测量实验室微宇宙系统中的磷释放以评估水质

摘要

准确量化饱和土壤和沉积物中磷（P）的解吸潜力对于磷的建模及迁移控制工作具有重要意义。为更准确地考虑 原位 基于对实验室微宇宙系统进行重复取样，建立了一种简单方法，用于研究长期饱和条件下土壤-水氧化还原动态及磷的活化过程。

摘要

磷（P）是农业生态系统中一种关键的限制性养分，需谨慎管理以降低其向水生环境迁移的风险。常规的实验室磷生物有效性测定依赖于在氧化条件下对干燥样品进行化学提取。尽管此类方法具有实用性，但在表征长期淹水条件下磷的释放方面存在局限。在还原环境中，与氧化铁及其他金属结合的活性正磷酸盐可迅速解吸进入溶液，从而增加磷向地表径流和地下水迁移的风险。为更准确地量化在持续饱和条件下磷的解吸潜力与移动性，已开发出一种基于随时间重复采集孔隙水及上覆淹水水样的实验室微宇宙方法。该方法适用于量化理化性质各异的土壤和沉积物中磷的释放潜力，通过更精确地表征水文活跃区域的磷释放风险，有助于提升针对特定地点的磷减排措施效果。该方法的优势在于能够模拟 原位 动力学、简洁性、低成本和灵活性。

引言

磷（P）是作物和水生生物量生产力的关键限制性养分。地表水文过程是决定磷归趋与迁移的主要驱动因素，因为它不仅控制着沉积物和磷的物理迁移，还影响径流及淹水/积水事件期间磷的再释放潜力。通常采用多种基于实验室的提取方法，在氧化条件下估算田间尺度的磷释放量。尽管多种机制均可导致磷的释放，但铁结合态磷酸盐的还原性溶解是一种已被充分证实的反应机制，可导致大量正磷酸盐-P向水体释放^1,2,3,4。在关于湿地中控制磷生物地球化学过程机制的综述中，氧化还原状态被假定为控制磷向土壤和浅层地下水释放的主要变量⁵。因此，传统的磷检测方法可能无法可靠地预测长期饱和条件下的磷释放情况。

鉴于水体滞留时间和氧化还原状态对磷的归趋与迁移具有重要意义，旨在更准确模拟 原位 条件可能导致适用于受变异性饱和影响的农业和湿地生态系统的磷（P）迁移风险指数得到改进。由于正磷酸盐可立即被生物利用，饱和期间解吸的速率和程度可作为非点源磷污染风险的指标。本方法旨在量化磷向孔隙水（PW）的解吸以及向表层淹水水体（FW）的迁移，这是具有变源区水文特征区域（如淹水的农田、湿地、排水沟及河岸带/近溪流区域）的典型状况。该方法最初用于表征美国纽约州北部季节性淹水土壤中磷的释放潜力，近期已应用于量化美国佛蒙特州西北部尚普兰湖流域河岸带土壤中磷的解吸潜力⁶在此，我们提供了一种实验室微宇宙法的实验方案，并重点介绍最近发表的一项研究结果，以展示该方法在量化磷解吸潜力方面的能力。我们还展示了磷释放潜力与常规土壤测试（活性可提取磷、pH）在不同地点预测磷释放能力之间的关系。

实施该方法需要进入具备适当气候控制、通风、供水和规范酸性废液处理系统的分析实验室。该方法假定可获取常规化学试剂和实验室设备（如水槽、通风橱、玻璃器皿等）。除常规实验室需求外，还需配备膜过滤系统（≤ 0.45 µm）和用于测定磷（P）的紫外分光光度计。建议配备pH计或多参数水质检测探针，但非必需。实验室温度是一个重要因素，除非温度本身作为实验变量进行研究，否则应保持恒定（建议为20 °C）。能够无障碍地使用配备适当设备的合格分析实验室，是正确实施该方法并获得有意义结果的前提条件。

方案

1. 样品采集

1. 从目标地点采集约 4 L 的土壤（或沉积物）。采样区域应相对较小，以限制磷（P）和土壤性质的空间变异性。
2. 先用粗筛（20 mm）过筛样品，再用 2 mm 筛过筛。过筛后用手充分混合样品。
3. 称取 100 g 田间湿润状态的土壤或沉积物。在 105 °C 的烘箱中烘干 24 h，计算重量含水量（土壤水质量/干土质量）。
4. 取 500 mL 子样品用于化学分析。
   注：建议进行土壤 pH、有机质含量和活性无机磷（Pi）浓度等土壤测试。本研究中，土壤活性 Pi 有效性的评估方法如下：1）用 1.25 mol L^-1 醋酸铵溶液（pH = 4.8；下文简称改良 Morgan 法提取磷）提取 Pi，并通过比色法测定^7,8；2）用蒸馏水提取 Pi；3）用 1.25 mol L^-1 醋酸铵溶液（pH = 4.8）提取磷，并通过电感耦合等离子体-光学发射光谱法（ICP）测定⁸。
5. 将剩余过筛后的土壤用于微宇宙实验，或装入聚乙烯袋中于 5 °C 保存以备后续使用。
   注：土壤在冷藏较长时间（>30 天）后会变干，使用前需重新润湿。切勿冷冻土壤样品，以免影响微生物完整性及磷的释放潜力。

2. 微型生态系统构建

1. 使用一升（1 L）量程的聚丙烯或其他惰性塑料烧杯作为独立的实验单元（微宇宙系统）。用10%盐酸清洗烧杯，并用蒸馏水冲洗三遍。
2. 从烧杯底部向上量取2 cm，在靠近刻度处做一标记。钻一个直径为1.25 cm的孔，用于安装排水口。
3. 在接头外缘内侧及钻孔外周涂上少量硅胶。小心地将排水口插入孔中。
   注意：在进入步骤2.4之前，需至少静置干燥24小时。
4. 将接头外周轮廓描在尼龙网滤膜上，并用剪刀剪下。在每片滤膜外缘周围涂上一层薄硅胶，然后将滤膜压在接头入口处。使用前需至少干燥24小时。
   注意：大多数应用推荐使用100 µm孔径的滤膜；然而，质地较细的土壤可能需要更大孔径的滤膜，以避免过长的孔隙水样品采集时间。
5. 在直径为0.625 cm的短段乳胶管两端安装到接头末端，并在管上夹一个3.3 cm宽的纸夹，以阻止液体流动。

3. 进行磷释放试验

1. 将500 mL样品加入两个平行的微宇宙系统中，并沿烧杯壁缓慢加入蒸馏水，直至淡水（FW）体积达到1 L标记处。
   注意：在采集初始样品前，让微宇宙系统平衡24−48小时。
2. 松开纸夹以启动渗漏水（PW）从排水口流出。将洁净的30 mL烧杯直接置于PW排水口下方收集样品。先排出数mL的PW并弃去，随后收集接下来的10 mL作为代表性样品体积。
3. 将PW样品通过0.45 µm膜滤器过滤，并立即测定其中的可溶性反应性磷（SRP）。记录吸光度值及测量时间。
   注意：SRP通常被认为是正磷酸盐；然而，钼酸盐反应性磷也可能与胶体和/或纳米颗粒形成复合物，这些物质可穿透0.45 µm滤膜⁴。
4. 通过将10 mL橡胶头吸管插入水柱中段，以环形运动方式吸取初始FW样品。将样品排入烧杯，立即过滤并测定SRP。
5. 用蒸馏水将烧杯重新加水至1 L刻度，以补充取样损失的水量。
   注意：蒸发损失量会有所变化。目标是在所有微宇宙系统中持续保持总体积（淹水土壤+水柱）为1 L。补充蒸发损失的水分对SRP浓度的稀释效应可忽略不计。
6. 根据所需分析的磷释放时间点数量，重复步骤3.2至3.5。
   注意：随时间采集的样品数量取决于实验设计目标。若培养温度接近20 °C，每周采样一至三次通常已足够。在较高温度下培养会加快SRP的释放速率，需更频繁地采样。此处目的在于展示微宇宙方法的应用价值，而非侧重实验数据的分析。适用于拟合磷解吸/吸附数据的动力学模型和经验模型在其他文献中已有报道^9,10。由于微宇宙方法采用重复测量设计，并可容纳重复样本和不同处理组，因此广义线性混合模型分析方法也适用¹¹。

结果

最近一项关于河岸带磷释放潜力的研究结果被重点介绍，以展示该方法表征站点尺度磷释放动态的能力⁶尽管部分土壤中的速效磷（SRP）随时间变化较小，但其他土壤中水溶性磷（PW-SRP）和铁铝氧化物结合态磷（FW-SRP）的浓度则显著升高（图1）。展示了两个呈现相反趋势的位点 图1. 土壤7号样点为河岸带样地，土壤pH较低，且以几乎连续的可溶性反应性磷（SRP）为特征 吸附 来自 PW (图1A）。土壤14采自相邻的玉米种植田，其土壤中活性无机磷（Pi）含量较高（土壤14），在淹水后的第一个月内，其PW-SRP几乎增加了7倍（图1B).

与PW-SRP浓度相反，FW-SRP随时间推移呈下降趋势（图1）。同时测定孔隙水中的亚铁（Fe²⁺）作为氧化还原状态的替代指标。除一种土壤外，其余土壤的PW-Fe²⁺均在约3周后显著升高，表明体系进入还原状态。由于土壤干燥会影响有机碳和无机磷（Pi）的溶解度，因此有两个采样点的土壤在淹水前进行了干燥处理。与保持田间持水量状态的土壤相比，干燥后淹水显著增加了Pi从土壤向孔隙水的解吸以及随后向表层水的迁移（图1C、D）。

还进行了部分土壤磷测试，以评估其预测平均可溶性反应性磷（SRP）浓度的可靠性。蒸馏水提取法和改良摩根法提取的磷（通过钼酸盐比色法测定）是预测平均地表径流和暗管排水中可溶性反应性磷（SRP）浓度的最佳指标之一（图 2A、C）。采用ICP测定的改良摩根法提取磷的预测效果，不如采用钼酸盐比色法测定的改良摩根法提取磷或蒸馏水提取法（图 2C）。地表径流SRP与暗管排水SRP比值（PW-SRP:FW-SRP）随土壤pH值呈线性增加（图 2D）。

图1：河岸带低pH且易变性无机磷含量较低的土壤（A）、易变性无机磷含量较高的玉米种植土壤（B），以及河岸带土壤在田间持水量状态下淹水（C）与干燥后再淹水（D）条件下，经过75天培养后土壤孔隙水（PW）和上覆淹水水体（FW）中可溶性反应性磷（SRP）浓度的变化。 误差线表示两个微型生态系统重复测量值的标准偏差。数据经Young和Ross⁶修改后使用，已获许可。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：实验期间孔隙水（PW）和淹水层（FW）中可溶性活性磷（SRP）平均浓度随改良摩根法可提取磷（通过钼酸盐比色法测定）（A）、改良摩根法可提取磷（Pi + 有机磷，通过电感耦合等离子体发射光谱法测定）（B）以及蒸馏水提取磷（C）的变化关系。（D）本研究中土壤pH值对PW-SRP与FW-SRP平均比值的影响关系。 数据经Young和Ross⁶许可后修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

微宇宙方法的一个主要技术优势在于其模拟能力 原位 饱和土壤或沉积物上方直接覆盖着在氧化还原状态和磷含量方面可能存在显著差异的淡水，此类条件即为所述情形。具有可变水源区水文特征的景观，例如排水沟、淹水农田、湿地以及河岸带/近溪区域，均属于还原态孔隙水周期性被氧化程度更高且正磷酸盐（Pi）浓度较低的水体覆盖的典型环境。这些氧化还原梯度可显著影响正磷酸盐的吸附/解吸过程，从而影响其向地表水和地下水的迁移能力^{1,2,3,4,5,6,12,13,14}与更常规的提取方法或磷吸附等温线实验不同，微宇宙方法通过微生物呼吸消耗溶解在孔隙水中的氧气，自然模拟了还原条件。同时，上覆水体保持与空气相通，使氧气得以扩散进入其中，类似于野外的自然条件。只要上覆水体仍处于氧化状态，诸如铁（Fe）等溶解态金属便²⁺ 和 Mn²⁺ 可能从孔隙水向上扩散，并在好氧界面处通过氧化作用吸收硫酸根还原产物（SRP），从而有助于防止SRP向淡水中的迁移^2,3,6,14,15这种特定的磷吸附机制在湿地、湖泊沉积物和淹水的农业土壤中具有重要意义。微宇宙方法能够捕捉这些关键的自然系统动态，相较于更传统的研究方法具有优势。

我们的结果还强调了常规土壤/沉积物化学测定作为预测石油污染水体（PW）和淡水（FW）中可溶性反应性磷（SRP）释放潜力的重要性。例如，蒸馏水提取法和改良摩根提取法所测得的可提取无机磷（Pi）均能可靠地估算培养期间平均SRP浓度，表明先前吸附的活性Pi是限制Pi释放量的重要因素。可提取Pi的含量不仅是管理农业磷养分的重要变量，还可作为经验性和基于过程的水质模型的输入参数。¹⁶PW-SRP与FW-SRP的比值与土壤pH呈线性关系，表明在较高pH条件下，更大比例的PW-SRP被转化为FW-SRP。该效应可能与以下事实有关：强磷吸附性金属阳离子（如Al）的溶解度³⁺ 和 Fe³⁺ 在较低pH条件下，正磷酸盐的溶解度增加，因此更易在溶液中与SRP形成化学键（需注意，已有充分研究证实，由于相同机制，土壤中正磷酸盐的有效性通常在接近中性pH时达到最大）。实验结果还表明，淹水处理显著增加了干燥土壤中Pi的释放。其他研究者也报道过干燥后Pi溶解度的提升现象。^17,18,19 值得进一步研究以完善当前的磷循环模型。显然，土壤性质（活性无机磷状况、土壤pH、矿物学特性）与氧化还原波动之间的相互作用会显著影响无机磷的释放和迁移。微宇宙方法有助于分离和研究这些及其他因素的相互作用，同时可在模拟自然条件的基础上进行受控实验 原位 环境。

微宇宙方法易于进行多种修改，可能对磷（P）研究人员具有重要意义。除了影响无机磷（Pi）释放的基本化学和物理性质的变化外，添加土壤改良剂（如畜禽粪便/肥料、生物固体、堆肥和磷吸附材料）以及其他管理措施仍将是重要的考虑因素。由于温度变化会显著影响Pi的释放/吸附动力学^9,20以及氧化还原反应^9,15,20，因此设计用于单独研究温度对Pi释放影响的实验也可能具有重要价值。此外，通过向滤水（FW）中加入已知量的Pi并随时间测定其减少量，可方便地开展Pi吸附能力实验³；所吸附磷的量随后可与土壤性质相关联，以预测湿地生态系统中Pi的持留能力。鉴于该方法具有操作简便、成本低廉和灵活性高的特点，还可根据具体研究目标进行其他设计上的调整。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.25 cm 塑料接头	若干	NA
用于磷测定的化学试剂	若干	NA	假设具备磷分析能力；具体方法详见引用文献
配备 1.25 cm 钻头的手电钻或电钻	若干	NA
带刻度的塑料烧杯（1L）	若干	NA
配备通风橱、温度控制和酸性废液处理系统的实验室	NA	NA
尼龙网滤筛（100 μm）	若干	NA
硅胶	若干	NA
紫外分光光度计	若干	NA