基因编辑技术使研究人员能够相对容易地构建斑马鱼突变体，以研究基因功能。本文提供了一种在斑马鱼中并行进行胚胎基因分型和原位杂交信号定量分析的方法指南。这种无偏倚的方法可提高基于原位杂交的表型分析的准确性。
本文内容
摘要
摘要
原位杂交（ISH）是一种重要的技术，可使研究人员在原位研究 mRNA 的分布，数十年来一直是发育生物学中的关键实验方法。传统上，大多数基因表达研究依赖于对 ISH 信号的视觉评估，这种方法容易引入偏差，尤其是在样本身份已知的情况下。我们此前已报道过一种避免此类偏差并更准确量化 ISH 信号的方法。本文中，我们提供一个简单指南，介绍如何应用该方法对经 ISH 染色的胚胎中目标基因的表达水平进行量化，并将其与相应的基因型相关联。该方法特别适用于对混合基因型样本中空间受限的基因表达信号进行量化，为传统的视觉评分方法提供了一种无偏且准确的替代方案。
引言
基因组编辑技术（ZFN、TALENs 以及近期出现的 CRISPR/Cas9）的出现，使得全球范围内利用这些系统在体内研究特定基因功能的实验室数量大幅增加。斑马鱼尤其适合进行遗传操作，近年来已产生了大量突变体1,2。对于发育生物学家而言，评估基因突变在胚胎发育中表型效应的最常用方法之一是原位杂交（ISH）。当纯合突变体与野生型或杂合子同胞之间缺乏明显的形态学差异时，准确鉴定不同基因型显得尤为关键。
传统的原位杂交（ISH）依赖于对信号强度的定性分析，以推断目标基因与所选标记基因之间的调控相互作用。尽管这种方法有一定用处，但其分析结果容易受到技术变异的影响，并可能因研究者的预期而产生偏差。因此，研究人员开发了一种在对ISH染色胚胎成像后定量基因表达的方法，且无需预先了解其对应基因型。随后进行高效DNA提取和基因分型，使我们能够将基因型与基因表达进行定量关联3。虽然在ISH之后对胚胎进行基因分型已有先例4,5，但基于图像的ISH表达模式定量分析尚未被广泛应用，仅有少数研究报道6,7。目前最常用的方法是视觉评分或计数ISH染色细胞8,9,10，但这些方法均易导致重复性差和研究者主观偏差。该方法特别适用于研究表达模式具有空间限制性的基因变化，例如 runx1 或 gata2b，这两个基因均特异性地表达于主动脉底部的一类称为造血性内皮细胞的特定细胞亚群中11,12。
本文旨在提供一份实用指南，介绍如何使用 Fiji 软件进行图像分析定量13，以及 DNA 提取和基因分型实验方案。本指南旨在以可视化方式展示我们先前发表的方法3。该方法能够准确呈现原位杂交（ISH）检测到的基因表达差异，并客观地将基因表达水平分配至特定基因型。
方案
涉及动物受试者的操作遵循《1986年动物（科学程序）法》的规定，并已获得英国内政部以及当地动物福利与伦理审查机构的批准。
1. 成像原位杂交染色的胚胎
- 配制甘油溶液（50%–80% 溶于 1× PBS 缓冲液中），并混匀溶液（例如，在滚轴混合器上放置至少 5 分钟）。该溶液可在室温下保存数月。
- 原位杂交完成后14,15,16,17，使用 3 mL 巴斯德移液管将胚胎转移至甘油溶液中，并静置至少 5 分钟。若对受精后 24 小时以上（hpf）的胚胎进行成像，可按照文献所述方法进行漂白处理18。
- 准备并标记足够数量的 PCR 管，用于成像后转移原位杂交染色的胚胎。
- 使用 3 mL 巴斯德移液管，将 100% 甘油加入玻璃凹面载玻片的凹孔底部。
- 使用 3 mL 巴斯德移液管，将单个原位杂交染色的胚胎转移至玻璃载玻片上，并在配备数码相机及透射光与反射光照明的体视显微镜下按所需方向调整胚胎位置。
注意：可使用加样枪头来定位胚胎以进行成像，但其他工具（如镊子、解剖针）同样适用。 - 使用第一个胚胎，在所需放大倍数下调节光照强度和曝光时间。同一实验中所有胚胎均应使用相同的成像条件（例如，若对来自杂合突变体互交的 40 个胚胎进行成像，需确保所有胚胎的光照强度、曝光时间和放大倍数一致）。
- 根据需要对尽可能多的胚胎进行成像。每张图像均需标注唯一编号。成像后，将相应胚胎转移至标记有相同编号的 PCR 管/板中。
注意：图像应保存为 TIF 格式，但其他格式也可接受。- 如有需要，可去除 PCR 管/板中的过量甘油。
注意：此时胚胎可在室温下于 PCR 管中保存数周。
- 如有需要，可去除 PCR 管/板中的过量甘油。
2. 提取DNA并对接ISH染色的胚胎进行基因分型
注意：此处采用一种基于HoTSHOT方法的可靠且经济的基因组DNA提取方法19，其DNA提取效率可达95%–100%3。
- 成像完成后，向每根离心管中加入 40–75 µL 碱性裂解缓冲液（例如 HoTSHOT）。
- 在 95 °C 下孵育约 30 分钟，然后将离心管冷却至 4 °C，再加入等体积的中和缓冲液。在 4 °C 下过夜孵育可能有助于提高 PCR 效率。
注意：此时基因组 DNA 可用于基因分型，或在 -20 °C 下保存至需要时使用。 - 根据目标突变的需要，采用适当的方法对样品进行基因分型（例如 HRMA、RFLP）3,20,21。
- 记录每个样品对应的基因型（例如，使用电子表格软件）。
3. 定量分析原位杂交染色胚胎的像素强度（使用 Fiji 软件进行图像分析）
- 为了定量原位杂交（ISH）染色信号强度，按照先前所述方法将所有图像转换为8位灰度图像3。如果图像保存为.TIF文件，可使用Fiji宏进行批量转换3。或者，使用适当的软件将其他格式（例如.JPG）的图像转换为.TIF格式，然后使用Fiji将其转换为8位灰度图像。为方便起见，以下为此前已发表的逐步操作流程3，并做了一些修改。
- 在Fiji中打开图像，并通过 编辑 > 反转 命令反转图像。然后将图像类型更改为8位（图像 > 类型 > 8位）。
- 使用多边形选择工具，在包含信号区域的周围手动绘制感兴趣区域（ROI）。
- 按下 t 键打开ROI管理器。使用ROI管理器中的 测量 命令测量该ROI的信号强度。将“结果”窗口中的 平均值 复制到电子表格软件中。
- 将同一ROI（保持与原始区域相同的大小和形状）移动至斑马鱼未染色的区域，重复步骤3.4以测量背景信号。
- 为获得ISH信号的平均像素强度，需对每个胚胎分别用染色区域的平均强度值减去背景区域的平均强度值。
- 将每个强度值分配给相应的基因型（来自步骤2.3）。
4. 使用适当的统计学方法分析结果
- 将所有数值绘制在同一张Q-Q图上，以识别与正态分布的任何偏差。
注意：正态分布也可通过Kolmogorov-Smirnov检验或Shapiro-Wilk检验进行验证。然而，对于大样本量，这些检验存在较高的假阳性风险。 - 如果数据与正态分布存在显著偏离，应对所有数值进行转换（使用ln或sqrt函数），以确保其在继续分析前符合正态分布。
- 使用双尾ANOVA（置信水平95%）分析分配给每种基因型（wt vs. 杂合子 vs. 突变体）的数值（必要时已转换）之间的差异，并通过Levene's检验评估方差齐性，必要时采用Welch校正。对于每对基因型之间的两两比较，使用Tukey's检验（方差齐性时）或Games-Howell检验（方差不齐时）进行事后检验。
- 如果经转换后数值仍不符合正态分布，则使用非参数检验（Kruskal-Wallis检验）分析排序后数值之间的差异，并采用Dunn's多重比较检验（Bonferroni校正）进行两两比较。
- 将未经转换的数值（来自步骤3.6）以点图形式绘制，以最真实地呈现结果。
结果
本文中，我们描述了此前已发表的图像定量与胚胎基因分型流程的实际应用3该方法的工作流程如图所示 图1为了说明如何使用该方法，进行了ISH检测 dnmt3bb.1 在33 hpf的胚胎中，来自一个 runx1W84X/+ 22 杂交图2）。在与方案中详述相同的照明条件下，对130个胚胎进行成像，并为每个胚胎标记唯一编号。成像后，将每个胚胎转移至PCR管中用于基因分型。随后进行图像分析，为每幅图像分配一个像素强度值。将基因型与其对应的图像匹配，并根据基因型对像素强度值进行分组，以进行统计分析。观察到一种减少现象 dnmt3bb.1 表达在……中被检测到 runx1W84X/W84X 突变体（图2A，B)3，与先前的观察结果一致5有趣的是， runx1W84X/+ 杂合胚胎在各项指标上均未表现出显著差异 dnmt3bb.1 表达（图2A，B) 与其野生型同胞相比，表明一个 Runx1 拷贝足以维持 dnmt3bb.1 在适当水平上的表达
许多斑马鱼突变体未能表现出可在其他功能缺失技术（如吗啉代寡核苷酸，MOs）中检测到的胚胎表型。这种差异可能由多种因素导致，包括脱靶效应、母源蛋白补偿、低效等位基因23，或最近发现的遗传补偿现象24,25,26,27。在本示例中，我们探究了lmo4auob100突变体中runx1的表达是否降低或缺失，因为先前使用lmo4a吗啉代的研究数据表明，lmo4a吗啉代胚胎中runx1表达下调28。然而，本研究的分析结果显示，野生型与lmo4auob100纯合突变体之间runx1的表达无显著差异3（图3A,B）。进一步通过单个胚胎qPCR分析发现，lmo4auob100突变体中runx1的表达存在轻微但显著的下调（图3C）。因此，图像定量分析可能无法检测到表达水平的微小差异。另一种可能是，我们观察到的不同基因型间无差异的结果是真实的，而qPCR实验检测到了其他组织（如端脑）中runx1表达的变化，这些组织同时表达lmo4a和runx1。研究人员应始终使用qPCR等独立方法验证结果，但理想情况下可通过流式细胞术等方法富集目标组织以提高检测准确性。
在极少数情况下，原位杂交（ISH）背景信号较高（图3D），该区域的像素强度值过高，从信号值中减去背景后会产生负数，此时应将这些胚胎排除在分析之外。根据我们的经验，这种情况在约0.4%的runx1探针标记胚胎中出现3，但不同实验、探针或试剂批次之间可能有所差异。尽管这可能是该方法的一个局限性，但由于高背景出现频率极低，几乎不会影响整体实验结果。
为了测试选择不同区域进行背景校正的影响，我们首先使用不同区域进行背景校正，测量了28 hpf胚胎中runx1原位杂交（ISH）信号的像素强度（图4）。共选择了四个不同区域：两个位于躯干区域（R1和R2），一个位于卵黄区域（未染色，但可能积累背景染色），以及一个位于感兴趣区域（ROI）前方较小的区域（R4，图4B）。在这些区域测量像素强度显示，ROI与任一背景区域之间的强度差异相对稳定（图4C）。然而，R3始终显示出非常高的值（高于ROI中的值）。经过反相并转换为8位图像后，卵黄区域显得非常明亮，因此不适合作为背景校正区域。R2虽然更靠近ROI，但包含部分ISH信号，使用其进行校正会降低平均像素强度，相较于R1（位于更背侧，远离ISH信号）或R4而言。因此，R1或R4均为适合用于背景校正的区域（尽管R4的面积小于R1）。接下来，我们希望比较使用R1或R4作为背景校正区域对runx1表达比较结果的影响。为此，我们将dll4+/-杂合子进行互交29，并随机选取野生型和dll4-/-胚胎分析其runx1表达（图4E）。尽管使用R1或R4进行背景校正会影响单个数值，但在相同基因型内，平均像素强度并无显著差异（图4E）。此外，在比较不同基因型的runx1表达时，无论使用R1还是R4作为背景校正区域，所得的平均强度值均相似（µR1=16.3 和 µR4=18.2）。综上所述，我们得出结论：尽管背景区域的选择很重要，但主要标准是该区域不应包含卵黄部分（易积累背景染色），也不应包含任何可能扭曲背景像素强度值的（特异性）染色信号。
图1：并行图像定量与基因分型实验流程图。 从携带突变等位基因的杂合子斑马鱼交配后获得的胚胎，使用标准原位杂交（ISH）方法对目标基因进行检测。成像后，通过HotSHOT法直接在0.2 mL PCR管中向胚胎加入裂解缓冲液，并在95 °C下孵育30分钟，提取基因组DNA。提取的DNA可用于后续胚胎的PCR基因分型、PCR-限制性片段长度多态性（RFLP）分析、KASP检测或其他合适的基因分型方法。与此同时，对每个胚胎的图像进行反相处理并转换为8位灰度图像。手动选取包含ISH信号（黄色）和背景区域（蓝色）的、形状和大小一致的感兴趣区域（ROI），并进行测量。将测量结果与对应的基因型关联后进行统计分析。该图改编自Dobrzycki等3 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：在runx1突变体中的图像定量显示，通过原位杂交（ISH）检测到dnmt3bb.1表达水平降低。（A）33小时受精（hpf）野生型（蓝色）、runx1+/W84X（绿色）和runx1W84X/W84X（橙色）胚胎中原位杂交（ISH）的示例图像，显示dnmt3bb.1在背主动脉中的表达。（B）runx1W84X/W84X胚胎中dnmt3bb.1 mRNA的像素强度值（n=36）显著低于野生型（n=32）和杂合子（n=62）（ANOVA，p < 0.001）。野生型、杂合子和突变体组的变异系数分别为24%、22%和21%。蓝色、绿色和橙色的数据点对应于A图中的示例图像。柱状图表示均值±标准差。***p<0.001（Games-Howell事后检验）。该图改编自Dobrzycki等人的研究3 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：通过原位杂交（ISH）检测 lmo4auob100 突变体中 runx1 的表达水平。 （A）在 28 小时受精后（hpf）的野生型（蓝色）、杂合子（绿色）和 lmo4auob100/uob100（橙色）胚胎中进行 runx1 原位杂交的代表性图像，显示背主动脉中的表达情况。（B）对来自同一窝胚胎的 28 hpf 野生型（n=15）、杂合子 lmo4a+/−（het，杂合子）（n=34）和 lmo4auob100/uob100 突变体（n=18）胚胎中通过 ISH 检测到的 runx1 mRNA 信号进行定量分析，结果显示不同基因型之间的 runx1 像素强度无显著差异（ANOVA，p > 0.6）。蓝色、绿色和橙色的数据点对应于 A 图中的示例图像。条形图表示均值 ± 标准差。（C）通过 qRT-PCR 测定单个野生型（蓝色；n=12）和 lmo4auob100/uob100 突变体（mut，橙色；n=12）胚胎中归一化的 runx1 mRNA 水平（2−ΔCt）的箱形图，显示突变体中 runx1 水平较野生型降低。*p < 0.05（t 检验）。（D）28 hpf 胚胎原位杂交实验示例（runx1 染色，黄色箭头所示），显示较高背景信号。该图改编自 Dobrzycki 等人3。请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：背景强度校正对测量结果的影响。（A）28 hpf 野生型胚胎中 runx1 原位杂交（ISH）染色的代表性图像。（B）同一图像经倒置并转换为 8 位后的结果。感兴趣区域（ROI）以绿色高亮显示，用于背景校正的四个不同区域（R1–R4）以黄色高亮显示。（C）图 B 所示各区域的原始像素强度测量值。注意 R3（卵黄）中的强度始终高于 ROI 中的实际 ISH 信号（n=11）。（D）使用 R1、R2 和 R4 作为背景区域时 ROI 内的 Runx1 表达水平。ROI、R1、R2 和 R3 区域约为 28500 像素；R4 区域约为 8500 像素。请注意，R3 背景未用于此项比较，因为背景校正（ROI−R3）始终产生负值。（E）使用 R1 或 R4 进行背景校正时，野生型与 dll4-/- 突变体中 ROI 内的 Runx1 表达水平（每组样本 n=10）。图 D 和图 E 的统计分析采用非参数 Kruskal-Wallis 检验，假设像素强度值不服从正态分布。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
使用该方法定量基因表达时，应考虑几个因素。整个实验过程中必须保持成像条件一致（例如照明、曝光时间和胚胎定位），以减少测量间的变异性。关键的一点是避免样本染色过度，因为样本间染色差异可能被掩盖。例如，只有在24小时时间段内仔细监测染色情况，才能检测到非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎中Eto2缺失导致的VegfA表达下降30。因此，建议通过实验经验确定每种基因的最佳染色水平，使其能够真实反映表达情况，同时避免达到饱和。染色过度还会在转换为8位灰度图像后人为增加背景像素强度，从而扭曲定量结果。在极端情况下，胚胎组织中的背景水平可能高于所选感兴趣区域（ROI）内的原位杂交（ISH）信号，此类样本应从分析中剔除。当我们测试未染色卵黄是否适用于背景校正时，也观察到了类似现象（图4）。经过反相并转换为8位图像后，卵黄区域较暗的像素会比胚胎中的ISH信号更亮，导致背景校正后的数值为负值。因此，应避免使用卵黄进行背景校正。在胚胎的色素化区域（例如眼睛或从26/28 hpf开始的躯干背部）测量背景信号同样会扭曲定量结果，也应予以避免。目前已有针对斑马鱼胚胎的漂白方案，可在原位杂交（ISH）前或后进行漂白18，建议在成像前对24 hpf以上的胚胎进行漂白处理。
由于该方法依赖于测量特定区域内像素强度与等效非染色区域背景像素强度的对比，因此不适用于普遍存在或近乎普遍表达的基因的定量分析。相反，该方法适用于具有空间限制性分布的基因表达检测，此时可轻松确定用于背景像素强度测量的区域。我们进一步的分析表明，使用较小的区域（约为感兴趣区域的1/3至1/4）进行背景校正，可获得与使用与感兴趣区域（ROI）等效大小区域相似的结果。这使得该方法可应用于在更广泛空间区域内表达的基因（因此需要更大的感兴趣区域进行强度测量），前提是能够利用胚胎中明显未染色的区域进行背景校正。
最后，我们建议将基因分型与图像定量分析同步进行或在其之后进行，以尽量减少实验者的主观偏差。请另一位实验者对匿名样本重复定量分析，并与第一组测量结果进行比较，也有助于降低实验者偏差。如果待定量的图像来自无需基因分型的处理组之间的比较（例如野生型 vs 化学抑制剂，或野生型 vs 形态靶向寡核苷酸（MO）敲低），则执行测量的实验者应处于对样本身份不知情的盲态。
披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
我们感谢牛津和伯明翰生物医学服务中心的工作人员在斑马鱼饲养方面提供的卓越支持。T.D. 的研究由惠康信托基金会染色体与发育生物学博士奖学金资助（编号：#WT102345/Z/13/Z）。R.M. 和 M.K. 由英国心脏基金会（BHF IBSR 博士后奖学金 FS/13/50/30436）资助，并感谢其慷慨支持。R.M. 同时感谢英国心脏基金会牛津研究中心卓越中心（RE/13/1/30181）提供的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL PCR管（带盖8联管） | StarLab | A1402-3700 | 96孔板同样适用于样品处理，但需注意避免样品间的交叉污染 |
| 3 mL 巴斯德吸管 | Alpha Laboratories | LW4114 | |
| 凹面载玻片 | Brand | BR475535-50EA | |
| 数码相机（Qimaging Micropublisher 5.0） | Qimaging | ||
| Eppendorf Microloader吸头 | Eppendorf | 10289651 | 该吸头用于在甘油中调整胚胎的成像方向 |
| Excel | Microsoft | ||
| F3000光纤冷光源 | Photonic | ||
| Fiji | |||
| 甘油 | Sigma | G5516-1L | |
| Graphpad Prism 8.01 | GraphPad Software, Inc. | 我们更倾向于使用Graphpad，但其他统计软件包也同样适用（例如SigmaPlot或SPSS） | |
| HotSHOT碱性裂解缓冲液 | 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12 | ||
| HotSHOT中和缓冲液 | Tris HCl 40 mM, pH 5 | ||
| PBS（10X）pH 7.4 | Thermofisher | 70011044 | |
| 带照明支架的体视显微镜（Nikon SMZ800N） | Nikon | ||
| PCR仪 | Thermofisher |
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