高产量细胞外囊泡与病毒分离纯化

摘要

本方案通过结合细胞外囊泡（EV）沉淀、密度梯度超速离心和颗粒捕获技术，高效且高得率地将细胞外囊泡与病毒颗粒分离，从而实现简化的操作流程并降低起始样本体积需求，最终获得可重复的细胞外囊泡制备物，适用于所有细胞外囊泡相关研究。

摘要

目前细胞外囊泡（EV）研究领域的主要难题之一是在病毒感染环境下获得高纯度的EV制备物。本方法旨在将EV与病毒颗粒（如HIV-1）分离，相较于传统的超速离心法，具有更高的效率和得率。我们的实验流程包含三个步骤：EV沉淀、密度梯度分离和颗粒捕获。在完成颗粒捕获后，可直接进行后续检测分析（如蛋白质印迹和PCR）。与其他分离方法（如超速离心法）相比，该方法的优势在于仅需极小的起始样本体积。此外，相较于需要多次超速离心的其他EV分离方法，本方法操作更为简便。然而，该方法在功能性EV检测方面的应用存在一定局限，因为从颗粒上洗脱出完整EV较为困难。此外，该方法主要适用于基础科研环境，尚不具备商业化应用的可行性。

引言

以外泌体（exosome）为代表的细胞外囊泡（EV）研究，主要聚焦于直径在30–120 nm之间、并具有三种四跨膜蛋白标志物CD81、CD9和CD63的EV亚群，其发展在很大程度上依赖于分离和纯化目标囊泡的方法学进步。由于现有技术复杂且耗时，所获得的样本通常包含通过不同途径产生、在内容物、大小和密度上具有高度异质性的囊泡群体，从而限制了对多层面机制的深入解析。尽管这一问题几乎影响所有EV研究，但在病毒感染背景下研究EV时尤为关键，因为病毒颗粒（virion）和病毒样颗粒（VLP）的直径可能与目标囊泡相近。例如，人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的直径约为100 nm，与多种EV的尺寸大致相同。鉴于此，我们设计了一种新型的EV分离流程，以解决上述问题。

目前细胞外囊泡（EV）分离的金标准是超速离心法。该技术利用不同囊泡的密度差异，通过差速离心使高密度颗粒与低密度颗粒在各阶段发生差异性沉降，从而实现分离^1,2。该方法需要经过多个低速离心步骤，以去除完整细胞（300–400 × g，10 分钟）、细胞碎片（约 2,000 × g，10 分钟）以及凋亡小体/大囊泡（约 10,000 × g，10 分钟）。初步纯化后，再通过高速超速离心（100,000–200,000 × g，1.5–2 小时）使EV沉淀。为进一步提高EV纯度，还需进行洗涤步骤，但这会导致所分离EV数量减少，从而降低总得率^3,4。此外，该方法需要大量细胞（约 1 × 10⁸ 个）和大体积样本（> 100 mL）才能获得理想结果，这进一步限制了其应用。

为应对日益增长的关切，近年来利用亲水性聚合物沉淀囊泡已成为一种有用的技术。聚乙二醇（PEG）或其他相关沉淀试剂可使用户通过将样品与所选试剂孵育，再经过一次低速离心，即可沉淀样品中的囊泡、病毒以及蛋白质或蛋白质-RNA聚集体^1,2,5。我们此前曾报道，与传统的超速离心法相比，使用PEG或相关方法沉淀细胞外囊泡（EVs）可显著提高得率⁶。该策略快速、简便，无需额外昂贵设备，易于放大，并能保持EV的结构完整性。然而，由于该方法具有非特异性，所得样品中包含多种成分，如游离蛋白质、蛋白质复合物、多种EV以及病毒颗粒，因此需要进一步纯化以获得目标组分^1,2,7,8。

为了克服通过不同沉淀方法获得的细胞外囊泡（EVs）存在的异质性问题，常采用密度梯度超速离心法（DG）根据颗粒的密度实现更优的分离。该方法利用密度梯度介质（如碘克沙醇或蔗糖）建立阶梯式梯度，从而实现EVs与蛋白质、蛋白复合物以及病毒或病毒样颗粒（VLPs）的分离。需要注意的是，尽管过去认为DG能够更精确地分离EV的不同亚群，但现在已知不同囊泡的大小和密度可能存在重叠。例如，外泌体的漂浮密度为1.08–1.22 g/mL⁹，而来自高尔基体（COPI⁺ 或网格蛋白⁺）的囊泡密度为1.05–1.12 g/mL，内质网来源的囊泡（COPII⁺）则沉降于1.18–1.25 g/mL^1,2,3,4,9。此外，若需将外泌体组分与含有病毒颗粒的组分进行比较，其难度可能取决于目标病毒的密度——除HIV-1外，还存在其他可能与外泌体阳性组分在相同密度下达到平衡的病毒²。

最后，为了进行后续的可视化和功能分析，对细胞外囊泡（EV）样本进行富集是EV研究中的关键步骤。使用能够富集EV的纳米颗粒，特别是直径为700–800 nm的多功能水凝胶颗粒，是获得高浓度EV样本的关键环节。这些纳米颗粒具有高亲和力的芳香族捕获基团，并被多孔的外层筛分壳所包裹，以提高选择性。本研究中使用的纳米颗粒包含两种不同核心捕获基团的制剂（Reactive Red 120 NT80 和 Cibacron Blue F3GA NT82），已证明可增强从多种试剂和生物流体中捕获EV的效果（见材料表）^{6,10,11,12,13,14,15}。这些颗粒可从多种起始材料中便捷地富集EV，包括碘克沙醇组分、细胞培养上清液，以及患者生物流体，如血浆、血清、脑脊液（CSF）和尿液^6,13。

本文介绍的方法通过结合多种技术——EV 沉淀、密度梯度超速离心和颗粒捕获，提高了现有EV纯化技术的效率，简化了操作流程，减少了样本需求量，并提高了产量，从而获得更均一的EV样本，适用于所有EV相关研究。该方法在研究病毒感染过程中EV及其内容物时尤为有用，因为它包含一步0.22 µm过滤，以去除较大的非目标囊泡和病毒样颗粒（VLPs），并通过密度分离总EV群体，从而有效将EV与病毒颗粒区分开来。

方案

1. 细胞外囊泡（EVs）的过滤与沉淀

1. 为制备感染或转染细胞（即细胞系和/或原代细胞）的培养上清液，将约10 mL处于对数生长后期的细胞在适当的培养基（如含10%胎牛血清[FBS]的RPMI或DMEM）中，于37 °C、5% CO₂条件下培养5天。
   注意：所有培养基试剂应无细胞外囊泡（EV）污染，可直接购买（参见材料表），或通过在100,000 × g条件下预先超速离心血清90分钟自制。本方案已成功应用于多种常用细胞系，包括：CEM、Jurkat、293T、U937（未感染细胞系），U1、J1.1、ACH2、HUT102、MT-2（HIV-1和HTLV-1感染细胞系），多种转染细胞，以及原代髓系细胞和T细胞（感染与未感染状态）；然而，该方案亦可用于任何细胞类型，包括需要特殊培养基或培养条件的细胞。不同细胞类型的细胞密度可能需要优化。建议在培养5天后使用尽可能高的细胞密度，同时保持最低程度的细胞死亡。
2. 将培养物在3,000 × g条件下离心5分钟以沉淀细胞，并弃去细胞沉淀。
3. 使用无菌0.22 µm滤器过滤培养上清液，并将滤液收集至洁净离心管中。
4. 向滤过的上清液中加入等体积的聚乙二醇（PEG）沉淀试剂（1:1比例），反复倒置离心管数次以确保混合均匀。
   注意：切勿 涡旋振荡。
5. 将混合物于4 °C过夜（O/N）孵育。
6. 在室温（RT）下以1,500 × g离心30分钟，获得形态异质的EV沉淀。
   注意：EV沉淀通常呈白色或近白色。
7. 弃去去除EV后的培养上清液。
8. 用150–300 µL不含钙和镁的1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬EV沉淀，并置于冰上保存。

2. 密度梯度的构建

1. 将碘克沙醇密度梯度介质与1×PBS混合，在不同的微量离心管中配制11种1 mL的密度梯度溶液，碘克沙醇浓度从6%到18%，以1.2%为增量递增，如图1A所示。
2. 涡旋振荡每支试管以充分混匀。
3. 将各密度梯度溶液逐层加入已预先清洗并干燥的摆动转子超速离心管中，从18%的溶液（#18）开始，至6%的溶液（#6）结束，如图1B所示。
   注意：所有离心管应在装载梯度溶液前，先用10%次氯酸钠溶液喷洒消毒，随后用去离子水冲洗3次，并用无菌去离子水进行最终清洗。
4. 将重悬的EV沉淀（300 µL）小心加至超速离心管中已分层的梯度顶部。
5. 在4 °C条件下，以100,000 × g 离心90分钟。
6. 小心从超速离心管中逐层收集1 mL的各梯度组分，并分别转移至新的微量离心管中。

3. 使用纳米颗粒富集细胞外囊泡组分

1. 使用等体积的 NT80、NT82 和 1× PBS 制备含有 30% 纳米颗粒的悬浮液。
   注意：使用前应涡旋混合，以确保均匀性。
2. 向每根含有密度梯度组分的微量离心管中加入 30 µL 悬浮液，并通过移液器吹打或倒置数次充分混匀。
3. 将含有纳米颗粒并富集 EV 的密度梯度组分微量离心管在 4 °C、约 20 rpm 条件下旋转过夜（O/N）。
4. 在室温下以 20,000 × g 离心 5 分钟，对密度梯度组分微量离心管进行离心。
5. 弃去上清液，并用 1× PBS 将 EV 沉淀洗涤两次。
   注意：纳米颗粒沉淀可在 -20 °C 冻存，或直接用于后续多种检测（如 PCR、Western blot、质谱分析及其他检测）。

4. 下游检测中纳米颗粒沉淀物的推荐制备方法

1. 用于RNA提取
   1. 将沉淀重悬于50 µL经0.001%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理并用0.2 µm滤膜过滤的灭菌去离子水中，然后根据试剂盒制造商的说明书提取RNA。
2. 用于凝胶电泳
   1. 直接将沉淀重悬于15 µL Laemmli缓冲液中。
   2. 在95 °C下加热样品3次，每次3分钟，每次加热之间轻轻涡旋并短暂离心。
   3. 以20,000 x g离心15秒，然后将全部洗脱物直接上样至凝胶。
      注意：为获得最佳结果，应限制上样至凝胶的颗粒物量，并以100 V电压运行凝胶，以确保任何残留颗粒保留在加样孔中。
3. 用于胰蛋白酶消化
   1. 在进行烷基化和胰蛋白酶消化前，将沉淀重悬于20 µL尿素中。纳米颗粒可通过在室温下以14,000 x g离心10分钟沉淀。含有胰蛋白酶消化肽段的样品可转移至新的收集管中。

结果

PEG 沉淀可提高细胞外囊泡（EV）的得率
与传统的超速离心法相比，我们所采用的联合分离方法在EV回收效率方面显著更高，这一点从所需起始材料体积减少了90%即可明显看出。目前，超速离心法是EV分离的金标准，通常需要约100 mL的培养上清液才能制备出足够用于下游检测的EV样品，而我们的新方案仅需10 mL。这一显著减少得以实现，主要得益于使用了PEG EV沉淀试剂，该试剂通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定，可显著提高EV的得率。图2A中的结果（此前已发表⁶）显示，使用10 mL培养上清液时，PEG沉淀法可回收7.27 × 10¹⁰个EV，约为使用相同起始材料通过超速离心法回收数量（1.45 × 10⁸）的500倍。在特定类型的EV——外泌体的分离效率方面也观察到了提升，表现为特征明确的外泌体标志蛋白CD81、CD63和CD9的水平显著升高。通过Western blot分析比较了...

讨论

本方案通过联合分离方法，可提高细胞外囊泡（EV）的得率，并实现病毒与EV的有效分离。在进行沉淀法EV分离、密度梯度（DG）分离及纳米颗粒富集之前，可对相对大量的起始材料（即细胞上清液）进行过滤处理，最终获得约30 µL的浓缩体积，便于直接用于多种下游检测。采用纳米颗粒富集步骤至关重要，因为与传统的超速离心法相比，这些EV富集型纳米颗粒已被证明能更高效地捕获囊泡，从1 mL培养上清液中获得的囊泡数量至少相当于10 mL经超速离心处理的培养上清液所得囊泡量¹⁵。总体而言，本方案整合了多种成熟技术，因此操作难度较低。然而，引入EV富集纳米颗粒属于较新的技术，可能需要根据具体的下游检测或研究的生物学靶标进行故障排查和/或方法优化。我们建议将纳米颗粒与过滤后的细胞培养上清液在4℃孵育过夜。若目标蛋白或RNA在模型系统中丰度较低，可适当延长孵育时间以确保充分捕获目标分子。在下游检测中使用纳米颗粒时，通常可通过将沉淀重悬于各检测所需的样品缓冲液中实现。例如，纳米颗粒可直接重悬于Laemmli缓冲液中用于Western blot分析。为更有效地将捕获物质从纳米颗粒中洗脱出来，建议通过加热和涡旋震荡循环促进...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CEM CD4+ 细胞	NIH 艾滋病试剂计划	117	CEM
不含 Ca 和 Mg 的 DPBS (1x)	Quality Biological	114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer	Systems Biosciences	EXOMAX24A-1	PEG 沉淀试剂
外泌体耗竭型胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	A2720801
胎牛血清	Peak Serum	PS-FB3	血清
HIV-1 感染的 U937 细胞	NIH 艾滋病试剂计划	165	U1
Nalgene 注射器滤器 0.2 µm SFCA	Thermo Scientific	723-2520
Nanotrap (NT80)	Ceres Nanosciences	CN1030	Reactive Red 120 核心
Nanotrap (NT82)	Ceres Nanosciences	CN2010	Cibacron Blue F3GA 核心
Optima XE-980 超速离心机	Beckman Coulter	A94471
OptiPrep 密度梯度介质	Sigma-Aldrich	D1556-250mL	碘克沙醇
SW 41 Ti 摆桶转子	Beckman Coulter	331362
超透明离心管，14 mm × 89 mm	Beckman Coulter	344059