慢性沙门氏菌感染诱导的肠道纤维化

摘要

本方案描述了一种由沙门氏菌（Salmonella）诱导的小鼠肠道纤维化模型，该模型具有类似于克罗恩病的关键病理特征，包括透壁性炎症和纤维化。该方法可用于利用维持在C57Bl/6遗传背景上的基因突变小鼠，评估影响纤维化结局的宿主因素。

摘要

以胶原蛋白等细胞外基质病理性积聚为特征的组织纤维化，是持续性炎症和修复失调的结果。在炎症性肠病（IBD）中，纤维化导致反复发生的肠狭窄，目前除手术切除外尚无有效治疗方法。由于纤维化发生较晚，驱动其发展的相关机制研究较少，仍 largely 未知。因此，纤维化并发症是炎症性肠病领域面临的主要挑战之一。本实验方案描述了一种稳定的体内肠道纤维化模型：对C57Bl/6小鼠预先给予链霉素处理，随后经口灌胃接种疫苗级Salmonella Typhimurium ΔAroA突变株，可导致病原体在盲肠中持续定植并引发盲肠纤维化。本文详细说明了制备用于感染的S. Typhimurium ΔAroA菌株、定量盲肠和脾脏中的病原体载量，以及评估肠道组织中胶原沉积的方法。该实验性疾病模型可用于研究宿主因素在促进或加重克罗恩病样肠道纤维化中的作用。

引言

溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）是炎症性肠病（IBD）的两种主要类型，其特征为胃肠道的慢性、复发性炎症性疾病^1,2。这些疾病对患者的生活质量造成重大影响。IBD的症状包括腹痛、腹泻、恶心、体重减轻、发热和疲劳³。近期研究已鉴定出参与疾病发病机制的遗传和环境因素；这些风险因素被认为可破坏上皮屏障，导致管腔抗原的易位或过度取样⁴。由此引发肠道免疫细胞介导的对共生菌群的异常炎症反应⁴。IBD相关并发症的表现可能超出胃肠道，累及关节、皮肤和肝脏等多个器官^1,2。UC的典型特征是严重且弥漫性的炎症，通常局限于结肠¹。疾病病理累及肠壁的黏膜层和黏膜下层，导致浅表性黏膜溃疡¹。相比之下，CD可累及胃肠道的任何部位，尽管病变证据最常出现在结肠和远端回肠²。此外，CD的炎症为透壁性，累及肠壁的所有层次²。

已鉴定出的多个炎症性肠病（IBD）易感基因表明，上皮屏障功能失调或免疫系统异常是疾病进展的关键因素⁵。在单核细胞中表达的核苷酸寡聚化结构域2（NOD2）发生突变，被发现与克罗恩病（CD）易感性增加相关；这凸显了先天免疫对细菌组分识别异常与疾病之间的关联⁶。近期的全基因组关联研究（GWAS）进一步揭示了可能参与IBD发病机制的其他通路，包括以下基因的遗传变异：STAT1、NKX2-3、IL2RA、IL23R等与适应性免疫相关的通路，MUC1、MUC19和PTGER4在维持肠道屏障功能中的作用，以及ATG16L介导的自噬过程^7,8,9。尽管这些基于人群的遗传学研究加深了我们对IBD的理解，但仅凭易感等位基因可能不足以启动并维持慢性疾病状态³。其他非遗传因素，如肠道微生物组组成改变及多样性降低，也与肠道炎症相关。然而，目前尚不清楚肠道菌群失调是先于免疫应答失调发生，还是后者所导致的结果³。尽管IBD的确切病因仍不明确，但肠道炎症的实验性小鼠模型已显著增进了我们对其发病机制的认识^10,11。这些模型各自并不能完全再现人类疾病的复杂性，但它们对于阐明可能与IBD相关的病理生理通路，以及验证潜在治疗策略具有重要价值^10,11。此类小鼠模型通常依赖于化学诱导或感染引发炎症、免疫细胞转移或基因操作来建立疾病表型。此外，这些策略往往涉及上皮完整性破坏或对先天免疫或适应性免疫的调节。

Salmonella enterica 血清型是可感染人类和小鼠的肠道病原体。摄入后，Salmonella 可通过直接侵入肠上皮细胞、M细胞或抗原呈递细胞在肠道内定植¹²。经口感染 S. Typhimurium 的小鼠，其系统性部位（如脾脏和肠系膜淋巴结）为主要定植区域，而胃肠道内的菌量相对较低¹²。然而，预先用链霉素处理小鼠可削弱正常菌群对宿主的保护作用，从而增强 Salmonella 在肠道中的定植效率¹³。该模型的病理特征包括上皮屏障的破坏或溃疡、粒细胞募集以及严重水肿¹³。另一种方法是使用疫苗株 S. Typhimurium ΔAroA 突变体进行感染，可导致盲肠和结肠的长期定植，持续至感染后第40天¹⁴。S. Typhimurium ΔAroA 菌株在芳香族氨基酸生物合成方面存在缺陷，使其失去毒力，因而可作为高效疫苗使用¹⁵。小鼠经口感染后会引发与Th1和Th17细胞因子相关的炎症反应、广泛的组织重塑以及胶原沉积。组织病理学变化与促纤维化因子（如TGF-β1、CTGF和IGF）水平升高相关¹⁴。该模型中报道的透壁性纤维化瘢痕形成，类似于炎症性肠病（IBD）中常见的狭窄结构。Salmonella 诱导纤维化的过程依赖于其毒力岛（Salmonella pathogenicity islands, SPI）-1和SPI-2编码的毒力因子¹²。重要的是，S. Typhimurium ΔAroA 感染模型是研究维持在C57/Bl6背景上的基因突变小鼠纤维化反应的有用体系。C57/Bl6小鼠品系由于编码天然抗性相关巨噬蛋白（NRAMP）-1的基因发生功能缺失突变，对 S. Typhimurium SL1344 感染极为敏感^16,17。我们发现，在该模型中，IL-17A和RORα依赖的天然淋巴细胞对致病过程具有重要贡献¹⁸。

克罗恩病（CD）的一个主要并发症是细胞外基质（ECM）的失调性过度沉积，包括胶原蛋白^2,19。尽管胃肠道具有相对较强的再生能力，但持续未愈的伤口愈合反应可导致纤维化瘢痕形成，这通常与慢性且严重的炎症相关^20,21。在CD中，这会对组织结构产生有害影响，导致显著的器官功能障碍^21,22。CD中所观察到的透壁性炎症最终会引发肠壁增厚，进而导致有症状的狭窄或梗阻形成²¹。约三分之一的CD患者因该并发症需要接受肠切除手术²²。目前炎症性肠病（IBD）尚无有效的抗纤维化疗法，因为使用硫唑嘌呤等免疫抑制剂或抗TNFα生物制剂对减少手术干预需求无明显作用或仅产生轻微改善^19,23。尽管纤维化被认为是由慢性炎症所致，但来源于间充质的细胞（如成纤维细胞和周细胞）被认为是纤维化瘢痕中ECM的主要细胞来源^21,24。慢性S. Typhimurium ΔAroA感染是一种可靠的肠道纤维化小鼠模型，有助于揭示类似CD病理特征的发病机制。

方案

所有动物实验方案均经不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会批准。

1. 准备 沙门氏菌 用于小鼠灌胃的鼠伤寒沙门氏菌ΔAroA培养物

1. 从一管冻存的甘油菌种中 S. 鼠伤寒沙门氏菌ΔAroA，使用含100 μg/mL链霉素的LB琼脂平板，以无菌接种环划线接种，于37 ˚C过夜培养。划线平板可在4 ˚C保存最多一周。
2. 感染前一天，将0.5 g链霉素溶解于2.5 mL水中配制抗生素溶液。经滤膜除菌后，使用带橡胶头的22G灌胃针和1 mL注射器，对小鼠进行口服灌胃，每只给予100 μL链霉素溶液（每剂含链霉素20 mg）。用接种环挑取单菌落，接种于含3 mL LB液体培养基（含50 μg/mL链霉素）的培养管中。将沙门菌培养物置于37 ˚C有氧条件下，以200 RPM振荡培养过夜。
3. 感染当天，将过夜培养的沙门氏菌培养物用无菌 PBS 连续进行两次 1/10 稀释，以制备最终感染剂量。所得接种液 100 μL 中约含 3 × 10⁶ 菌落形成单位
4. 使用带有橡胶球头的22G灌胃针和1 mL注射器，对每只小鼠灌胃100 μL制备好的沙门菌液。
   注意：使用无菌技术制备沙门氏菌培养物。可通过在含链霉素的LB琼脂平板上接种系列稀释液，验证沙门氏菌的最终接种浓度。S. Typhimurium ΔAroA 菌株可联系 McNagny 教授（kelly@brc.ubc.ca）获取。

2. 评估 沙门氏菌 组织中的负担

1. 准备 2 mL 带安全盖的圆底微量离心管，每管加入 1 mL 无菌 PBS 和一颗已高压灭菌的不锈钢珠。在采集组织前预先称量各管重量。
2. 通过二氧化碳暴露法处死小鼠后，切除其盲肠和脾脏组织。将不同个体的组织分别收集至不同的离心管中。称量各管以确定组织重量。
3. 使用混合研磨仪在 30 Hz 条件下均质化组织 15 分钟。在 96 孔 2 mL 大容量深孔板中，每孔加入 900 μL PBS。用移液器将 100 μL 组织匀浆液加入第一孔，充分混匀，然后通过向后续各孔依次加入 100 μL 进行连续梯度稀释，直至获得 10^-6 稀释度。取每种稀释液 10 μL，每种做三个重复点样于含有 100 μg/mL 链霉素的 LB 琼脂平板上。
4. 计数菌落后，将平均菌落形成单位（CFU）乘以 100 倍（因 1000 μL 样品中仅点样了 10 μL），再乘以相应的稀释倍数。将组织总 CFU 数除以组织重量，计算每克组织中的 CFU 数。
   注意：组织处理过程中所有样品均需保持在冰上或 4 ˚C。使用组织匀浆液进行梯度稀释时，应采用宽孔口移液器吸头。提前准备好含有 PBS 的 96 孔大容量深孔板。

3. 偏振光下苦味酸-天狼星红染色及胶原定量分析。

1. 将盲肠组织在10%缓冲福尔马林中固定过夜，并进行石蜡包埋处理。按先前所述方法²⁵制备5-μm切片用于天狼星红染色。
2. 在明场显微镜下采集完整的盲肠横切面复合图像。
3. 打开Fiji（ImageJ），将.tif图像文件拖放到工具栏中。
4. 在菜单栏中，选择 图像 > 类型 > RGB堆栈，将图像拆分为红、绿、蓝三个通道。滑动面板底部的水平条，将通道设置为绿色。
5. 打开 图像 > 调整 > 阈值 工具。调整最小值和最大值以消除任何背景信号。设定理想阈值后，关闭阈值工具，然后进入 分析 > 设定测量项。勾选 面积、面积分数、限制于阈值 和 显示标签。
6. 使用 自由选择 或 多边形选择 工具圈定组织区域，然后点击 分析 > 测量，计算胶原阳性区域的百分比。
7. 将胶原染色阳性区域的绝对面积归一化为组织总面积。
   注：Fiji（ImageJ）是一款开源程序，可从 https://fiji.sc 下载。具有相同成像条件（即亮度和焦距）的图像必须使用相同的阈值设定以实现准确量化。如果所选组织内存在任何背景染色，应测量其绝对面积，并从整个组织的胶原阳性区域中扣除该值。

结果

链霉素处理后经口服感染 S. 鼠伤寒沙门氏菌 ΔAroA 会导致显著的肠道炎症和纤维化，尤其在盲肠中表现明显（图1). 典型的病原体载量为10⁸ 至 10⁹ 每克盲肠的菌落形成单位（CFU）及10⁴ 每克脾脏中可回收的菌落形成单位（CFU）数量可从感染动物中获得（图2). 对苦味酸-天狼星红染色的盲肠切片进行纤维化评估表明，感染后21天纤维化程度达到高峰，而大部分病理变化在感染后42天时已基本消退图3 和 图4）。胶原沉积在肠道黏膜下层最为显著，而黏膜层的纤维化程度较轻。

讨论

小鼠肠道炎症模型极大地促进了我们对炎症性肠病（IBD）发病机制的理解。尽管这些单一模型无法完全再现复杂且多因素的人类疾病的所有特征，但它们在识别疾病进展的关键特征方面具有重要价值。与IBD相关的纤维化狭窄仍是尚未满足的主要临床需求，因为目前的治疗方法无法有效逆转疾病的发展。此外，由于现有动物模型的局限性，在实验室环境中研究肠道纤维化十分困难。研究表明，在BALB/c小鼠中长期暴露于TNBS可诱导结肠内显著的胶原沉积，该过程由IL-13和TGF-B1信号通路驱动^27,28。然而，在其他常用的结肠炎实验室模型中，例如DSS处理、IL-10缺陷型或过继性T细胞转移模型，通常难以观察到肠道纤维化。Grassl et al. 证明，在C57Bl6小鼠中慢性感染减毒的ΔAroA突变型沙门菌株，可在盲肠黏膜及黏膜下区域引发显著的纤维化¹²。他们报告称，感染后三周纤维化达到高峰，并与Th1和Th17免疫反应以及升高的促纤维化因子TGF-B1、CTGF和IGF-1相关

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 ml 圆底安全锁管	Eppendorf	22363344
不锈钢珠	Qiagen	69989
PBS	Gibco	10010031
大孔径移液器吸头	Fisher	2707134
2 mL 大块板	Sarstedt	82.1972.002
灌胃针	FST	18061-22
硫酸链霉素	Sigma	S9137
混合研磨仪	Retsch	MM