一种用于筛选小分子抑制剂的NADH偶联ATP酶检测半高通量改良方法

摘要

已将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）偶联的ATP酶检测法改进用于小分子肌球蛋白抑制剂的半高通量筛选。该动力学检测采用384孔微孔板格式进行，每孔总反应体积仅为20 µL。该平台几乎可适用于所有产生ADP的酶。

摘要

ATP酶利用储存在三磷酸腺苷中的自由能，在体内催化多种不会自发进行的吸能生化过程。这些蛋白质对于细胞生命活动的几乎所有方面都至关重要，包括代谢、细胞分裂、对环境变化的响应以及运动。本文所述方案描述了一种与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）偶联的ATP酶检测方法，已适用于小分子ATP酶抑制剂的半高通量筛选。作为一种原理验证，该检测方法已应用于心脏和骨骼肌肌球蛋白II——两种以肌动蛋白为基础的分子马达ATP酶。在该检测中，ATP的水解通过酶促反应与NADH的氧化相偶联。首先，ATP酶生成的ADP由丙酮酸激酶（PK）再生为ATP，同时PK催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转化为丙酮酸。随后，丙酮酸在乳酸脱氢酶（LDH）作用下被还原为乳酸，同时LDH催化NADH的氧化。因此，ATP浓度的降低与NADH浓度的降低直接相关，后者可通过NADH固有荧光的变化进行监测。只要反应体系中存在足够的PEP，ADP浓度将保持极低水平，从而避免ATP酶被其自身产物抑制。此外，ATP浓度基本保持恒定，从而获得线性的反应进程曲线。荧光信号被连续监测，便于对数据质量进行直观评估，并有助于排除潜在的干扰因素（例如由化合物沉淀或温度变化引起的假象）。

引言

肌球蛋白是一类能将化学能转化为机械能的分子马达，可水解三磷酸腺苷（ATP），从而在真核细胞的肌动蛋白细胞骨架丝上产生定向运动^1,2。它们在结构和动力学上已适应多种细胞内功能，例如细胞器运输、肌肉收缩或细胞骨架张力的产生^1,2。人类基因组中存在约40个肌球蛋白基因，归属于约12个不同的肌球蛋白类别，共同构成肌球蛋白超家族^3,4。不同类别的肌球蛋白成员在多种疾病中发挥着重要作用，包括多种癌症、神经系统疾病、骨骼肌病以及肥厚型心肌病^5,6。鉴于这些分子马达在生理和病理过程中具有广泛的功能，它们正日益被视为多种疾病的潜在药物靶点⁷。近年来，在发现新的肌球蛋白抑制剂^8,9,10和激活剂¹¹，以及优化....

方案

1. 储备溶液与试剂的配制

1. 通过将结晶 DTT 溶解于蒸馏水中，配制终浓度为 1000 mM 的二硫苏糖醇（DTT）储备液。用 1 M NaOH 溶液调节 pH 至 7.0。分装后于 -20 °C 保存。
2. 通过将结晶 ATP 溶解于蒸馏水中，配制终浓度为 100 mM 的 ATP 储备液。用 1 M NaOH 溶液调节 pH 至 7.0。分装后于 -20 °C 保存。
3. 配制含 70 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）、10 mM MgCl₂、0.9 mM 乙二醇双(β-氨基乙醚)四乙酸（EGTA）和 3 mM NaN₃ 的 10× NADH 缓冲液。用 1 M NaOH 溶液调节 pH 至 7.0。4 °C 保存。
4. 配制含 10 mM MOPS 和 0.1 mM EGTA 的 1× 肌球蛋白缓冲液。用 1 M NaOH 溶液调节 pH 至 7.0。4 °C 保存。使用前加入牛血清白蛋白（BSA）和 DTT，使其终浓度分别为 0.1%（w/v%）和 1 mM。
5. 配制含 4 mM MOPS、0.1 mM EGTA、2 mM MgCl₂ 和 3 mM NaN₃ 的 1× 肌动蛋白缓冲液。用 1 M NaOH 溶液调节 pH 至 7.0。4 °C 保存。使用前加入牛血清白蛋白（BSA）和 DTT，使其终浓度分别为 0.1%（w/v%）和 1 ....

结果

用于筛选实验的典型板布局图如图1所示。第一行和最后一行分别保留用于NADH校准和阳性对照（20 µM para-氨基布比斯汀，0.5% DMSO）。其余行（B至O）用于测试化合物的抑制活性。在此，从DMSO中10 mM的化合物浓度开始，进行15步连续1:2稀释，并将稀释液从化合物板转移至检测板，使检测板上的最高终浓度化合物浓度为50 µM（含0.5% DMSO）。每两个行用于获取一个化合物的剂量-反应曲线（每个化合物48个数据点）。请注意，板布局图可根据特定研究目标重新设计。例如，若目标是获得大量化合物的单点筛选数据，则可在单个384孔板上测试112种化合物，同时使用相同的阳性对照和NADH校准布局（每种化合物设三个重复）。建议每种化合物（或每个浓度）至少保留3个数据点，并避免将某一种化合物仅布置在板边缘的孔中，因为这些数据点可能受边缘效应影响。为评估边缘效应的影响程度，应首先运行一个仅含阴性对照的完整板。

讨论

实验方案中的关键步骤

通过仅使用阴性对照（无抑制剂的ATP酶反应）运行多块微孔板来优化板布局。仔细检查反应速率结果中的模式，例如，这些模式可能源于边缘效应和/或亲水表面涂层的不均匀性。 "非结合性" 平皿。如果观察到某种模式，应更换平皿类型和/或调整平皿布局以尽量减少干扰因素。例如，一条典型的剂量-反应曲线（16个浓度，每个浓度3个复孔，共48个数据点）可在384孔板上按三列或两行排列。这两种排列方式分别可能导致6个和4个数据点受到边缘效应的影响。因此，始终优先选择行向排列。

修改与故障排除

请注意，反应全程的荧光信号变化必须呈线性。在反应最初几分钟内，由于温度变化，或在最后几分钟内，由于接近平衡状态，可能会出现非线性现象。如果存在非线性，可调整反应参数（例如稀释肌球蛋白、改变检测温度），或仅对数据的线性部分进行分析。

如果抑制剂与A.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
384孔低裙边黑色平底聚苯乙烯NBS微孔板	康宁	3575
ATP（腺苷-5′-三磷酸）′三磷酸二钠盐水合物	Sigma	A7699
Aurora FRD-IB 分配器	Aurora Discovery, Inc.	00017425
Biomek NXP 多通道实验室自动化工作站	贝克曼库尔特	A31841
Blebbistatin	AMRI	N/A	定制合成
BSA（牛血清白蛋白，无蛋白酶）	Akron Biotech	AK1391
Centrifuge 5430 R，制冷型，配备 FA-35-6-30 转子	Eppendorf	022620663
Centrifuge 5430，非制冷型，配转子 A-2-MTP	Eppendorf	022620568
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma	D2650
DTT（DL-二硫苏糖醇）	Sigma	D5545
E1 ClipTip 多通道移液器；384 格式；8 通道	赛默飞世尔科技	4672010
E1 ClipTip 多通道移液器；96孔板格式；8通道	赛默飞世尔科技	4672080
EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）′，N′四乙酸	Sigma	E3889
EnVision 2104 多功能酶标仪	PerkinElmer	2104-0010
甘油	Sigma	G2025
LDH（兔肌肉L-乳酸脱氢酶）	Sigma	L1254
MgCl2.6H2六水合氯化镁 (Magnesium chloride hexahydrate)	Sigma	M2670
微孔板振荡器	VWR	12620-926
384孔微孔板，聚丙烯材质，小体积，深孔，本色	Greiner Bio-One	784201
MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸）	Sigma	M1254
肌球蛋白马达蛋白（全长）（牛心肌）	细胞骨架	MY03
肌球蛋白马达蛋白（全长）（兔骨骼肌）	细胞骨架	MY02
NADHβ-还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物	Sigma	N8129
NaN3 （叠氮化钠）	Sigma	71289
NaOH（氢氧化钠）	Sigma	S8045
CFP 470/24 nm 光学滤光片（发射）	PerkinElmer	2100-5850	条形码 240
光学滤光片 Fura2 380/10nm（激发）	PerkinElmer	2100-5390	条形码 112
光学模块：β-内酰胺酶	PerkinElmer	2100-4270	条形码 418
OriginPro 2017 软件	OriginLab	N/A
para-氨基布雷比斯塔汀	AMRI	N/A	定制合成
段落-硝基布比他汀	AMRI	N/A	定制合成
磷酸烯醇式丙酮酸单钾盐（Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt）	Sigma	P7127
PK（兔肌丙酮酸激酶）	Sigma	P9136
兔肌丙酮粉	Pel Freez Biologicals	41995-2