生成心室样人诱导多能干细胞来源心肌细胞及用于钙处理特性表征的高质量细胞制备

摘要

本文描述并验证了一种稳定生成强健的人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的方法，并对其功能进行了表征。这些技术可能有助于深入理解信号通路的机制，为大规模药物筛选提供平台，并可靠地模拟心脏疾病。

摘要

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）为研究钙离子（Ca²⁺）调控机制和信号通路的基础科学，以及高通量药物筛选和毒性检测提供了宝贵的人源细胞资源。本文详细描述了用于生成高质量iPSC-CMs的方法学，这些细胞可在不同细胞系之间稳定重现其分子和功能特性。此外，还介绍了一种通过评估Ca²⁺调控特性来可靠分析其功能表征的方法。低氧（O₂）培养条件、乳酸筛选以及延长培养时间可获得高纯度、高质量的类心室心肌细胞。与分离的成年大鼠心肌细胞（ARCMs）类似，培养3个月的iPSC-CMs相较于培养30天的细胞，表现出更高的Ca²⁺振幅、更快的Ca²⁺再摄取速率（衰减时间常数）以及对β-肾上腺素能刺激呈正性肌松弛反应。该策略在技术上简便、成本效益高且可重复性强，为心脏疾病建模以及以Ca²⁺调控蛋白为靶点的大规模药物筛选提供了可靠的实验平台。

引言

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）是一种极具吸引力的基于人类细胞的体外平台，可用于模拟多种心脏疾病^{1,2,3,4,5,6,7,8}。此外，iPSC-CMs还可用于预测患者对新药或现有药物的反应，筛选候选化合物，并开发新的个体化药物^9,10。然而，尽管已取得显著进展，在使用iPSC-CMs时仍需考虑若干局限性和挑战¹¹。因此，研究人员已深入探索了多种改进心脏分化方案、提高iPSC-CMs的效率与成熟度以及生成特定心肌细胞亚型（心室型、心房型和结节型）的方法，并已提出大量培养策略以克服这些障碍^12,13....

方案

本研究中使用成年大鼠心肌细胞的实验均按照西奈山伊坎医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。成年大鼠心肌细胞通过基于Langendorff的方法从小鼠Sprague Dawley大鼠心脏中分离，具体方法如前所述¹⁶。

1. 培养基的制备

1. 准备 hiPSC 培养基。
   1. 将添加剂和基础培养基平衡至室温（RT）。确保添加剂已完全解冻。取 400 mL 基础培养基与 100 mL 添加剂混合，使用 0.22 μm 真空驱动滤器过滤。4 °C 保存，使用前平衡至室温。
2. 准备 RPMI + B27 培养基。
   1. 将 B27 添加剂和基础培养基（RPMI 1640）平衡至室温（RT）。确保添加剂已完全解冻。取 490 mL 基础培养基与 10 mL 50 倍浓缩添加剂混合，使用 0.22 μm 真空驱动滤器过滤。4 °C 保存，使用前平衡至室温。
3. 准备不含胰岛素的 RPMI + B27 培养基（RPMI + B27 (-) insulin）。
   1. 将不含胰岛素的 B27 添加剂和基础培养基（RPMI 1640）平衡至室温（RT）。确保添加剂已完全解冻。取 490 mL 基础培养基与 10 mL 50 倍浓缩添加剂混合，使用 0.22 μm 真空驱....

结果

如图1A所述方案可生成高纯度的心肌细胞，这些细胞在培养过程中随时间推移逐渐获得心室样/成年样表型。通过免疫荧光染色检测心房和心室肌球蛋白调节轻链2亚型（分别为MLC2A和MLC2V）的表达发现，在心脏分化诱导后第30天，该方案生成的大部分细胞呈MLC2A阳性，而同一时间点MLC2V的表达量则显著较低（图2A，上排图像）。随着培养时间延长（第60天和第90天），观察到MLC2亚型（从MLC2A向MLC2V）发生了完全转换（图2A，下排图像）。为定量分析MLC2A和MLC2V阳性细胞的比例，进行了流式细胞术分析。与免疫荧光结果一致，流式细胞术数据显示，早期阶段（第30天）的iPSC-CMs主要表达MLC2A（MLC2A阳性细胞占29.8%，MLC2V阳性细胞占1.9%）（见图2B

讨论

使用人iPSC-CMs作为实验模型的关键步骤包括：1）生成高质量的心肌细胞（CMs），以确保实验性能的一致性和结果的可重复性；2）在培养中使细胞成熟至少90天，以充分评估其表型；3）进行电生理学研究，例如钙离子（Ca²⁺）瞬变测量，以提供对人iPSC-CMs具有生理相关性的功能表征。我们开发了一种基于单层培养的分化方法，可产生高质量的类心室样iPSC-CMs。该方法依赖于多个关键因素，是现有方案^14,18的一种改进。与其他方案不同，本方法在iPSCs的维持及其向CMs分化的第一周均采用低氧条件（5% O₂）。低氧环境模拟了胚胎和胎儿心脏发育过程中的生理条件¹⁹。已有研究表明，缺氧条件还可促进iPSCs的增殖及其后续向CMs的分化²⁰。接种密度和iPSCs的正确传代也是成功进行心脏分化的关键因素。当70−80%汇合度的iPSCs使用无酶溶液解离为小细胞聚集体，并以1:6的传代比例接种时.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗肌动蛋白，α-平滑肌抗体，小鼠单克隆	Sigma Aldrich	A5228
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠	Invitrogen	A11001
Alexa Fluor 555 山羊抗兔	Invitrogen	A21428
B27 添加剂	Gibco	17504-044
不含胰岛素的 B27 添加剂	Gibco	A18956-01
CHIR-99021	Selleckchem	S2924
DAPI 核染色剂	ThermoFisher	D1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L-谷氨酰胺 + 15 mM Hepes	Gibco	11330-032
双头细胞刮刀，平刃和J型钩	Celltreat	229306
Falcon 多孔组织培养板，6 孔	Corning	353046
流体在线加热器	Live Cell Instrument	IL-H-10
Fura-2, AM	Invitrogen	F1221
人胚胎干细胞合格基质	Corning	354277	Matrigel 基质
人多能干细胞培养基	Gibco	A33493-01	StemFlex 基础培养基
IWR-1	Sigma Aldrich	I0161
活细胞成像室	Live Cell Instrument	EC-B25
MLC-2A，小鼠单克隆抗体	Synaptic Systems	311011
心肌细胞钙离子与收缩力检测系统	Ionoptix	ISW-400
肌球蛋白轻链2抗体，兔多克隆（MLC2V）	Proteintech	10906-1-AP
带PES膜的Nalgene快速流动一次性无菌过滤装置	ThermoFisher	124-0045
含钙和镁的PBS	Corning	21-030-CV
不含钙和镁的PBS	Corning	21-031-CV
优质玻璃盖玻片	Lab Scientific	7807
RPMI 1640 培养基（无 D-葡萄糖）(1X)	Gibco	11879-020
RPMI 1640 培养基 (1X)	Gibco	11875-093
钠-L-乳酸盐	Sigma Aldrich	L7022
StemFlex 添加剂	Gibco	A33492-01
噻唑紫定	Tocris	3845
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056
台氏液	Boston Bioproducts	BSS-355w	调节pH至7.2，加入1.2 mM氯化钙