率和编辑效率将决定该模型的可扩展性及技术适用性。为了充分覆盖大规模的sgRNA文库，需要数千万个细胞，因此对于倍增时间较长或增殖能力较差的细胞系（例如原代细胞），细胞数量可能成为限制筛选可行性的因素。应根据细胞的生长速率，相应地选择适合筛选的细胞培养条件，如细胞接种密度和培养板规格。建议在实际操作和技术上可行的前提下，使用最大规格的培养容器进行细胞培养。

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作由加拿大基因组计划、安大略研究基金以及加拿大卫生研究院（MOP-142375，PJT-148802）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 微米滤膜
30°C 培养皿培养箱
37°C 摇床培养箱
37°C、5% CO2 培养箱
5 M NaClPromegaV4221
50X TAE 缓冲液BioShopTAE222.4
6 N 盐酸溶液BioShopHCL666.500
95% 乙醇
刃天青钠（Alamar blue）ThermoFisher ScientificDAL1025
蓝光透射仪ThermoFisher ScientificG6600
牛血清白蛋白，热激分离，第五组分，纯度 ≥98%，生物技术级BioshopALB001.250
杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modification of Eagles Medium）Life Technologies11995-065细胞培养基
电穿孔比色皿BTX45-0134
电穿孔仪BTX45-0651
Endura 电转化感受态细胞Lucigen90293
胎牛血清GIBCO12483-020
HEK293T 包装细胞ATCCCRL-3216建议传代数 <15
六亚甲基溴化铵（Polybrene）SigmaH9268增强转导效率的阳离子聚合物
六亚甲基溴化铵（Polybrene）
含羧苄青霉素的 LB 琼脂平板
含羧苄青霉素的 LB 培养基
低分子量 DNA MarkerNew England BiolabsN3233S
Nanodrop 分光光度计ThermoFisher ScientificND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 预混液New England BiolabsM0544L
Opti-MEMLife Technologies31985-070低血清培养基
质粒大提纯化试剂盒Qiagen12963
pMD2.G（包膜质粒）Addgene质粒 #12259慢病毒系统
psPAX2（包装质粒）Addgene质粒 #12260慢病毒系统
嘌呤霉素Wisent400-160-UG
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704
Qubit dsDNA BR 定量试剂ThermoFisher ScientificQ32853
Qubit 荧光计ThermoFisher ScientificQ33226
RNA酶A（RNAse A）Invitrogen12091021
S.O.C. 复苏培养基Invitrogen15544034
SYRB Safe DNA 凝胶染料ThermoFisher ScientificS33102
多伦多基因敲除CRISPR文库（TKOv3）- 含Cas9AddgeneAddgene ID #90203全基因组CRISPR文库，包含Cas9，共71,090条sgRNA
多伦多基因敲除CRISPR文库（TKOv3）- 不含Cas9AddgeneAddgene ID #125517全基因组CRISPR文库，不含Cas9，共71,090条sgRNA
Tris-EDTA（TE）溶液，pH 8.0
UltraPure 琼脂糖ThermoFisher Scientific16500500
Wizard 基因组DNA纯化试剂盒PromegaA1120
X-tremeGENE 9 DNA 转染试剂Roche06 365 809 001脂质类转染试剂

参考文献

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CRISPR CRISPR RNA
哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选
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