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生成心室样人诱导多能干细胞来源心肌细胞及用于钙处理特性表征的高质量细胞制备

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DOI：

10.3791/60135

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2020年1月17日

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

本文内容

摘要

本文描述并验证了一种稳定生成强健的人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的方法，并对其功能进行了表征。这些技术可能有助于深入理解信号通路的机制，为大规模药物筛选提供平台，并可靠地模拟心脏疾病。

摘要

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）为研究钙离子（Ca2+）调控机制和信号通路的基础科学，以及高通量药物筛选和毒性检测提供了宝贵的人源细胞资源。本文详细描述了用于生成高质量iPSC-CMs的方法学，这些细胞可在不同细胞系之间稳定重现其分子和功能特性。此外，还介绍了一种通过评估Ca2+调控特性来可靠分析其功能表征的方法。低氧（O2）培养条件、乳酸筛选以及延长培养时间可获得高纯度、高质量的类心室心肌细胞。与分离的成年大鼠心肌细胞（ARCMs）类似，培养3个月的iPSC-CMs相较于培养30天的细胞，表现出更高的Ca2+振幅、更快的Ca2+再摄取速率（衰减时间常数）以及对β-肾上腺素能刺激呈正性肌松弛反应。该策略在技术上简便、成本效益高且可重复性强，为心脏疾病建模以及以Ca2+调控蛋白为靶点的大规模药物筛选提供了可靠的实验平台。

引言

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）是一种极具吸引力的基于人类细胞的体外平台，可用于模拟多种心脏疾病1,2,3,4,5,6,7,8。此外，iPSC-CMs还可用于预测患者对新药或现有药物的反应，筛选候选化合物，并开发新的个体化药物9,10。然而，尽管已取得显著进展，在使用iPSC-CMs时仍需考虑若干局限性和挑战11。因此，研究人员已深入探索了多种改进心脏分化方案、提高iPSC-CMs的效率与成熟度以及生成特定心肌细胞亚型（心室型、心房型和结节型）的方法，并已提出大量培养策略以克服这些障碍12,13,14,15。

尽管这些方案具有较强的稳健性，但使用iPSC-CMs的一个主要问题是获得高质量心肌细胞的长期且复杂操作流程的可重复性，而高质量细胞是确保实验性能一致和结果可重复的关键。可重复性不仅在比较具有不同遗传背景的细胞系时至关重要，在对同一细胞系重复进行细胞和分子水平比较时也同样重要。细胞间的变异性，例如iPSCs在不同孔之间的密度差异，可能影响心脏分化过程，导致心肌细胞产量低、质量差。这些低质量细胞仍可用于不需要纯心肌细胞群体的实验（例如进行Ca2+瞬变测量时）。实际上，在进行电生理分析时，非心肌细胞无论在自发活动或电刺激下均不会搏动，因此容易将其排除在分析之外。然而，由于细胞质量较差，iPSC-CMs可能表现出异常的电生理特征（如不规则的Ca2+瞬变、Ca2+振幅降低），而这些异常并非由其遗传背景所致。因此，在利用iPSC-CMs构建心脏疾病模型时，尤其需要注意避免将低质量心肌细胞产生的结果误判为疾病表型。在开展电生理研究之前，必须进行严格的筛选和排除流程。

本方法包含优化的实验方案，用于生成高纯度和高质量的心肌细胞，并通过使用钙离子和收缩力采集与分析系统进行Ca2+瞬变检测，以评估其功能。该技术是一种简便而强大的方法，可用于区分高效与低效的诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CM）制备，并对人源iPSC-CM提供更具生理相关性的功能表征。

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方案

本研究中使用成年大鼠心肌细胞的实验均按照西奈山伊坎医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。成年大鼠心肌细胞通过基于Langendorff的方法从小鼠Sprague Dawley大鼠心脏中分离，具体方法如前所述16。

1. 培养基的制备

  1. 准备 hiPSC 培养基。
    1. 将添加剂和基础培养基平衡至室温（RT）。确保添加剂已完全解冻。取 400 mL 基础培养基与 100 mL 添加剂混合，使用 0.22 μm 真空驱动滤器过滤。4 °C 保存，使用前平衡至室温。
  2. 准备 RPMI + B27 培养基。
    1. 将 B27 添加剂和基础培养基（RPMI 1640）平衡至室温（RT）。确保添加剂已完全解冻。取 490 mL 基础培养基与 10 mL 50 倍浓缩添加剂混合，使用 0.22 μm 真空驱动滤器过滤。4 °C 保存，使用前平衡至室温。
  3. 准备不含胰岛素的 RPMI + B27 培养基（RPMI + B27 (-) insulin）。
    1. 将不含胰岛素的 B27 添加剂和基础培养基（RPMI 1640）平衡至室温（RT）。确保添加剂已完全解冻。取 490 mL 基础培养基与 10 mL 50 倍浓缩添加剂混合，使用 0.22 μm 真空驱动滤器过滤。4 °C 保存，使用前平衡至室温。
  4. 准备筛选培养基（无葡萄糖 RPMI + B27 + 乳酸盐）。
    1. 将 B27 添加剂和基础培养基（无葡萄糖 RPMI 1640）平衡至室温（RT）。确保添加剂已完全解冻。取 490 mL 基础培养基与 10 mL 50 倍浓缩添加剂混合，加入用无菌水配制的 4 mM 乳酸钠，使用 0.22 μm 真空驱动滤器过滤。4 °C 保存，使用前平衡至室温。
  5. 准备 RPMI 20 培养基。
    1. 将基础培养基（RPMI 1640）平衡至室温（RT）。将胎牛血清（FBS）（终浓度 20%）与 RPMI 混合，使用 0.22 μm 真空驱动滤器过滤，4 °C 保存。使用前平衡至室温。
  6. 通过向 hiPSC 培养基中添加 Rho 相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂（终浓度 2 μM），制备传代培养基。
  7. 通过向不含胰岛素的 RPMI + B27 培养基中添加 GSK-3 抑制剂 CHIR 99021（终浓度 10 μM），制备 D0 培养基。
  8. 通过将不含胰岛素的 RPMI + B27 培养基与 IWR-1（终浓度 5 μM）混合，制备 D3 和 D4 培养基。
    注：D1 和 D5 培养基由不含胰岛素的 RPMI + B27 组成；D7 培养基由 RPMI + B27 组成。
  9. 制备封闭缓冲液（含 2% 牛血清白蛋白 [BSA]、2% FBS 和 0.05% NP-40 的磷酸盐缓冲液 [PBS]）：在 50 mL 锥形管中加入 1 g BSA、1 mL FBS、49 mL PBS 和 250 μL NP-40，搅拌至完全溶解。

2. 人胚胎干细胞（hESC）专用基质包被培养板和盖玻片的制备

注意：所有步骤均须在无菌的组织培养罩内进行。

  1. 将hESC专用基质工作液在4 °C条件下冰上过夜解冻。参考产品说明书确定合适的分装体积，因为不同批次可能有所差异。将分装后的基质储存于-20 °C的1.5 mL离心管中。
  2. 为用于包被培养板或玻璃盖玻片，首先在4 °C条件下解冻一份hESC专用基质30分钟。
  3. 将24 mL冷的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）: 营养混合物F-12（DMEM/F:12）移入50 mL锥形管中。
  4. 使用一支2 mL玻璃移液管混合冷的DMEM/F:12培养基，以使移液管表面冷却。
  5. 使用同一支移液管吸取约500−700 μL冷的DMEM/F:12，并在离心管内与hESC专用基质分装液充分混合。
  6. 充分混匀后，将混合液转移至含有冷DMEM/F:12的50 mL锥形管中，再次混匀。
  7. 对于标准6孔板，每孔加入1 mL上述混合液，确保完全覆盖孔底。将培养板置于超净台内室温（RT）环境中静置至少30分钟。如需储存，可在包被后立即置于4 °C保存最多1周，使用前于室温平衡30分钟。
  8. 使用前，吸除基质溶液，并替换为适当的培养基。立即使用。
  9. 将玻璃盖玻片存放于无菌环境中（例如，置于无菌细胞培养超净台内）。
  10. 包被前，用70%乙醇逐个擦拭每片盖玻片。待盖玻片干燥后，将其放入无菌6孔板的孔中。
  11. 取250−300 μL hESC专用基质溶液，小心地直接滴加至玻璃盖玻片中心。在使用前，将盖玻片置于超净台内室温环境中静置至少30分钟。

3. 小分子的制备

注意：除非另有说明，所有小分子和 Wnt 调节剂均用 DMSO 重悬。

  1. 准备 IWR-1 和 CHIR 99021，每份 25 µL，浓度为 10 mM，分装后于 -20 °C 保存。
  2. 重悬 Thiazovivin（ROCK 抑制剂），每份 50 µL，浓度为 10 mM，分装后于 -20 °C 保存。

4. iPSC 的维持与传代

注意：以下所有步骤均须在无菌细胞培养罩内进行。

  1. 将iPSCs维持在标准的6孔板中，并在无菌条件下进行所有操作。每孔加入2 mL hiPSC培养基进行细胞培养，每隔一天更换一次培养基。将细胞置于37 °C、6% O2、5% CO2的环境中培养。当细胞融合度达到70−80%时进行传代。
  2. 将不含Ca2+和Mg2+的PBS平衡至室温。
  3. 开始传代操作时，向需要传代的孔中加入1 mL不含Ca2+和Mg2+的PBS，室温孵育7−10分钟。在显微镜下观察细胞，确保PBS处理未导致单层细胞完全解离。
  4. 吸除PBS，每孔加入1 mL传代培养基。使用细胞刮轻轻刮取并使细胞从孔壁表面脱落。
  5. 使用无菌的2 mL玻璃移液管通过机械方式解离细胞。重复操作，直至在显微镜下观察到细胞均匀地分散为小细胞团。
  6. 当细胞充分解离后，加入5 mL传代培养基，按1:6比例进行分瓶。可根据所需的分瓶比例调整传代培养基的添加量。
  7. 吸除hESC认证基质包被板中的hESC认证基质，每孔加入1 mL传代培养基。每孔加入1 mL已解离的细胞悬液。

5. 心肌细胞分化

  1. 使用已建立良好（传代超过20代）且呈现均一形态的hiPSC细胞系，在开始心肌分化前进行评估。
  2. 确保iPSCs的融合度在70−80%左右。
  3. 用不含 Ca 的 PBS 洗涤细胞 1 次2+ 和 Mg2+.
  4. 每孔加入 2 mL D0 培养基（步骤 1.7），将细胞放回培养箱中。
  5. 24小时后，每孔更换为3 mL D1培养基，继续培养48小时。
  6. 第3天，每孔更换为2 mL D3培养基。第4天用D4培养基重复操作。
  7. 第5天，每孔更换为3 mL D5培养基。
  8. 第7天，每孔更换为3 mL D7培养基，并转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中2，以及正常的O2 浓度。每2天更换一次D7（RPMI + B27）培养基。

6. 筛选流程与iPSC-CM解离

  1. 在进行 Ca2+ 瞬变测量或任何功能分析前 10 天，每孔加入 3 mL 筛选培养基，替换 RPMI + B27 培养基，持续 48 小时。
  2. 再次更换为每孔 3 mL 筛选培养基，继续培养 48 小时。
  3. 每孔更换为 2 mL RPMI + B27 培养基，培养 24 小时。
  4. 按照第 2 节所述方法包被标准 6 孔板。
  5. 每孔加入 1 mL 无菌的含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶。将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。
  6. 使用 1,000 μL 移液器机械性吹打细胞，直至在显微镜下可见单细胞悬液。
  7. 将细胞转移至无菌的 15 mL 圆底离心管中，每孔加入 2 mL RPMI 20 培养基。在 800 × g 条件下离心 5 分钟。
  8. 吸除上清液，将细胞重悬于 RPMI + B27 培养基中。吸除培养板中的 hESC-合格基质，并更换为每孔 1 mL RPMI + B27 培养基。
  9. 使用 1,000 μL 移液器枪头机械性吹打细胞沉淀，直至溶液呈现均一状态。
  10. 将约 500,000 个细胞转移至每孔。将培养板放入培养箱中培养 24 小时。
  11. 每孔更换为 3 mL 筛选培养基，培养 48 小时。
  12. 每孔更换为 3 mL RPMI + B27 培养基。将细胞维持在 D7 培养基（RPMI + B2）中，每 2 天更换一次培养基，直至可用于功能分析。

7. 流式细胞术用iPSC-CMs的制备

  1. 当细胞达到所需年龄并完成代谢筛选（第6节）后，用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 洗涤细胞。
  2. 每孔加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶，于 37 °C 培育 5−7 分钟。
  3. 使用 P1000 枪头将混合液吹打 5−10 次以分散细胞，然后转移至含有 2 mL RPMI 20 的 15 mL 离心管中。
  4. 以 600 × g 离心 5 分钟。
  5. 向细胞沉淀中加入 100 µL 固定液（4% 多聚甲醛），在持续轻柔涡旋条件下逐滴加入，随后置于冰上 15 分钟。
  6. 加入 1.5 mL PBS，通过离心收集细胞，并吸除上清液。
  7. 每次实验均需为每种固定/通透条件设置一个未染色对照样本。
  8. 将细胞重悬于 500 µL 封闭液（含 0.1% NP-40 的 PBS 中添加 2% FBS 和 2% BSA）中，在室温下孵育 30 分钟。
  9. 不移除封闭液，直接加入初级抗体 MLC2V/MLC2A（5 mg/mL），于室温孵育 45 分钟。
  10. 用封闭缓冲液洗涤，离心收集细胞，并吸除液体。
  11. 加入用封闭缓冲液稀释的二抗 Alexa Fluor 555/488（1:750），于室温孵育 45 分钟，或 4 °C 过夜。
  12. 加入 1.5 mL PBS，离心收集细胞，并吸除液体。
  13. 将细胞重悬于 250−300 µL PBS 中，使用 P1000 移液器吹打以进一步分散细胞。
  14. 准备带有 35 µm 尼龙网细胞筛帽的圆底管，用 50 µL PBS 预先润湿细胞筛，并将管置于冰上。
  15. 将含有分散细胞的溶液转移至带细胞筛帽的圆底管中，让细胞溶液自然滤过，必要时轻敲管底以确保完全滤出并收集细胞至管中。操作后应尽快将管放回冰上。
  16. 用 250 µL PBS 冲洗细胞筛，以回收残留细胞。
  17. 将管保持在冰上，并用铝箔包裹，直至进行流式细胞术分析。

8. 将心肌细胞接种到玻璃盖玻片上

注意：所有步骤均须在无菌环境中进行。

  1. 按照步骤 2.10 和 2.11 所述方法准备玻璃盖玻片。
  2. 当诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）已被筛选并达到所需培养时间后，按照步骤 6.5−6.7 将 iPSC-CMs 进行解离。
  3. 吸除上清液，并用适量 RPMI 20 培养基重悬细胞，使每 250 μL 溶液中约含 300,000 个细胞。
  4. 使用 2 mL 玻璃移液管，机械性地解离细胞沉淀，直至溶液呈现均匀状态。
  5. 吸除盖玻片上的适用于人胚胎干细胞（hESC）的基质材料。
  6. 使用 1000 μL 移液器，从 15 mL 锥形管中混匀并吸取 250 μL 溶液。
  7. 缓慢将 250 μL 溶液滴加至玻璃盖玻片上，特别注意仅将溶液加至含有适用于 hESC 的基质涂层的区域。
  8. 小心转移至培养箱中过夜，注意避免震荡或使盖玻片上的细胞扩散。次日早晨，每孔轻轻加入 2 mL D7 培养基（RPMI + B27）。24 小时后更换培养基，之后每两天更换一次。

9. 细胞固定

  1. 确保将足量含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 平衡至 4 °C。
  2. 用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 配制 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，并平衡至 4 °C。
  3. 当 iPSC-CMs 达到适当培养时间、完成代谢筛选（第 6 节）并接种于盖玻片上（第 8 节）后，每孔用 1 mL 冷的含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 洗涤细胞 3 次。
  4. 加入 1 mL 冷的 4% PFA，将细胞置于通风橱中室温孵育 15 分钟。
  5. 用冷的 PBS 洗涤细胞，以去除多余的 PFA。
  6. 加入 2 mL 含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS，并于 4 °C 保存。

10. 免疫荧光染色

  1. 移除固定细胞中的 PBS，加入 1 mL 封闭缓冲液，在室温下孵育 1 小时。
  2. 移除封闭缓冲液，加入用封闭缓冲液稀释的一抗（5 mg/mL），在 4 °C 下孵育过夜。
  3. 用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  4. 加入用封闭缓冲液按 1:1,000 稀释的二抗。
  5. 用铝箔包裹培养板以避光，于室温孵育 45 分钟。后续步骤中继续使用铝箔避光。
  6. 用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  7. 加入足量 DAPI 工作液，完全覆盖细胞，在室温下孵育 10 分钟。
  8. 用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 充分洗涤样品，以去除多余的 DAPI。
  9. 取新的载玻片，在中央滴加一滴封片剂，用滴管将封片剂均匀铺开。将带有细胞的盖玻片细胞面朝下置于载玻片上。
    注意：若避光保存，样品可存放长达 30 天。

11. 细胞内 Ca2+ 瞬变的评估

  1. 当iPSC-CMs培养至少3个月、已完成代谢筛选（第6节）并接种于盖玻片上后，加入2 μL Fura-2, AM（终浓度：1 μM），在37 °C孵育10分钟。
    注意：Fura-2对光敏感。所有染料加载操作及实验均需在避光条件下进行。
  2. 准备钙离子与收缩力采集及分析系统。
    1. 启动系统电源，确保弧光灯已开启（图1B）。
    2. 将灌流 chamber 置于系统上，将泵的管路连接至相应的进液口和出液口，并将刺激器的电线按 图1C 所示连接至 chamber。
    3. 用预热至37 °C的Tyrode溶液填充流体在线加热器中的灌流管路。
    4. 调整相机和成像孔径尺寸，以最小化背景区域。
  3. 将带有iPSC-CMs的玻璃盖玻片装入 chamber 并固定。
  4. 轻轻在固定好的玻璃盖玻片上方直接加入500 μL Tyrode溶液，并开始以1.5 mL/min的速度向 chamber 灌流Tyrode溶液。
  5. 使用电刺激器以1 Hz频率进行场刺激（10 V，4 ms），刺激iPSC-CMs。
  6. 在持续刺激条件下，使iPSC-CMs在 chamber 中孵育至少3−5分钟，以充分洗去Fura-2染料并适应环境，同时清除残留荧光染料。
  7. 将观察窗口调整至盖玻片的左上区域。
  8. 开始记录。
  9. 在获得连续稳定的5−10个峰信号后，点击 暂停 以暂时停止记录。
  10. 确保焦点和观察窗口尺寸未发生改变，移动显微镜载物台至相邻区域，向对侧方向移动，然后恢复记录。
  11. 重复步骤11.9和11.10，以锯齿形方式扫描整个盖玻片区域，先向左移动，再向下移动，覆盖整个盖玻片。每张盖玻片共进行80−100次测量。
    注意：总测量时间应限制在10分钟以内，因次级因素会导致Ca2+瞬变信号减弱。
  12. 完成Ca2+瞬变信号采集后，根据制造商说明，使用荧光轨迹分析软件对数据进行分析。

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结果

如图1A所述方案可生成高纯度的心肌细胞，这些细胞在培养过程中随时间推移逐渐获得心室样/成年样表型。通过免疫荧光染色检测心房和心室肌球蛋白调节轻链2亚型（分别为MLC2A和MLC2V）的表达发现，在心脏分化诱导后第30天，该方案生成的大部分细胞呈MLC2A阳性，而同一时间点MLC2V的表达量则显著较低（图2A，上排图像）。随着培养时间延长（第60天和第90天），观察到MLC2亚型（从MLC2A向MLC2V）发生了完全转换（图2A，下排图像）。为定量分析MLC2A和MLC2V阳性细胞的比例，进行了流式细胞术分析。与免疫荧光结果一致，流式细胞术数据显示，早期阶段（第30天）的iPSC-CMs主要表达MLC2A（MLC2A阳性细胞占29.8%，MLC2V阳性细胞占1.9%）（见图2B

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讨论

使用人iPSC-CMs作为实验模型的关键步骤包括：1）生成高质量的心肌细胞（CMs），以确保实验性能的一致性和结果的可重复性；2）在培养中使细胞成熟至少90天，以充分评估其表型；3）进行电生理学研究，例如钙离子（Ca2+）瞬变测量，以提供对人iPSC-CMs具有生理相关性的功能表征。我们开发了一种基于单层培养的分化方法，可产生高质量的类心室样iPSC-CMs。该方法依赖于多个关键因素，是现有方案14,18的一种改进。与其他方案不同，本方法在iPSCs的维持及其向CMs分化的第一周均采用低氧条件（5% O2）。低氧环境模拟了胚胎和胎儿心脏发育过程中的生理条件19。已有研究表明，缺氧条件还可促进iPSCs的增殖及其后续向CMs的分化20。接种密度和iPSCs的正确传代也是成功进行心脏分化的关键因素。当70−80%汇合度的iPSCs使用无酶溶液解离为小细胞聚集体，并以1:6的传代比例接种时...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国心脏协会（AHA）科学家发展基金 17SDG33700093（F.S.）；西奈山临床与转化研究职业发展 KL2 学者奖 KL2TR001435（F.S.）；美国国立卫生研究院（NIH）R00 HL116645 基金及 AHA 18TPA34170460（C.K.）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗肌动蛋白，α-平滑肌抗体，小鼠单克隆Sigma AldrichA5228
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠InvitrogenA11001
Alexa Fluor 555 山羊抗兔InvitrogenA21428
B27 添加剂Gibco17504-044
不含胰岛素的 B27 添加剂GibcoA18956-01
CHIR-99021SelleckchemS2924
DAPI 核染色剂ThermoFisherD1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L-谷氨酰胺 + 15 mM HepesGibco11330-032
双头细胞刮刀，平刃和J型钩Celltreat229306
Falcon 多孔组织培养板，6 孔Corning353046
流体在线加热器Live Cell InstrumentIL-H-10
Fura-2, AMInvitrogenF1221
人胚胎干细胞合格基质Corning354277Matrigel 基质
人多能干细胞培养基GibcoA33493-01StemFlex 基础培养基
IWR-1Sigma AldrichI0161
活细胞成像室Live Cell InstrumentEC-B25
MLC-2A，小鼠单克隆抗体Synaptic Systems311011
心肌细胞钙离子与收缩力检测系统IonoptixISW-400
肌球蛋白轻链2抗体，兔多克隆（MLC2V）Proteintech10906-1-AP
带PES膜的Nalgene快速流动一次性无菌过滤装置ThermoFisher124-0045
含钙和镁的PBSCorning21-030-CV
不含钙和镁的PBSCorning21-031-CV
优质玻璃盖玻片Lab Scientific7807
RPMI 1640 培养基（无 D-葡萄糖）(1X)Gibco11879-020
RPMI 1640 培养基 (1X)Gibco11875-093
钠-L-乳酸盐Sigma AldrichL7022
StemFlex 添加剂GibcoA33492-01
噻唑紫定Tocris3845
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)ThermoFisher25200056
台氏液Boston BioproductsBSS-355w调节pH至7.2，加入1.2 mM氯化钙

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