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从多能干细胞无血清生成三维人肝细胞球

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DOI：

10.3791/59965

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2019年7月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 2UCL Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 3Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health and Life Sciences, Brunel University London, 4School of Biochemistry and Immunology, Trinity Biomedical Sciences Institute, Trinity College Dublin

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用定义明确的培养系统和细胞自组装方法，从人多能干细胞生成肝细胞球的策略。该方案在多种细胞系中具有可重复性，成本效益高，并可实现用于生物医学应用的稳定人肝细胞球的制备。

摘要

开发可再生的肝组织来源对于改进基于细胞的模型以及发展人体组织工程至关重要 用于移植。人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）是生成人类肝类球体的有前景的细胞来源。我们已开发出一种无血清且成分明确的细胞分化方法，可由人类多能干细胞生成三维人类肝类球体。该技术的一个潜在局限在于会形成内部含有死亡物质的致密球体。为克服这一问题，我们采用琼脂糖微孔技术，在特定细胞密度下调控三维球体的大小，从而防止凋亡和/或坏死核心的形成。  值得注意的是，我们方法所生成的类器官具有肝脏功能和稳定的表型，为基础与应用科学研究提供了宝贵的资源。我们相信，该方法可作为一种平台技术，用于进一步开发用于模拟和治疗人类疾病的组织，并在未来有望实现具有复杂组织结构的人体组织的构建。

引言

人类多能干细胞（hPSCs）在保持多能性的同时具备自我更新的能力，这为按需生成人类细胞类型和组织提供了可能。已利用二维（2D）贴壁培养系统高效地将hPSCs分化为肝细胞样细胞（HLCs）1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。这些系统已被成功用于单基因病、病毒生命周期、药物性肝损伤（DILI）、胎儿毒素暴露以及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的建模11,12,13,14,15。然而，这些模型仍存在一些局限性，限制了其常规应用，包括表达胎儿标志物、表型不稳定以及组织结构不佳16,17,18,19，这些问题也可能限制其向体内器官功能的外推。

为了克服这些局限性，已开发出三维（3D）分化平台，以模拟体内组织结构。尽管这些方法具有促进作用，但其依赖于动物来源的产品和基质来驱动组织形成20,21,22，限制了其规模化和广泛应用。

本文详细介绍了使用确定成分的材料和细胞自组装方法，从人多能干细胞（hPSCs）生成大量三维肝球体的操作步骤。值得注意的是，本方法生成的组织在细胞培养中可维持功能超过一年，并能在体内支持肝脏功能23。

总之，我们所定义的分化方法能够利用人胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）生成稳定的三维人肝细胞球。我们认为，该方法在基础与应用科学研究中生成三维肝细胞球方面代表了一项重要突破。

方案

1. 琼脂糖微孔板模具的制备

注意：本实验所用培养基必须无菌，并在细胞培养时保持室温（RT）。

  1. 制备2%琼脂糖模具。
    1. 将2 g低熔点琼脂糖溶解于100 mL灭菌蒸馏水中。在微波炉中小心加热，并间隔摇动，直至完全溶解。
    2. 向256孔格式模具中加入520 μL熔化的琼脂糖，静置使其凝固。
    3. 将每个琼脂糖微孔板转移至12孔板的单个孔中。
    4. 向每个孔中加入1.5 mL含Ca2+/Mg2+的1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），并使用P1000移液器吸头轻轻吹打数次，以去除微孔中的气泡。此步骤旨在确保细胞接种均匀。
      注意：琼脂糖微孔板可在含1×DPBS的条件下于4 °C保存长达6个月。

2. 将人多能干细胞接种至琼脂糖微孔板

  1. 细胞悬液的制备
    1. 按照先前所述方法8，吸除未分化hPSC培养物中的培养基。
      注意： hPSC在LN-521包被的培养皿中使用mTeSR1培养基进行培养，每24小时更换一次培养基，并在细胞达到75%至85%融合度时按先前所述方法定期传代8。
    2. 用5 mL室温1x DPBS（不含Ca2+/Mg2+）冲洗细胞，然后移除缓冲液。
    3. 向细胞中加入5 mL 1x细胞解离试剂（材料表），于37 °C孵育6–8分钟以进行细胞解离。
      注意： 通过显微镜观察细胞脱落情况以判断反应是否终止。此时细胞应部分脱离培养皿表面。若需要更长时间，可额外延长孵育1–2分钟。
    4. 移除细胞解离试剂以终止反应，向细胞中加入5 mL新鲜mTeSR1培养基（含10 μM Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Y27632）。使用P1000移液器枪头反复吹打数次使细胞充分解离。
    5. 使用血细胞计数板和台盼蓝染色排除法计数活细胞。随后，将细胞悬液调整至所需浓度。
    6. 计算所需的总细胞数量。进行三维肝球体分化时，每块琼脂糖微孔板接种3.84 × 105个细胞，以生成直径为100–150 μm的类球体。
    7. 将所需数量的细胞转移至无菌的15 mL或50 mL离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟，使细胞沉淀。
    8. 吸除并弃去上清液，用含10 μM ROCK抑制剂Y27632的mTeSR1培养基重悬细胞沉淀。用适量培养基稀释细胞沉淀，使其最终浓度为2.1 × 106个细胞/mL。
  2. 将细胞接种至预先制备的琼脂糖微孔板
    注意：     若使用冰箱保存的琼脂糖微孔板，使用前应将其置于37 °C细胞培养箱中至少1小时，并在接种细胞前吸除孔内的1x DPBS。
    1. 向琼脂糖微孔中加入190 μL细胞悬液。
    2. 接种完成后，将微孔板放回37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中孵育2小时，使细胞沉降。
    3. 2小时后，向每个孔中加入1 mL新鲜预热的含10 μM ROCK抑制剂Y27632的mTeSR1培养基。
    4. 将微孔板再次放回37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中继续孵育24小时，次日观察球体形成情况，以确保细胞已充分贴附。

3. 在琼脂糖微孔中将人多能干细胞分化为三维肝球体

  1. 聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）包被孔板的制备
    1. 将 2 g poly-HEMA 溶解于 100 mL 95% 乙醇中，在 55 °C 的加热板上搅拌过夜。向 24 孔板的每孔加入 250 μL poly-HEMA 溶液，并在 60 °C 烘箱中过夜干燥。
  2. 分化培养基的制备
    1. 通过将人激活素 A 冻干蛋白溶解于无菌 0.2% 牛血清白蛋白（BSA）/DPBS 中，配制终浓度为 100 μg/mL 的 1,000 倍储存液。分装后于 -20 °C 保存。使用时稀释 1:1,000。
    2. 通过将小鼠 Wnt3a 冻干蛋白溶解于无菌 0.2% BSA/DPBS 中，配制终浓度为 10 μg/mL 的 1,000 倍储存液。分装后于 -20 °C 保存。使用时稀释 1:200。
    3. 通过将人肝细胞生长因子（HGF）冻干蛋白溶解于无菌 0.2% BSA/DPBS 中，配制终浓度为 10 μg/mL 的 1,000 倍储存液。分装后于 -20 °C 保存。使用时稀释 1:1,000。
    4. 通过将 OSM 溶解于无菌 0.2% BSA/DPBS 中，配制终浓度为 20 μg/mL 的 1,000 倍储存液。分装后于 -20 °C 保存。使用时稀释 1:1,000。
    5. 通过将冻干蛋白溶解于无菌 0.2% BSA/DPBS 中，配制终浓度为 10 μg/mL 的 1,000 倍上皮生长因子（EGF）储存液。分装后于 -20 °C 保存。使用时稀释 1:1,000。
    6. 通过将冻干蛋白溶解于无菌 0.2% BSA/DPBS 中，配制终浓度为 10 μg/mL 的 1,000 倍碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）储存液。分装后于 -20 °C 保存。使用时稀释 1:1,000。
    7. 通过将冻干蛋白溶解于 0.2% BSA/DPBS 中，配制终浓度为 10 μg/mL 的 1,000 倍血管内皮生长因子（VEGF）储存液。分装后于 -20 °C 保存。使用时稀释 1:1,000。
    8. 配制内胚层分化培养基：以 RPMI 1640 基础培养基为基础，添加 2% B27 补充剂（50 倍，不含胰岛素）和 1% 青霉素/链霉素（终浓度分别为 100 IU/mL 和 100 μg/mL）。除非另有说明，每次更换培养基时需加入 Wnt3a 和激活素 A，使其终浓度分别为 50 ng/mL 和 100 ng/mL。
      注意：4 °C 保存，两周内使用完毕。
    9. 配制肝母细胞分化培养基：以敲除型 DMEM（KO-DMEM）为基础，添加 20% 敲除血清替代物（KOSR），并补充 0.5% 的 L-谷氨酰胺替代补充剂、1% 非必需氨基酸（NEAA）、0.1 mM β-巯基乙醇、1% 二甲基亚砜（DMSO）和 1% 青霉素/链霉素（终浓度分别为 100 IU/mL 和 100 μg/mL）。真空过滤。
      注意：4 °C 保存，两周内使用完毕。
    10. 配制肝细胞成熟培养基：以肝细胞培养基为基础，添加 1% 的 L-谷氨酰胺替代补充剂、10 μM 氢化可的松 21-半琥珀酸钠盐（HCC）和 1% 青霉素/链霉素（终浓度分别为 100 IU/mL 和 100 μg/mL）。每次更换培养基时，需补充 OSM 和 HGF，使其终浓度分别为 20 ng/mL 和 10 ng/mL。
      注意：储存液于 4 °C 保存，两周内使用完毕。
    11. 配制肝细胞维持培养基：以 William's E 培养基为基础，添加 10% 敲除血清替代物、1% 的 L-谷氨酰胺替代补充剂和 1% 青霉素/链霉素（终浓度分别为 100 IU/mL 和 100 μg/mL）。每次更换培养基时，需补充 HGF、EGF、bFGF 和 VEGF，各生长因子终浓度均为 10 ng/mL。
      注意：储存液于 4 °C 保存，两周内使用完毕。
  3. 接种后 24 小时检查肝球体形成情况，并启动肝细胞分化。小心移除 mTeSR1 培养基，更换为 1 mL 新鲜的内胚层分化培养基，其中添加 100 ng/mL 激活素 A 和 50 ng/mL Wnt3a。
  4. 对于 hESCs，每 24 小时更换一次添加补充剂的内胚层诱导培养基，持续 3 天。若使用 hiPSCs，则延长此阶段 2 天，仅补充激活素 A（100 ng/mL）。
  5. 完成确定性内胚层诱导后，更换为肝母细胞分化培养基，进行为期 5 天的肝母细胞特化，每 2 天更换一次培养基，并在肝母细胞特化最后一天进行最后一次换液。
  6. 将肝球体转移至 poly-HEMA 包被的孔中。
    1. 移除含 KSR/DMSO 的培养基后，用不含补充剂的肝细胞成熟培养基洗涤细胞一次，然后加入 1 mL 含 10 ng/mL HGF 和 20 ng/mL OSM 的肝细胞成熟培养基。
    2. 使用 P1000 移液器，通过反复吹打溶液数次，将肝球体从琼脂糖微孔板中吸起。
    3. 将含有肝球体的培养基转移至 poly-HEMA 包被的孔中。
    4. 用 1 mL 含 10 ng/mL HGF 和 20 ng/mL OSM 的肝细胞成熟培养基洗涤琼脂糖微孔板，并将洗涤液转移至 poly-HEMA 包被的孔中。
    5. 尽可能重复步骤 3.6.4，以将所有肝球体从琼脂糖微孔板中转移出来。
      注意：必须小心地反复吹打含有肝球体的溶液，以避免对其造成损伤。
  7. 使用 P100 移液器小心吸除多余培养基，保留约 1 mL 含肝球体的培养基于 poly-HEMA 包被孔中。
  8. 每 48 小时更换一次培养基，持续 12 天。
  9. 当使用 hESCs 时，在第 20 天；当使用 hiPSCs 时，在第 22 天，更换为肝细胞维持培养基。
    1. 移除肝细胞成熟培养基，用不含补充剂的肝细胞维持培养基洗涤细胞一次。加入 1 mL 含 HGF、EGF、FGF 和 VEGF 各 10 ng/mL 的肝细胞维持培养基。
  10. 每 48 小时更换一次新鲜的肝细胞维持培养基。

4. 长期培养的三维肝细胞球的功能分析

  1. 在进行功能分析前48小时，更换为添加了10 μM HCC、L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素（终浓度分别为100 IU/mL和100 μg/mL）以及10 ng/mL HGF的肝细胞成熟培养基。
  2. 采用细胞色素P450（CYP）酶活性检测法分析肝细胞代谢功能。
    1. 将培养基更换为1 mL新鲜的肝细胞成熟培养基，并添加50 μM荧光素-6'-五氟苄基醚（luciferin-PFBE）底物以检测CYP3A基础活性，或添加100 μM荧光素甲醚（luciferin-ME）底物以检测CYP1A2基础活性（重复次数 = 3）。使用组织培养基作为阴性对照。
      注意：为避免交叉反应，建议不要在同一孔的三维肝细胞球中检测多种CYP P450活性，而应在独立的孔中分别进行检测。
    2. 将细胞在37 °C条件下孵育24小时。
    3. 使用P100移液器吸头收集上清液，并按照试剂盒说明书进行检测。
    4. 测定基础活性的相对水平，并根据双辛可宁酸蛋白定量法（BCA法）测定的每毫克蛋白进行归一化处理。
  3. 采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清蛋白的产生。
    1. 将培养基更换为1 mL新鲜的肝细胞成熟培养基，并添加10 ng/mL HGF和20 ng/mL OSM（重复次数 = 3）。使用组织培养基作为阴性对照。
    2. 将细胞在37 °C条件下孵育24小时。
    3. 使用P100移液器吸头收集上清液，并按照试剂盒说明书测定血清蛋白产生的相对水平。
    4. 根据BCA蛋白定量法测定的每毫克蛋白进行归一化处理。

5. 免疫细胞化学

  1. 含肝球体的石蜡切片制备
    1. 用1×DPBS将肝球体洗涤三次。
    2. 用预冷的甲醇在冰上固定肝球状体 30 分钟。
    3. 用1×DPBS洗涤三次。
    4. 将肝球体嵌入300 μL温热的2%琼脂糖溶液中，该琼脂糖溶于H2使用24孔板中的一个空孔作为模具，静置30分钟使其凝固。
    5. 将含有肝球状体的琼脂糖包埋于石蜡中。
    6. 使用切片机将含有固定肝球体的石蜡包埋块切成4 μm厚的切片。
  2. 切片脱蜡与复水
    注意：     尽可能使用新鲜配制的溶液。避免使用已在染色槽中放置超过一周的溶液。
    1. 将切片置于载玻片架中。
    2. 将载有切片的玻片架浸入盛有300 mL二甲苯的染色缸中，浸泡5分钟。
    3. 重复步骤 5.2.2。
    4. 浸入无水乙醇中 20 秒。
    5. 浸入95%乙醇中20秒。
    6. 浸入90%乙醇中20秒。
    7. 浸入80%乙醇中20秒。
    8. 浸入70%乙醇中20秒。
    9. 用蒸馏水复水5分钟。
      注意： 将载玻片保持在同一个玻片架中，并从一个染色槽转移至下一个染色槽。所用体积（通常约为 300 mL）取决于染色槽的大小。
  3. 含肝球体的石蜡切片抗原修复
    1. 在微波炉中以800 W功率将脱蜡并复水的切片在1×Tris-EDTA（TE）pH 9.0缓冲液中加热15分钟。
    2. 将样品浸入自来水中冷却5分钟。
  4. 免疫染色
    1. 将载玻片与封闭液（含0.1%吐温20的PBS/10% BSA）在室温下孵育1小时。
    2. 用含1% BSA的PBS/T缓冲液稀释适当的一抗，替换封闭液，4 °C轻度振荡孵育过夜。
    3. 用 PBS/T 洗涤细胞 5 分钟，重复三次。
    4. 在 PBS/T/1% BSA 中稀释相应二抗，室温避光轻柔振荡孵育 1 小时。
      注意： 优化的一抗和二抗列于下表 材料清单.
    5. 用 PBS/T 洗涤细胞 5 分钟，重复三次。
    6. 根据制造商说明向细胞中加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），轻轻盖上盖玻片以减少气泡。将固定后的细胞置于4 °C避光保存。使用配备适当滤光片和荧光灯的显微镜观察染色结果。
      注意：将培养皿置于 4 °C 避光保存，直至成像。

结果

采用我们定义的方案，将来自胚胎干细胞系（H9）或诱导多能干细胞系（P106）的三维细胞聚集体向肝细胞谱系进行分化（图1）。首先将多能干细胞诱导为定型内胚层，随后指定为肝前体细胞。在此之后，肝前体细胞进一步成熟为三维肝细胞球体，可在体外培养中维持长达一年23。

为了研究三维球体的结构，将30天大的由hESC或iPSC分化而来的球体进行固定、切片并染色，以检测肝细胞和间充质细胞中表达的蛋白质。使用了肝细胞核因子4α（HNF4α）和间充质标志物波形蛋白（vimentin），结果显示球体由外层的肝细胞样细胞包裹着内部的间充质细胞核心构成（图2）。随后，我们进一步分析了肝细胞中表达的蛋白质，包括白蛋白（albumin）、CYP3A和E-钙黏蛋白（E-cadherin）。免疫染色显示，这些蛋白质的表达局限于球体的外层（图3）。

在培养第30天对肝球状体进行了功能分析。CYP1A2和CYP3A是功能性肝细胞中的重要酶，其活性通过已建立的检测方法进行评估。H9来源的肝球状体表现出的CYP3A活性为220,375 ± 74,514 RLU/mL/mg蛋白，CYP1A2活性为732,440 ± 33,330 RLU/mL/mg蛋白（图4A）。P106来源的肝球状体CYP3A活性为132,117 ± 43,391 RLU/mL/mg蛋白，CYP1A2活性为409,907 ± 121,723 RLU/mL/mg蛋白（图4B）。与两批人原代肝细胞相比，三维肝球状体表现出相当可观的CYP酶活性10。

白蛋白和甲胎蛋白（AFP）的合成与分泌分析显示，H9来源的肝球状体分别分泌白蛋白和甲胎蛋白为 683.9 ± 84 和 159 ± 20 ng/mL/24 h/mg 蛋白（图5A）；而P106来源的肝球状体分别分泌白蛋白和甲胎蛋白为 497 ± 41 和 756 ± 24 ng/mL/24 h/mg 蛋白（图5B）。

肝细胞培养过程时间线；阶段：球体、内胚层、肝母细胞、肝球体。
图 1：由人胚胎干细胞（hESCs）生成三维肝球体的逐步分化流程。蓝色方括号表示人诱导多能干细胞（hiPSCs）的分化天数。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜图像、细胞结构标记、细胞比较研究、示意图
图 2：三维肝球体的结构重组。 H9来源的三维肝球体（A）和P106来源的三维肝球体（B）中肝细胞核因子4α（HNF4α，绿色）和波形蛋白（vimentin，红色）表达的代表性图像，及其相应的免疫球蛋白G（IgG）对照。比例尺代表60 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

白蛋白、CYP3A4、E-钙黏蛋白在细胞样本中的免疫荧光显微镜图像；蛋白质表达。
图3：三维肝球体中肝细胞标志物表达的评估。 人肝细胞标志物——白蛋白、CYP3A、E-钙黏蛋白及其相应的IgG对照在（A）H9来源和（B）P106来源的三维肝球体中的代表性图像。比例尺 = 60 μm。 请点击此处查看本图的放大版本。

肝球体比较，CYP450活性；CYP3A、CYP1A2酶的RLU/mL/mg蛋白柱状图。
图4：三维肝球体中细胞色素P450的功能。检测（A）H9来源的三维肝球体和（B）P106来源的三维肝球体中细胞色素P450 1A2和3A的活性。。 数据为三次生物学重复实验的平均值，误差线表示标准差（SD）。活性单位为每毫升每毫克蛋白的相对发光单位（RLU）。 请点击此处查看该图的放大版本。

3D肝细胞球分泌水平；柱状图；白蛋白与甲胎蛋白（AFP）单位为ng/mL/24h/mg蛋白；数据分析。
图5：肝细胞球蛋白分泌分析。分析了（A）H9来源的3D肝细胞球和（B）P106来源的3D肝细胞球中白蛋白和甲胎蛋白（AFP）的分泌情况。数据代表三次生物学重复实验的结果，误差线表示标准差（SD）。分泌蛋白的量以每毫升每24小时每毫克蛋白所含蛋白的纳克数（ng/mL/24h/mg protein）表示。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

为了体外和体内研究的需要，必须开发明确且无异源成分的3D人肝细胞球体培养系统。目前，大多数由人多能干细胞分化为肝细胞的方法均在二维贴壁培养体系中进行。这类培养环境缺乏组织发生和稳态维持过程中所需的多种微环境信号，包括异型细胞间的相互作用、基质的生成与重塑，从而导致其难以准确模拟体内生物学特性18,19。

因此，研究重点已转向利用多能干细胞生成肝细胞球的替代方法。尽管已有许多三维研究推动了该领域的发展，但这些方法依赖动物源性成分20,22,24以提供支持和/或需要使用人源组织21,22，这使得技术放大变得复杂，并影响实验的可重复性与应用前景。

本文所述的方法（图1）具有定义明确、高效、高度可重复且成本低廉的特点，能够生成具有功能性的肝类球体，这些类球体在体外可维持功能超过一年，并在体内提供关键的肝脏支持作用14。尤为重要的是，该技术平台允许使用者控制三维肝类球体的大小，从而限制致密坏死核心的形成以及表型的丧失。

将3D肝球状体转移至聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）包被的培养板是本实验方案中的关键步骤。在此阶段操作中，必须轻柔地使用移液器，以避免对球状体造成损伤。此外，更换培养基时也需小心进行，以防止剪切力导致球状体结构受损或变形。

在这些研究中，三维肝球状体表现出有序的结构（图2 和 图3）、细胞色素P450功能（图4），并分泌白蛋白和甲胎蛋白等肝脏蛋白（图5）。该方法已在四种多能干细胞系中成功实施，结果具有可比性。展望未来，该技术可作为开发具有复杂结构的其他内胚层和间充质组织的平台。

披露

David C. Hay 是 Stemnovate Ltd 和 HigherSteaks Ltd 的联合创始人及股东。其余作者声明，他们对本文所讨论的主题或材料不存在利益冲突。

致谢

本研究获得了英国再生医学平台（MRC MR/L022974/1） 和首席科学家办公室（TCS/16/37）资助项目的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞培养与功能检测
琼脂糖Fisher Bioreagents10766834
B27添加剂 Life Technologies 12587-010
β-巯基乙醇Life Technologies 31350
牛血清白蛋白Sigma-Aldrich A2058 
DAPI InvitrogenD1306
DMSO Sigma-Aldrich D5879
无钙无镁DPBSThermoFisher 14190250
含钙镁DPBSThermoFisher 14040133
温和细胞解离试剂STEMCELL Technologies 7174
GlutaMax Life Technologies 35050
HepatoZYME-SFMLife Technologies  17705021
人Activin A Peprotech 120-14E
人甲胎蛋白ELISAAlpha Diagnostics500
人碱性成纤维细胞生长因子Peprotech 100-18B
人表皮生长因子Peprotech 236-EG
人肝细胞生长因子Peprotech 100-39
人抑瘤素M Peprotech 300-10
人重组层粘连蛋白521 BioLamina LN521-02
人血清白蛋白ELISAAlpha Diagnostics1190
人血管内皮生长因子Bio-techne293-VE
氢化可的松21-半琥珀酸钠盐Sigma-Aldrich H4881
Knockout DMEM Life Technologies 10829
Knockout血清替代物 Life Technologies 10828
微模具球体 Sigma-Aldrich Z764000
mTeSR1培养基 STEMCELL Technologies 5850
非必需氨基酸 Life Technologies 11140
P450-Glo CYP1A2检测与筛选系统PromegaV8771
P450-Glo CYP3A4检测与筛选系统PromegaV8801
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Life Technologies 15140122
poly-HEMA（聚2-羟乙基甲基丙烯酸甲酯） Sigma-Aldrich P3932
重组小鼠Wnt3a Bio-techne1324-WN-500/CF
RPMI 1640 Life Technologies 21875
仪器设备
微波炉Bosch
切片机LeikaRM2125RT
烘箱Thermoscientific
抗体
一抗
白蛋白 Sigma-Aldrich A6684 1:100（小鼠）
CYP3A4邓迪大学邓迪大学1:200（绵羊）
E-钙黏蛋白Abcamab760551:200（小鼠）
HNF-4αSanta Cruzsc-89871:100（兔）
IgGDAKOX09431:400
波形蛋白DAKOM07251:100（绵羊）

参考文献

  1. Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning and Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).
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