人体脂肪组织微片段化用于细胞表型分析与分泌组表征

摘要

本文介绍了一种使用封闭系统装置进行人脂肪组织无酶微片段化的技术。该新方法可获得适用于体内移植、体外培养以及进一步细胞分离与表征的亚毫米级脂肪组织簇。

摘要

近十年来，脂肪组织移植已广泛应用于整形外科和骨科，以增强组织充填和/或再生。因此，为了快速高效地获取大量组织，人体脂肪组织的采集与处理技术不断发展。其中，封闭式系统技术是一种创新且易于使用的系统，可在短时间内于同一手术过程中（术中）完成脂肪组织的采集、处理和回注。通过抽脂术获取脂肪组织后，经洗涤、乳化、冲洗，并通过机械方式将其切碎成直径为0.3至0.8 mm的细胞团簇。机械破碎的自体脂肪组织移植在多种治疗适应症中表现出显著疗效，包括美容医学与外科、骨科及普通外科。对微碎片化脂肪组织的表征显示，脂肪细胞团簇内存在完整的微小血管，因此血管周围微环境得以保持完整。这些团簇富含血管周围细胞（即间充质干细胞（MSC）前体细胞），体外分析表明，与酶解法获得的MSC相比，其释放参与组织修复与再生的生长因子和细胞因子的水平显著升高。这提示，微碎片化脂肪组织更优的治疗潜力可能归因于假定MSC频率更高以及分泌活性增强。目前尚不清楚这些额外的壁细胞是否直接促进生长因子和细胞因子的产生。该经临床批准的操作方法可在无需体外扩增和/或酶处理的情况下实现假定MSC的移植，从而规避了GMP规范的相关要求，并降低了细胞治疗的成本。

引言

脂肪组织长期以来被用作重建和整形手术中的填充材料，近年来因其被确认为间充质干细胞（MSCs）的来源而在再生医学领域日益受到关注¹。通过酶消化法将抽吸脂肪组织解离为单细胞悬液后，可获得不含脂肪细胞的基质血管组分（SVF），该组分可直接用于患者体内，但更常见的做法是将其培养数周以获得间充质干细胞²。

然而，酶解离会破坏组织微环境，使邻近的调控细胞与假定的再生细胞隔离，而这些再生细胞在体外培养过程中会发生显著改变。为了避免此类实验假象及其导致的功能改变，研究人员已尝试在尽可能保持脂肪组织原有结构完整的前提下，对其进行处理以用于治疗目的^3,4。值得注意的是，机械性组织破碎技术正逐渐取代酶解离方法。为此，全浸没式封闭系统通过一系列筛网过滤和钢珠诱导破碎，将脂肪抽吸物加工成亚毫米级、无血液和油脂的组织簇（例如 Lipogems）³。利用该封闭系统技术进行自体移植微碎片化脂肪组织已在多种适应症中取得成功，涵盖整形美容、骨科、肛肠科和妇科等领域^{4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}。

通过封闭系统设备获得的人类微碎片化脂肪组织（MAT）与同源基质血管组分（SVF）的比较表明，在体外培养中，MAT在血管/间质细胞分布和分泌活性方面含有更多的周细胞（即推测的间充质干细胞¹⁴），并分泌更高水平的生长因子和细胞因子¹⁵。

本文介绍了一种使用封闭系统装置对人皮下脂肪组织进行无酶微碎片化处理的方法，并进一步对微细化脂肪组织进行体外培养、免疫组织化学以及FACS分析，以鉴定其中存在的细胞类型及分泌的可溶性因子（图1）。该方法可安全地生成含有活细胞群体且微环境完整的脂肪来源亚毫米类器官，适用于后续多种应用与研究。

方案

本研究使用人体组织的伦理批准已由苏格兰东南研究伦理委员会批准（编号：16/SS/0103）。

1. 皮下腹部脂肪组织采集

注意：手动脂肪抽吸术中使用的所有器械均由微碎片化设备的制造商提供。

1. 在整个实验过程中，确保所有液体、容器、器械及操作区域的无菌状态。
2. 将整形外科手术获取的腹壁皮肤脂肪组织样本（由手术团队置于无菌袋中，未添加任何溶液）放置于手术布上，皮肤面朝上。无需清洗。为获得最佳效果，应将样本保存在 4 °C 环境中，并在采集后 16 小时内处理脂肪组织样本。
3. 根据组织样本大小，使用一次性组织灌注套管向皮下脂肪组织内注入 50 至 100 mL 的 37 °C 0.9% NaCl 溶液（对于最大面积为 15 cm² 的脂肪组织使用 50 mL，随后按比例增加体积）。
4. 将一个 10 mL 带鲁尔锁接头的注射器连接至一次性吸脂套管。
5. 从脂肪组织边缘小心地将套管插入组织内部。插入后，通过拉动注射器活塞在其中形成负压。用手固定活塞位置，以维持负压抽吸状态。
6. 在脂肪组织样本内进行放射状移动，直至注射器充满吸脂物。小心将套管从组织中取出，并断开注射器连接。更换一个新的空注射器。
7. 重复该操作，直至收集到 60 mL 吸脂物。
   注意：可处理的吸脂物最大体积取决于所用设备的类型。请参考制造商说明书（材料表）。

2. 脂肪抽吸物的微片段化

注意：本实验方案仅用于科研用途。微片段化操作需借助一种 commercially available device（参见材料表）进行。

1. 从包装中取出设备，确认主机已连接废液袋。将废液收集袋放置于地面，并确保阀门已牢固连接至处理单元的盖帽上。
2. 将进液管末端的穿刺针插入生理盐水袋的连接口，完成连接。保持生理盐水袋高于处理单元。
   注意： 对于本方案所用设备类型，建议使用2,000 mL无菌生理盐水袋。
3. 确认连接在管路电路上的全部5个夹钳均处于打开状态。将处理单元垂直放置，灰色盖帽朝上。
4. 让生理盐水溶液充满处理单元。检查液体流动是否到达废液袋。通过轻轻摇晃处理单元，排除其中所有气泡。
   注意： 后续所有操作步骤必须在处理单元内无空气的条件下进行。
5. 将处理单元垂直放置，蓝色盖帽朝上，并关闭靠近进液管的夹钳。
6. 将注射器连接至蓝色进液盖帽的自闭合阀，开始注入脂肪抽吸物。操作过程中保持处理单元垂直，缓慢拉动注射器活塞，直至所有脂肪抽吸物完全转移至处理单元内。重复此过程，直至全部脂肪抽吸物均进入处理单元。
   注意： 对于本视频中使用的处理单元，每次最多加入30 mL脂肪抽吸物。该操作最多可重复两次，总计处理不超过60 mL脂肪抽吸物。
7. 打开进液管夹钳，恢复生理盐水流动。
8. 用力摇晃处理单元至少2分钟，并定期检查生理盐水流入废液袋的流动情况。
9. 当处理单元内的生理盐水在约2分钟摇晃后变为透明时，将处理单元调转为灰色盖帽朝上，关闭位于灰色盖帽附近排液管上的夹钳。处理后的组织将浮于上层。
10. 用生理盐水溶液填充一支10 mL鲁尔锁式注射器，并将其连接至蓝色盖帽的加样阀。关闭蓝色盖帽附近的夹钳。将另一支空的10 mL鲁尔锁式注射器（活塞完全推入）连接至灰色盖帽的阀门。
    注意：仅使用鲁尔锁式注射器。
11. 从蓝色盖帽处用力将生理盐水注入处理单元。确保连接在灰色阀门上的注射器随之逐渐充满处理后的组织。当生理盐水全部注入后，小心取下两支注射器。
12. 重复步骤2.10和2.11，直至所有处理后的组织被收集完毕。
    注意：从60 mL手动抽取的脂肪抽吸物中，平均可获得30 mL成熟脂肪组织（MAT）。部分组织将残留在处理单元内部，部分团块可能附着于单元内侧蓝色边缘处。
13. 处理结束后，取下所有注射器，关闭所有夹钳，断开生理盐水袋，并根据当地规定妥善处置设备。
    注意： 该处理设备不可重复使用。

3. 荧光免疫组织化学

1. 将 300–500 µL MAT 转移至 1.5 mL 离心管中。加入 1 mL 4% 缓冲液配制的多聚甲醛（PFA），用手轻轻混匀（禁止涡旋），于 4 °C 下孵育过夜（16 至 24 小时）。
2. 收集样本并转移至含有 1 mL PBS 的洁净 1.5 mL 离心管中。重复该步骤两次，以去除多余的 PFA。
3. 将样本转移至含 15%（w/v）蔗糖的 PBS 溶液中，于 4 °C 下孵育过夜（16 至 24 小时）。
4. 将样本转移至 24 孔板的一个孔中，并加入由 15% 蔗糖和 7% 明胶（w/v）溶于 PBS 制成的包埋液，填充至孔体积的一半。于 37 °C 下孵育 4 小时。
5. 将样本转移至 4 °C。待明胶在 2–4 小时内凝固后，用包埋液填满孔，并于 4 °C 下继续孵育过夜。
6. 从孔中取出样本，去除多余的包埋剂，并在干冰上速冻。将样本储存于 -80 °C。
7. 使用冷冻切片机切出 8–10 µm 厚的切片。为获得最佳切片效果，建议将冷冻切片机温度设定为 -30 °C。载玻片可储存于 -80 °C。
8. 在进行免疫荧光染色前，用 4% PFA 固定切片 7 分钟。去除 PFA 后，用温热的 PBS（37 °C）洗涤两次，以去除切片上的明胶。
9. 在室温下用含 10% 山羊血清的 PBS（v/v）孵育载玻片 1 小时，以阻断非特异性抗体结合。
10. 将一抗稀释于抗体稀释液或含 0.2%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 中：小鼠抗人 NG2 抗体（1:100，原液 0.5 mg/mL），兔抗人 PDGFRβ 抗体（1:100，原液 0.15 mg/mL）。
11. 去除封闭液，加入稀释后的一抗，于 4 °C 下孵育过夜。
    注意：从此时起，所有孵育步骤均需避光进行。
12. 去除一抗，用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
13. 将二抗稀释于抗体稀释液或含 0.2%（w/v）BSA 的 PBS 中：山羊抗小鼠 IgG-555（1:300），山羊抗兔 IgG-647（1:300）。室温孵育 1 小时。
14. 去除二抗，用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
15. 若使用生物素标记的凝集素，则需使用亲和素/生物素封闭试剂盒。每种试剂孵育 10 分钟，中间用 PBS 洗涤两次。
16. 再次进行封闭步骤：在室温下用含 10% 山羊血清的 PBS 孵育载玻片 1 小时。
17. 加入生物素化凝集素——生物素化荆豆凝集素（Ulex europaeus lectin，1:200，原液 2 mg/mL），用含 0.2% BSA（w/v）的 PBS 或抗体稀释液稀释。室温孵育 1 小时 30 分钟。
18. 去除多余的生物素化凝集素，用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
19. 加入链霉亲和素偶联的二抗，用含 0.2%（w/v）BSA 的 PBS 或抗体稀释液稀释。孵育 1 小时。
20. 去除二抗，用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
21. 用 DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，1:500，原液 5 mg/mL）复染细胞核，DAPI 用含 0.2% BSA（w/v）的 PBS 稀释，室温孵育 10 分钟。
22. 去除 DAPI 溶液，用 PBS 洗涤两次，每次 10 分钟。
23. 使用水溶性封片剂封片。在避光条件下于室温过夜自然干燥，或在 37 °C 下干燥 1 小时。
24. 将载玻片避光保存于 4 °C，并在落射荧光显微镜下采集图像。

4. 微片段化脂肪组织的消化与细胞分离

1. 将微碎化的脂肪组织转移至无菌容器中。
2. 将II型胶原酶以1 mg/mL的浓度溶解于DMEM中，新鲜配制消化液。
3. 向微碎化的脂肪组织中加入等体积的消化液（例如，30 mL样品加入30 mL消化液）。
4. 将密封的容器置于37 °C、120 rpm的摇床水浴中震荡45分钟。请注意，容器应允许样品充分震荡。若无大型容器，可使用两个50 mL离心管，每管装入30 mL样品与消化液的混合物，并水平放置。
5. 孵育结束后，加入等体积的终止液（2% (v/v) FCS/PBS）以终止消化反应，并依次通过100 µm和70 µm细胞筛网过滤。
6. 将滤过的悬液在200 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。
7. 用约5 mL红细胞裂解缓冲液（155 mM NH₄Cl，170 mM Tris，pH 7.65）重悬沉淀。缓冲液体积可根据细胞沉淀中观察到的红细胞污染程度进行调整。室温孵育15分钟。
8. 加入等体积的终止液，并通过40 µm细胞筛网过滤。
9. 将细胞悬液在200 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。
10. 用终止液重悬细胞沉淀，通过移液充分混匀。使用台盼蓝染色排除法在血细胞计数板上计数活细胞。
    1. 取等体积细胞悬液与台盼蓝染液混合。吸取10 µL混合液滴加至血细胞计数板上。
    2. 计数至少5个方格内的活细胞数量（明亮且圆形的细胞），计算平均细胞数。为计入染色液稀释倍数，将平均细胞数乘以2。将所得数值乘以10⁴，即可得到每1 mL样品中的总活细胞数。
       注：所得的单细胞悬液，即基质血管组分（SVF），可直接以20,000个细胞/cm²的密度接种于血管周围细胞生长培养基中（DMEM添加20%热灭活FCS、1%青霉素/链霉素和1% L-谷氨酰胺），或用于流式细胞术分析与分选。SVF中每毫升微碎化脂肪组织（MAT）的有核细胞平均产量约为3 × 10⁴个细胞。分选实验至少需要8 × 10⁵个细胞，才能获得足够数量的血管周围细胞用于培养。

5. 细胞标记与分选

1. 将细胞悬液在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于封闭液中，浓度为每 100 µL 含 1 × 10⁶ 个细胞。
2. 取至少 50,000 个细胞分装至聚苯乙烯圆底流式细胞管中，用于未染色对照和荧光减一（FMO）对照。其余细胞用于多色染色，置于另一管中。
   注意：一旦实验条件确定（即激光强度、设门策略），若所用抗体相同，可用于未染色对照和 FMO 对照的细胞数量可减少。
3. 向单细胞悬液中加入用于多色染色的 CD31-V450（1:400）、CD34-PE（1:100）、CD45-V450（1:400）和 CD146-BV711（1:100）抗体。对于 FMO 对照，分别加入以下试剂：V450 FMO 对照管中加入等体积的 CD34-PE、CD146-BV711 抗体及 V450 同型对照；PE FMO 对照管中加入等体积的 CD31-V450、CD45-V450、CD146-BV711 抗体及 PE 同型对照；BV711 FMO 对照管中加入等体积的 CD31-V450、CD45-V450、CD34-PE 抗体及 BV711 同型对照。
4. 轻轻吹打或缓慢涡旋混匀管内溶液，并在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
5. 准备补偿对照微珠：在 3 支聚苯乙烯圆底流式细胞管中，每管加入 15 µL 阳性微珠和 15 µL 阴性微珠至 70 µL 封闭液中。分别向每管加入 CD34-PE、CD31-V450 或 CD45-V450、以及 CD146-BV711 抗体，每管一种抗体。
6. 轻轻吹打或缓慢涡旋，使抗体与微珠充分混匀，所有管在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
   注意：上述步骤既可用于流式细胞分析，也可用于细胞分选。
7. 通过用内皮细胞生长培养基（EGM）预润湿收集管内壁来准备收集管，每管底部保留约 50 µL 培养基。
8. 抗体孵育完成后，用 2 mL 封闭液洗涤细胞和微珠，以去除多余的抗体。
9. 以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，小心吸除液体。重复洗涤一次。
10. 将细胞重悬于封闭液中，最终浓度为每 250 µL 含 1 × 10⁶ 个细胞。将微珠重悬于 100 µL 封闭液中。
11. 将细胞转移至带有细胞筛网帽的新的聚苯乙烯圆底流式细胞管中，以利于打散细胞团块。
12. 将所有细胞和微珠悬液置于冰上避光运输至细胞分选仪。
13. 运行未染色对照细胞，以确定背景荧光并设定电压。
14. 运行补偿对照管，设定荧光补偿参数。
15. 使用前向散射面积（FSC-A）对侧向散射面积（SSC-A）图确定细胞群体，再使用前向散射面积（FSC-A）对前向散射高度（FSC-H）图筛选单细胞。
16. 向未染色对照中加入 DAPI（每毫升样品加入 1 µL 的 5 µg/mL 溶液），用于设定死细胞的设门阈值（图 2）。DAPI 染色后无需洗涤。
17. 运行同型对照，以确定非特异性结合相关的背景荧光阈值，并完成设门。
18. 运行多色染色样本。通过设门排除 CD31 和 CD45 阳性细胞，收集周细胞（CD146⁺ CD34^-）和外膜细胞（CD146^- CD34⁺）群体至收集管中（图 2）。
    注意：周细胞的活细胞回收率约为总活细胞解离数的 2%，外膜细胞约为 1.5%。

6. 细胞培养

1. 将 freshly sorted 的周细胞和外膜细胞以每平方厘米 30,000 至 40,000 个细胞的密度接种² 在明胶包被的培养皿上
2. 为包被培养板，使用无菌的 PBS 溶液配制的 0.2% (w/v) 明胶覆盖板面（每平方厘米约需 100 µL 溶液）²）。室温孵育10分钟，弃去溶液。在培养板包被过程中，将 freshly sorted cells 置于冰上保存。
3. 将新收集的细胞在 200 x g 5 分钟后，用适量内皮细胞生长培养基（EGM）轻轻重悬细胞沉淀。若收集的细胞数量极少，可省略离心步骤，直接将收集的细胞接种。
4. 将细胞接种于明胶包被的培养板上。在37 °C、5% CO₂条件下孵育。₂.
5. 待细胞沉降并贴壁（至少 72 h 后），将 EGM 换为血管周细胞生长培养基（DMEM 添加 20% 热灭活 FCS、1% 青霉素/链霉素和 1% L-谷氨酰胺），用于周细胞和外膜细胞的培养。
6. 当周细胞和外膜细胞达到80%–90%融合度时，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化细胞。用5% FCS/PBS收集，200 x g离心 g 5分钟，重新悬浮于血管周围细胞生长培养基中，然后以1:3至1:5的比例（或约7,000个细胞/cm²）传代细胞²) 加入未包被的聚苯乙烯培养板或培养瓶中。

结果

手动脂肪抽吸物的机械解离产生了微片段化脂肪组织（MAT），其由包裹着微血管网络的脂肪细胞聚集体构成（图3）。对明胶包埋并冷冻固定的MAT进行免疫荧光分析，可清晰显示该结构，其中血管网络通过内皮细胞标志物荆豆凝集素1（Ulex europaeus agglutinin 1, UEA-1）受体标记，主要由细小的毛细血管样结构组成（图4）。值得注意的是，表达NG2或PDGFRβ的周细胞正常分布，包绕于内皮细胞周围（图4）。这些数据证实，机械微片段化过程并未影响血管周围细胞区室。通过流式细胞术进一步确认了血管周围细胞（包括周细胞和外膜细胞）的存在。细胞分选采用前向散射面积（FSC-A）对侧向散射面积（SSC-A）设门（图2A）。所鉴定的细胞群进一步通过前向散射面积（FSC-A）对前向散射高度（FSC-H）设门以...

讨论

本文描述了使用封闭系统装置将人脂肪组织物理分离为具有正常脂肪组织微解剖结构的小型细胞簇的方法。

将人工抽吸获取的人体皮下脂肪组织与生理盐水装入一个透明塑料圆筒中，该圆筒内含有多个类似弹珠机中的金属球体。通过剧烈手动振荡装置，金属球可将脂肪破碎成亚毫米级的碎片。装置配备的滤膜和出口可去除碎片、血液及游离脂质，所得微碎片化脂肪组织（MAT）被收集至与装置连接的注射器中。本研究中，所获得的MAT已成功用于免疫组织化学、流式细胞术及细胞培养。尽管该装置最初是出于医学应用目的而开发，旨在手术环境中替代经酶解法获得的脂肪组织基质血管组分或经培养获得的脂肪源性干细胞，但其在整形外科及多种其他细胞治疗领域已证明具有高度有效性^4,5,6,7,8,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 缓冲型多聚甲醛（PFA）	VWR chemicals	9317.901
0.9% 氯化钠溶液	Baxter	3KB7127
AlexaFluor 555 山羊抗小鼠 IgG	Life Technologies	A21422
AlexaFluor 647 山羊抗兔 IgG	Life Technologies	A21245
氯化铵	fisher chemicals	1158868
抗原稀释液	Life Technologies	3218
抗小鼠 Ig、κ/阴性对照（BSA）补偿增强剂	BD Biosciences	560497
亲和素/生物素封闭试剂盒	Life Technologies	4303
BD LSR Fortessa 5 激光流式细胞仪	BD Biosciences		405 nm（紫色）/375 nm（紫外）激光 – DAPI 和 V450 抗体使用 V450/50 滤光片；561 nm（黄绿色）激光 – PE 抗体使用 YG582/15 滤光片；405 nm（紫色）/375 nm（紫外）激光 – BV711 抗体使用 V710/50 滤光片
生物素化荆豆凝集素（Ulex europaeus lectin）	Vector Laboratories	Vector-B1065
BV711 小鼠 IgG1，k 同型对照	BD Biosciences	563044
CD146-BV711	BD Biosciences	563186
CD31-V450	BD Biosciences	561653
CD34-PE	BD Biosciences	555822
CD45-V450	BD Biosciences	560367
DAPI	Life Technologies	D1306	储存浓度：5 mg/mL
一次性吸脂套管（LGI 13 G × 185 mm – AR 13/18）	Lipogems		包含于 Lipogems 外科手术套件中
Diva 软件 306（v.6.0）	BD Biosciences
DMEM，高糖，含 GlutaMAX，不含丙酮酸钠	Life Technologies	61965026
EGMTM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKitTM	Lonza	CC-3156
胎牛血清（FCS）	Sigma-Aldrich	F2442
FlowJo（v.10.0）	FlowJo
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
明胶	Acros Organics	410870025
Lipogems 外科手术套件	Lipogems	LG SK 60
小鼠抗人 NG2 抗体	BD Biosciences	554275	储存浓度：0.5 mg/mL
PE 小鼠 IgG1，κ 同型对照	BD Biosciences	555749
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4333
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	D8537
带细胞筛网 snap cap 的聚苯乙烯圆底 5 mL 管	BD Biosciences	352235, 25/包
聚苯乙烯圆底 5 mL 管	BD Biosciences	352003
兔抗人 PDGFRb 抗体	Abcam	32570	储存浓度：0.15 mg/mL
链霉亲和素偶联 488	Life Technologies	S32354
蔗糖	Sigma-Aldrich	84100-5kg
组织灌注套管（17 G × 185 mm - VG 17/18）	Lipogems		包含于 Lipogems 外科手术套件中
Tris 碱	fisher chemicals	BP152-500
II 型胶原酶	Gibco	17101-015
V450 小鼠 IgG1，κ 同型对照	BD Biosciences	560373
宽场 Zeiss observer 显微镜	Zeiss		所用物镜：Plan-Apo 20x/0.8
Zeiss Colibri7 LED 光源（LEDs：385、475、555、590、630 nm）	Zeiss		DAPI：紫外光，激发波长 385 nm；488：蓝光，激发波长 475 nm； 555：绿光，激发波长 555 nm； 647：红光，激发波长 630 nm