该方法旨在追踪细胞系中由PRC2介导的染色质结构域的形成过程，并且可适用于许多其他系统。
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本文内容
摘要
摘要
染色质结构域的组织与结构在不同细胞谱系中具有独特性。其异常调控可能导致细胞身份的丧失和/或疾病的发生。尽管已付出巨大努力，但目前对染色质结构域形成及其传播机制的理解仍然有限。以往对染色质结构域的研究多在稳态条件下进行，难以追踪其建立初期的动态事件。本文介绍一种可诱导重建染色质结构域的方法，并可随时间进程追踪其重新形成的过程。该方法最初应用于PRC2介导的抑制性染色质结构域形成的案例，但也可轻松拓展至其他类型的染色质结构域。将本方法与基因组学或成像技术进行修饰或联合使用，将为深入研究染色质结构域的建立过程提供极为宝贵的工具。我们相信，该方法将彻底革新我们对染色质结构域如何形成及其相互作用机制的理解。
引言
真核生物基因组具有高度有序的结构，染色质可及性的变化直接调控基因转录1。基因组包含不同类型的染色质结构域，这些结构域与转录活性和复制时序相关2,3。这些染色质结构域的大小从几千碱基对（kb）到超过100 kb不等，其特征是富集特定的组蛋白修饰4。核心科学问题在于：这些结构域是如何形成的？它们又是如何被维持和传递的？
在众多已被深入研究的染色质结构域中，多梳抑制复合物2（Polycomb repressive complex 2, PRC2）在其中发挥关键作用。PRC2是一种多亚基复合物，由多梳蛋白家族（Polycomb Group, PcG）中的一组蛋白质组成5,6，可催化组蛋白H3第27位赖氨酸的单、双和三甲基化修饰（H3K27me1/me2/me3）7,8,9,10。H3K27me2和H3K2....
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方案
诱导型EED拯救mESC的生成
1. 细胞培养
- 使用饲养层细胞无关的C57BL/6小鼠胚胎干细胞（mESCs），该细胞稳定整合了CreERT2转基因，可在给予4-羟基他莫昔芬（4-OHT）后转位至细胞核13。
- 将mESCs培养于常规ESC培养基14,15中，培养基中添加1000 U/mL白血病抑制因子（LIF）、1 μM ERK抑制剂PD0325901和3 μM GSK3抑制剂CHIR99021。常规ESC培养基成分为：含15%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1×青霉素/链霉素和0.1 mM 2-巯基乙醇的Knockout DMEM。
- 使用经0.1%明胶溶液包被的培养板培养mESCs。
2. 生成克隆性EED基因敲除（KO）小鼠胚胎干细胞
- 使用 Benchling 中的 CRISPR 设计工具设计靶向删除 mESC 中 EED 内源性拷贝第 10 外显子和第 11 外显子的向导 RNA（gRNA）16。EED-KO-gRNA-1 靶向位于第 10 外显子上....
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结果
条件性拯救系统的通用示意图
图1展示了在内源性EED基因座表达野生型（WT）或笼状突变型（Y365A）EED以条件性拯救EED基因敲除（KO）细胞的靶向策略。在敲除EED（PRC2的一个核心亚基，对维持其稳定性和酶活性至关重要）后，将一个位于EED基因第9个外显子下游内含子区域的表达盒插入基因组（图1）。该表达盒包含EED基因剩余的3' cDNA序列，其方向与内源性基因序列相反。表达盒两侧为异源反向loxP位点（lox66和lox71）18。细胞持续培养直至H3K27me2/3完全消失。通过添加4-羟基他莫昔芬（4-OHT）激活Cre重组酶的表达后，该表达盒发生倒位，使得第9个外显子通过剪接受体序列与表达盒发生剪接（图1）。利用该系统，EED基因敲除细胞可被表达C端Flag-HA标签的野生型或笼状突变型EED所拯救。其下游的T2A-GFP元件可作为标记，用于筛选成功发生倒.......
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讨论
要深入理解特定染色质结构域形成过程中的分子机制，一种有效的方法是首先破坏该结构域，随后在细胞内追踪其重建的动态过程。在重建过程中，可随时暂停该过程，以详细分析正在进行的分子事件。以往关于染色质结构域的研究无法解析此类动态事件，因其通常在稳态条件下进行（例如，比较野生型与基因敲除型）。本文介绍了一种用于评估染色质结构域动态形成过程的系统，重点揭示了细胞内由PRC2介导的抑制性结构域的招募及其扩散过程。
对于该诱导系统而言，最关键的步骤是精确设计DNA构建体，以便在目标蛋白（或RNA）从细胞中被删除后重新表达。可根据下游应用，在这些构建体中引入各种突变、标签和荧光标记。例如，为了监测活细胞中染色质结构域形成的初始事件，可不使用位于GFP之前、用于将其与目标蛋白分离的自剪切T2A肽，而是构建多种荧光融合蛋白，用于高分辨率成像和/或单颗粒示踪实验。
尽管该方法可以通过多种方式进行修改以研究染色质结构域的形成过程，但仍存在一些局限性。首先，该方法需要一种携带 Cre-ERT2 基因的细胞系。其次，必须进行优化以确定 4-OHT 处理后的.......
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披露
D.R. 是 Constellation Pharmaceuticals 和 Fulcrum Therapeutics 的联合创始人。作者声明不存在利益冲突。
致谢
感谢 L. Vales、D. Ozata 和 H. Mou 博士对稿件的审阅。D.R. 实验室由霍华德·休斯医学研究所和美国国立卫生研究院（R01CA199652 和 R01NS100897）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (Z)-4-羟基他莫昔芬（5 mg） | Sigma | H7904-5MG | 用于诱导 EED 表达 |
| 16% 甲醛水溶液（10×10 ml） | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 用于免疫荧光 |
| 2-巯基乙醇 | LifeTechnologies | 21985-023 | 用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养 |
| 2% 明胶溶液 | Sigma | G1393-100ml | 用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养 |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | 用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | 用于免疫荧光 |
| Aqua-Mount 封片介质 | FISHER/VWR | 41799-008 | 用于免疫荧光 |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | 用于免疫荧光 |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）- 10 mg | Life Tech | D1306 | 用于免疫荧光 |
| ERK 抑制剂 PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | 用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养 |
| ESGRO 重组小鼠 LIF 蛋白 | Millipore/Fisher | ESG1107 | 用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养 |
| 干细胞级 FBS | Atlanta | S10250 | 用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养 |
| Gibson 组装主混合液 | NEB | E2611L | 用于供体质粒克隆 |
| GSK3 抑制剂 CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | 用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养 |
| H3K27me2 (D18C8) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 9728S | ChIP-seq 用抗体 |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | ChIP-seq 用抗体 |
| 组蛋白 H2Av 抗体（多克隆抗体） | Active motif | 39715 | ChIP-seq 内参对照 |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | 用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养 |
| L-谷氨酰胺 | Sigma | G7513 | 用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养 |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | 用于转染 |
| MangoTaq DNA 聚合酶 | Bioline | BIO-21079 | 用于基因分型 PCR |
| 正常驴血清（10 mL） | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | 用于免疫荧光 |
| 青霉素-链霉素 | Sigma/Roche | P0781 | 用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养 |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | 用于 gRNA 克隆 |
| QuickExtract DNA 提取溶液 | Lucigen | QE0905T | 用于基因分型 PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR 克隆试剂盒 | Thermo Fisher | K270020 | 用于供体质粒克隆 |
| 引物/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | 序列：ctctggctactgtcaactag。gRNA 配对用于在 C57BL/6 ESCs 中敲除 EED，以构建 i-WT-r 和 i-MT-r 系统。 | ||
| EED-KO-gRNA-2 | 序列：TAGGCTATGACGCAGCTCAG。gRNA 配对用于在 C57BL/6 ESCs 中敲除 EED，以构建 i-WT-r 和 i-MT-r 系统。 | ||
| EED-gRNA-inducible | 序列：atggcaccccgaaattagaa。gRNA 和供体质粒用于在 EED-KO 背景下构建 i-WT-r 系统。 | ||
| i-WT-r 供体质粒 | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI。gRNA 和供体质粒用于在 EED-KO 背景下构建 i-WT-r 系统。 | ||
| EED-gRNA-inducible | 序列：atggcaccccgaaattagaa。gRNA 和供体质粒用于在 EED-KO 背景下构建 i-WT-r 系统。 | ||
| i-MT-r 供体质粒 | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM。gRNA 和供体质粒用于在 EED-KO 背景下构建 i-MT-r 系统。 | ||
| 基因分型引物 | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | 序列：ctgtaggctgccatctgtga。野生型等位基因将产生 1.9 kb 的扩增产物，敲除等位基因将产生 200 bp 的扩增产物。 | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | 序列：agccagggctacacagagaa。野生型等位基因将产生 1.9 kb 的扩增产物，敲除等位基因将产生 200 bp 的扩增产物。 | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | 序列：tgcagtgaaacaaatttggaa。当插入表达盒后，引物将扩增出 1863 bp 产物；野生型等位基因将扩增出约 200 bp 的产物。 | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | 序列：gagaggggtggcactgtaaa。当插入表达盒后，引物将扩增出 1863 bp 产物；野生型等位基因将扩增出约 200 bp 的产物。 | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | 序列：ccccctctttctccttttct。当插入表达盒后，引物将扩增出 3200 bp 产物；野生型等位基因将扩增出 1560 bp 的产物。 | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | 序列：atgcctgggtgaatgaaaaa。当插入表达盒后，引物将扩增出 3200 bp 产物；野生型等位基因将扩增出 1560 bp 的产物。 |
参考文献
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (....
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重印与许可
