本方案描述了一种由沙门氏菌（Salmonella）诱导的小鼠肠道纤维化模型，该模型具有类似于克罗恩病的关键病理特征，包括透壁性炎症和纤维化。该方法可用于利用维持在C57Bl/6遗传背景上的基因突变小鼠，评估影响纤维化结局的宿主因素。
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本文内容
摘要
摘要
以胶原蛋白等细胞外基质病理性积聚为特征的组织纤维化，是持续性炎症和修复失调的结果。在炎症性肠病（IBD）中，纤维化导致反复发生的肠狭窄，目前除手术切除外尚无有效治疗方法。由于纤维化发生较晚，驱动其发展的相关机制研究较少，仍 largely 未知。因此，纤维化并发症是炎症性肠病领域面临的主要挑战之一。本实验方案描述了一种稳定的体内肠道纤维化模型：对C57Bl/6小鼠预先给予链霉素处理，随后经口灌胃接种疫苗级Salmonella Typhimurium ΔAroA突变株，可导致病原体在盲肠中持续定植并引发盲肠纤维化。本文详细说明了制备用于感染的S. Typhimurium ΔAroA菌株、定量盲肠和脾脏中的病原体载量，以及评估肠道组织中胶原沉积的方法。该实验性疾病模型可用于研究宿主因素在促进或加重克罗恩病样肠道纤维化中的作用。
引言
溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）是炎症性肠病（IBD）的两种主要类型，其特征为胃肠道的慢性、复发性炎症性疾病1,2。这些疾病对患者的生活质量造成重大影响。IBD的症状包括腹痛、腹泻、恶心、体重减轻、发热和疲劳3。近期研究已鉴定出参与疾病发病机制的遗传和环境因素；这些风险因素被认为可破坏上皮屏障，导致管腔抗原的易位或过度取样4。由此引发肠道免疫细胞介导的对共生菌群的异常炎症反应4。IBD相关并发症的表现可能超出胃肠道，累及关节、皮肤和肝脏等多个器官1,2。UC的典型特征是严重且弥漫性的炎症，通常局限于结肠1。疾病病理累及肠壁的黏膜层和黏膜下层，导致浅表性黏膜溃疡1。相比之下，CD可累及胃肠道的任何部位，尽管病变证据最常出现在结肠和远端回肠2。此外，CD的炎症为透壁性，累及肠壁的所有层次2。
已鉴定出的多个炎症性....
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方案
所有动物实验方案均经不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会批准。
1. 准备 沙门氏菌 用于小鼠灌胃的鼠伤寒沙门氏菌ΔAroA培养物
- 从一管冻存的甘油菌种中 S. 鼠伤寒沙门氏菌ΔAroA，使用含100 μg/mL链霉素的LB琼脂平板，以无菌接种环划线接种，于37 ˚C过夜培养。划线平板可在4 ˚C保存最多一周。
- 感染前一天，将0.5 g链霉素溶解于2.5 mL水中配制抗生素溶液。经滤膜除菌后，使用带橡胶头的22G灌胃针和1 mL注射器，对小鼠进行口服灌胃，每只给予100 μL链霉素溶液（每剂含链霉素20 mg）。用接种环挑取单菌落，接种于含3 mL LB液体培养基（含50 μg/mL链霉素）的培养管中。将沙门菌培养物置于37 ˚C有氧条件下，以200 RPM振荡培养过夜。
- 感染当天，将过夜培养的沙门氏菌培养物用无菌 PBS 连续进行两次 1/10 稀释，以制备最终感染剂量。所得接种液 100 μL 中约含 3 × 106 菌落形成单位
- 使用带有橡胶球头的22G灌胃针和1 mL注射器，对每只小鼠灌胃100 μL制备好的沙门菌液。
注意：使用无菌技术制备沙门氏菌培养物。可通过在含链霉素的LB琼脂平板上接种系列稀释液，验证沙门氏菌的最终接种浓度。S. Typhimurium ΔAroA 菌株可联系 McNagny 教授（kelly@....
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结果
链霉素处理后经口服感染 S. 鼠伤寒沙门氏菌 ΔAroA 会导致显著的肠道炎症和纤维化，尤其在盲肠中表现明显（图1). 典型的病原体载量为108 至 109 每克盲肠的菌落形成单位（CFU）及104 每克脾脏中可回收的菌落形成单位（CFU）数量可从感染动物中获得（图2). 对苦味酸-天狼星红染色的盲肠切片进行纤维化评估表明，感染后21天纤维化程度达到高峰，而大部分病理变化在感染后42天时已基本消退图3 和 图4）。胶原沉积在肠道黏膜下层最为显著，而黏膜层的纤维化程度较轻。
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讨论
小鼠肠道炎症模型极大地促进了我们对炎症性肠病（IBD）发病机制的理解。尽管这些单一模型无法完全再现复杂且多因素的人类疾病的所有特征，但它们在识别疾病进展的关键特征方面具有重要价值。与IBD相关的纤维化狭窄仍是尚未满足的主要临床需求，因为目前的治疗方法无法有效逆转疾病的发展。此外，由于现有动物模型的局限性，在实验室环境中研究肠道纤维化十分困难。研究表明，在BALB/c小鼠中长期暴露于TNBS可诱导结肠内显著的胶原沉积，该过程由IL-13和TGF-B1信号通路驱动27,28。然而，在其他常用的结肠炎实验室模型中，例如DSS处理、IL-10缺陷型或过继性T细胞转移模型，通常难以观察到肠道纤维化。Grassl et al. 证明，在C57Bl6小鼠中慢性感染减毒的ΔAroA突变型沙门菌株，可在盲肠黏膜及黏膜下区域引发显著的纤维化12。他们报告称，感染后三周纤维化达到高峰，并与Th1和Th17免疫反应以及升高的促纤维化因子TGF-B1、CTGF和IGF-1相关
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披露
作者声明无任何经济利益冲突。
致谢
我们感谢 Ingrid Barta 提供的组织学服务。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2 ml 圆底安全锁管 | Eppendorf | 22363344 | |
| 不锈钢珠 | Qiagen | 69989 | |
| PBS | Gibco | 10010031 | |
| 大孔径移液器吸头 | Fisher | 2707134 | |
| 2 mL 大块板 | Sarstedt | 82.1972.002 | |
| 灌胃针 | FST | 18061-22 | |
| 硫酸链霉素 | Sigma | S9137 | |
| 混合研磨仪 | Retsch | MM |
参考文献
- Danese, S., Fiocchi, C. Ulcerative colitis. New England Journal of Medicine. 365 (18), 1713-1725 (2011).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. The Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Knights, D., Lassen, K. G., Xavier, R. J.
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重印与许可
