本文介绍了一种猪角膜瓣的制备与培养的逐步操作方案。由于该类器官型培养的器官培养模型在15天内的细胞死亡率与人供体角膜相当，因此成为首个无需添加有毒右旋糖酐即可实现非人角膜长期培养的模型。
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摘要
摘要
角膜内皮细胞的实验研究面临诸多困难。人类供体角膜资源稀缺，通常需用于移植手术，极少可用于实验研究。内皮细胞培养往往难以真实反映体内情况。由于非人类角膜的生物结构特性，在培养过程中基质层容易发生显著肿胀，导致大量角膜内皮细胞丢失，使得长期培养难以实现。为对抗这一现象，常使用右旋糖酐等脱水剂。然而，这些试剂同样会引起明显的内皮细胞丢失。因此，本研究建立了一种无需使用脱水剂的离体器官培养模型。采用当地屠宰场提供的猪眼制备分割角膜片。在部分角膜打孔后，去除角膜的外层结构（包括上皮层、鲍曼层及部分基质层）。该操作显著减少了因基质层严重肿胀和后弹力层皱褶所引起的角膜内皮细胞丢失，从而在较长时间的培养过程中更好地保存了内皮细胞层的整体完整性。随后完成全层角膜打孔，并将分割角膜片从剩余的眼球上取下进行培养。通过光学显微镜在制备后不同时间点（即第1、8、15天）评估内皮细胞密度。该制备技术通过减少基质组织的肿胀，实现了对内皮细胞层更佳的保存效果，使得分割角膜片中内皮细胞密度的下降速率缓慢且呈线性，与人类供体角膜的变化趋势相似。由于这一标准化的类器官培养研究模型首次实现了至少两周的稳定培养，因此在未来针对各种外界因素对角膜内皮影响的研究中，可作为人类供体角膜的一种有价值的替代方案。
引言
角膜移植手术是全球最常开展的移植手术之一1。由于人类供体角膜严重短缺，针对人角膜内皮细胞的实验研究难以开展1。然而，在临床应用之前，对灌注液及其他眼内使用物质、眼科粘弹性材料、手术器械和技术（如超声乳化设备与技术、超声能量）对角膜内皮的影响，必须进行有效且广泛的评估。
目前用于研究的人类供体角膜替代品极少。动物研究模型虽然非常有价值，但同时耗费大量资源，且在伦理上正受到越来越多的质疑。体外细胞培养的主要缺点在于其向人眼的转化能力有限。由于细胞可能发生上皮-间质转化（EMT），导致细胞极性丧失以及细胞形态和基因表达的改变，形成类似成纤维细胞的形态，因此从细胞培养中获得的结果可能与体内实际情况不一致2。
既往报道的离体模型培养时间最长仅为120小时，而最近新建立了一种猪角膜内皮器官培养模型，通过将新鲜猪角膜培养至少15天，实现了更长时间的体外维持3,4,5,6。若在培养前去除角膜上皮及部分基质层（总计约300 µm），可减少角膜瓣基质的肿胀，从而降低内皮细胞丢失，并在培养长达15天后仍保持完整的内皮细胞层；相比之下，未切割的角膜瓣由于基质层不均匀肿胀及后弹力层皱褶的形成，导致显著的内皮细胞丢失。眼库通常在角膜移植前使用右旋糖酐等渗透性脱水剂以减轻角膜肿胀，然而研究表明这些试剂反而会加剧内皮细胞的丢失7,8,9。
本文旨在通过详细的分步操作流程，展示这一标准化的离体研究模型，以帮助未来的研究人员利用分割的角膜圆片开展角膜内皮相关研究。该模型提供了一种简便的方法，用于检测眼内应用的物质和技术，例如眼用粘弹剂、灌注液、超声能量，或其他涉及角膜内皮的研究操作。
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方案
本方案遵循本机构的伦理准则。根据本机构伦理审查委员会的规定，由于所有猪角膜均取自当地屠宰场，因此在实验前无需获得伦理批准。
1. 器官培养
- 准备猪眼。
- 从当地屠宰场获取死后不久但尚未经过热处理即被摘除的猪眼。将眼睛运送到实验室，并在数小时内进行处理。运输过程中，将眼睛置于室温（约 21 °C）下保存，直至处理。
- 使用眼科剪和细镊在消毒前去除所有眶附属组织（眼外肌、结膜、脂肪组织）。分离并弃用有明显创伤、外部损伤（如刀割伤）或可见角膜混浊的眼睛。
- 在无菌杯中配制 5% 碘-PBS 溶液（1:20），方法是将 3 mL 的 7.5% 聚维酮碘加入 57 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。另准备一个无菌杯，装入 60 mL 纯 PBS。
注意：所用碘-PBS 溶液的总体积及杯子的大小取决于待分离角膜的数量。5 至 6 只眼睛约需 60 mL 的 5% 碘-PBS 溶液以确保充分消毒。 - 将 5 至 6 只眼睛放入 5% 碘-PBS 溶液中，共浸泡 5 分钟，以彻底消毒眼球表面。每隔 1 分钟轻轻搅拌一次，确保眼球表面完全浸没并充分接触碘溶液完成消毒。
- 5 分钟后，将已消毒的眼睛转移至盛有纯 PBS 的预备杯中。再次轻轻搅拌，确保眼球表面的碘-PBS 溶液被彻底冲洗干净。
注意：此步骤应在洁净工作台上操作，以防止已消毒的眼睛受到污染。
- 准备细胞培养板。
注意：以下所有步骤均应在具有持续层流空气的洁净工作台上进行。- 解冻 2 mL 胎牛血清（FCS）。使用钝头套管将 FCS 吸入一支 5 mL 注射器中，然后通过 0.22 µm 滤器将血清排入 80 mL 无葡聚糖培养基 I（最低必需培养基 [MEM] 含 Earle's 盐、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺 [200 mM]、两性霉素 B [250 µg/mL]、HEPES 缓冲液 [1 M] [50x]、NaHCO3 和蒸馏水）中，以防止可能的细菌污染。轻轻振荡混合液，确保底物均匀分布。
- 向 12 孔细胞培养板的每个孔中加入 3 mL 上述底物混合液。
- 进行解剖与孵育。
注意：此步骤应在洁净工作台上操作。操作过程中切勿让任何器械接触角膜内皮。- 将一只眼睛从 PBS 杯中取出，放入眼球固定器中，使角膜朝上，并置于眼科手术显微镜下。使用装有 0.9% NaCl 的注射器，通过眼球固定器对眼球施加轻微吸力，以固定眼球位置，便于解剖。
- 使用带有标准内衬的角膜环钻（ø 7.5 mm），确保切割深度不超过 300 µm，于中央角膜表面进行浅层切割（图 1A）。
- 使用细镊和一次性三角刀片，在基质层水平方向切割并移除部分已被环钻切割的角膜组织。弃去分离出的角膜部分，该部分包含角膜上皮层、前弹力层及部分基质层。
注意：必须严格保持水平切割方向，以确保剩余基质层厚度均匀。 - 在基质层浅表处缝合一针 10-0 缝线（10-0 聚酰胺 6），以便在后续实验中区分内皮面与基质面（图 1B）。操作时避免穿透角膜内皮。若内皮被穿透，则弃用该眼球。
注意：若缝针穿透角膜内皮，前房液体将通过缝线通道渗出，可明显观察到。 - 取下内衬后，使用无内衬的环钻继续加深切割，直至完全穿透角膜到达前房（图 1C）。当角膜完全穿透时，可明显感觉到阻力骤降，并有液体从前房渗出。
注意：若环钻切割后角膜瓣仍有一侧相连，可使用角膜刀（hockey knife）将其完全分离。 - 将获得的角膜瓣（现包含部分基质层（图 2）、后弹力层和角膜内皮）转移至培养基（培养基 I + FCS，见第 1.2 节）中，放入 12 孔细胞培养板，标记侧朝下，使角膜内皮面朝上。
注意：若内皮面朝下，可能导致内皮损伤。 - 为每一片角膜瓣分配独立编号，以便后续追踪，并相应标记细胞培养板上的孔位。
- 将装有样本的细胞培养板置于培养箱中，在标准条件下孵育：温度 37 °C、5% CO2、相对湿度 95%。若孵育时间超过 7 天，则在第 8 天更换培养基（培养基 I + FCS）。
注意：使用分割角膜瓣的孵育程序已验证可用于最长 15 天。
图1：猪角膜的解剖以获得分层角膜瓣。（A）使用环钻仪配合嵌入式刀模在角膜上切割至300 µm深度，并去除上皮层及部分基质组织后，（B）在基质层浅层置入缝线，且不穿透角膜内皮层，以便后续识别基质侧。（C）对剩余角膜进行完全环钻切割，随后（D）将获得的分层角膜瓣从眼球上取下。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 内皮细胞的显微镜观察与检查
- 进行未染色检查。
注意：未染色检查可重复进行多次（例如在第1、8和15天的每周随访时）。然而，未染色计数仅可用于评估内皮细胞密度，无法评估形态学参数。- 在12孔细胞培养板的每个孔中加入3 mL低渗平衡盐溶液（hBSS，其成分见材料表）。将单个分割的角膜片小心地放入hBSS中，以诱导角膜内皮细胞肿胀，从而提高细胞可见性，便于细胞计数。
注意：确保内皮面朝向显微镜方向。若使用倒置相差显微镜，则内皮面需朝下。实验过程中应避免移动培养板，以防损伤内皮细胞。 - 让细胞在溶液中肿胀1–2分钟后，使用显微镜连接的相机拍摄内皮图像。至少拍摄三个不同区域的三张图像，以获得角膜内皮实际状态的代表性视图。添加真实比例长度为100 µm的比例尺，用于后续分析角膜内皮细胞密度及形态学参数。
- 为防止渗透压损伤，分割的角膜片在hBSS中停留时间不得超过5分钟，之后应将其从溶液中取出并放回培养基中3。
- 在12孔细胞培养板的每个孔中加入3 mL低渗平衡盐溶液（hBSS，其成分见材料表）。将单个分割的角膜片小心地放入hBSS中，以诱导角膜内皮细胞肿胀，从而提高细胞可见性，便于细胞计数。
- 进行染色检查。
注意：由于所用染色剂具有细胞毒性，染色会终止实验。因此，染色仅可在观察期结束时进行，用于评估形态学参数（如重排图形、玫瑰花结样结构、茜素红染色细胞）。- 为染色步骤配制0.25%台盼蓝溶液和0.2%茜素红S溶液。
- 配制0.25%台盼蓝溶液时，将0.4%台盼蓝溶液用0.9% NaCl溶液稀释。
注意：例如，要配制20 mL的0.25%台盼蓝溶液，可将12.5 mL的0.4%台盼蓝溶液与7.5 mL的0.9% NaCl溶液混合。台盼蓝溶液可在室温下保存数周至数月。 - 配制0.2%茜素红S溶液时，将100 mg茜素红S粉末溶于50 mL 0.9% NaCl溶液中，在带加热功能的磁力搅拌器上持续搅拌并加热至50 °C。为去除可能的沉淀物，需对所得溶液进行过滤。根据需要加入氢氧化钠或盐酸，将茜素红S溶液的pH值调节至4.2。
注意：每次使用茜素红S溶液前，必须确认其pH值已校正至4.2，且溶液中无沉淀物。该溶液可在室温下保存，但存放时间不得超过4周。
- 配制0.25%台盼蓝溶液时，将0.4%台盼蓝溶液用0.9% NaCl溶液稀释。
- 将分割的角膜片置于培养皿中，内皮面朝上，以便对内皮细胞进行染色。使用移液器缓慢逐滴加入0.25%台盼蓝溶液，持续90秒。
注意：台盼蓝可穿透膜受损的角膜细胞并染色其细胞核，从而识别受损细胞。 - 在小玻璃烧杯中用0.9% NaCl溶液轻轻冲洗分割的角膜片3次。再次使用移液器缓慢逐滴加入0.2%茜素红S溶液，持续90秒。
注意：茜素红S可染色后弹力膜，有助于在未受损的角膜内皮细胞中凸显细胞边界；当底层后弹力膜暴露时，可凸显已破坏的细胞。此外，还可便于识别较大的破坏区域。 - 对染色后的角膜内皮进行观察时，参照第2.1节中所述未染色计数的步骤进行操作。
- 为染色步骤配制0.25%台盼蓝溶液和0.2%茜素红S溶液。
3. 角膜内皮细胞密度及形态学参数的分析
- 使用图像编辑软件（材料表）在图片上投影计数方格。
- 打开软件，通过选择 文件 | 打开 | 选择 打开一张角膜内皮图像。
- 在图像上投影一个边长真实比例为 100 µm 的正方形。
注：如果查看软件允许将计数方格直接投影到图像上，则可忽略以下 3.1.2 节中的步骤。方格的边长取决于显微镜相机拍摄图像的分辨率，可通过比例尺计算得出。- 从显微镜拍摄的照片中裁剪出比例尺：在工具栏中选择 矩形选框工具 或按 M，然后框选比例尺，再选择 编辑 | 裁剪 或按 Ctrl + X。
- 点击 文件 | 新建（或按 Ctrl + N）。在弹出的窗口中，从 文档类型 下拉列表中选择 剪贴板。显示的像素数即为计数方格的边长。记录其他图片对应的像素值，然后点击 确定。
- 选择 文件 | 新建（或 Ctrl + N）。根据比例尺长度，在弹出的窗口中输入计数方格的宽度和长度（以像素为单位）。背景颜色选择 白色，然后点击 确定。
- 点击 选择 | 全选（或 Ctrl + A），然后选择 编辑 | 复制（或 Ctrl + C）。
- 选择在步骤 3.1.1 中打开的角膜内皮图像，选择 编辑 | 粘贴（或 Ctrl + V），将方格插入到角膜内皮照片中。
- 选择方格所在的图层并调整其透明度：选择 图层 | 图层样式 | 混合选项 | 将不透明度设置为 30% | 确定。
- 保存带有边长真实比例为 100 µm 的投影方格的图像。对分析所需的其他图片重复此操作。
- 评估内皮细胞密度及形态学参数。
- 在 ImageJ（版本 1.50i）中打开带有投影方格的图像，并使用 CellCounter 插件统计方格内的细胞数量。打开 ImageJ，选择 文件 | 打开（或 Ctrl + O） | 选择图像。
注：ImageJ 及 CellCounter 插件为可免费在线下载的开源软件。 - 选择 插件 | Cell_Counter | Cell Counter | 初始化。统计内皮细胞数量并记录结果。在方格的两条边上，统计被方格边缘截断的细胞；其余两条边上被截断的细胞不计入。
- 每只角膜至少分析六个不同区域的方格（例如三张图片，每张两个方格），计算每个方格（100 µm2）的平均角膜内皮细胞密度。通过乘以 100，将每 100 µm2 的内皮细胞密度外推为每 1 mm2 的细胞密度。
- 在 ImageJ（版本 1.50i）中打开带有投影方格的图像，并使用 CellCounter 插件统计方格内的细胞数量。打开 ImageJ，选择 文件 | 打开（或 Ctrl + O） | 选择图像。
- 为评估形态学变化，在投影方格内统计重构结构（≥4 个细胞/细胞边界交汇，而非通常的三个）、玫瑰花环样结构（特征性的玫瑰花状排列，五个或更多细胞呈放射状围绕一个已破坏的细胞）或茜素红染色区域（已破坏的细胞）。
注：作为替代方案，在保存良好的样本中，使用更大的方格（例如 200 × 200 µm2）进行形态学分析可能更有助于获得具有代表性的结果。
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结果
本研究所述的解剖技术涉及部分去除基质组织，从而获得更薄的角膜样本，进而减少基质肿胀（图1 和 图2）。基质肿胀减少可降低对角膜内皮产生不利影响的剪切力和夹捏力，因此导致内皮细胞丢失率更低6。与未分割的角膜纽扣片及完整的角膜巩膜样本相比，分割后的角膜纽扣片在培养15天后内皮细胞层的保存情况显著更优，表现为更少的内皮细胞丢失、更少的重排结构（≥4个细胞/细胞边界连接而非三个）、玫瑰花结样结构（五个或更多呈放射状排列的细胞在一点汇聚）以及茜素红染色（破坏）细胞数量减少6。
在15天期间内，分裂的角膜瓣显示出内皮细胞密度的持续下降，平均每周内皮细胞损失百分比为4.90%（n = 40，图3...
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讨论
本方案提供了一种制备猪角膜裂片的方法，该方法是一种标准化且低成本的离体角膜内皮器官培养模型，可用于科研目的6。猪角膜裂片表现出的内皮细胞密度下降程度与人供体角膜在眼库中培养两周期间所观察到的内皮细胞丢失相当6,10,11,12。
此前的研究已证明，与未分割的角膜圆片以及完整的猪角膜巩膜样本相比，分割角膜圆片具有优越性6。在该研究中，三组样本分别在第1、8和15天进行比较。所有组别（角膜巩膜圆片、未分割角膜圆片、分割角膜圆片）在第1天时角膜内皮均处于良好状态，表现为内皮细胞层保存完好6。然而，由于基质肿胀，Descemet膜发生皱褶，导致完整角膜巩膜样本的大片内皮被破坏，因此无法在第8天和...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究所提出的研究模型的建立得到了德国联邦教育与研究部KMU-innovativ项目（资助编号：13GW0037F）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>主题 | |||
| 猪眼 | 当地屠宰场 | ||
| <强>物质 | |||
| 茜素红 S | Sigma-Aldrich，美国 | ||
| 培养基1，#F9016 | Biochrom GmbH，德国 | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco，美国 | ||
| 胎牛血清 | Biochrom GmbH，德国 | ||
| 盐酸（HCl）溶液 | 自主生产 | ||
| 低渗平衡盐溶液 | 自主生产 | 每升 H2O：NaCl 4.9 g；KCl 0.75 g；CaCl x H2O 0.49 g；MgCl2 x H2O 0.3 g；乙酸钠 × 3 H2O 3.9 g；柠檬酸钠 × 2 H2O 1.7 g | |
| 聚维酮碘 7.5%，Braunol | 德国 B. Braun Melsungen AG | ||
| 0.9% 氯化钠 (NaCl) | 德国 B. Braun Melsungen AG | ||
| 氢氧化钠（NaOH）溶液 | 自主生产 | ||
| 0.4% 台盼蓝 | Sigma-Aldrich，美国 | ||
| <强>材料 &和仪器 | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH，德国 | ||
| 50 mL 玻璃烧杯 | 德国肖特公司 | ||
| 钝端套管（含滤器）（5 µm) 18G | Becton Dickinson，美国 | ||
| 细胞培养板（12孔） | 康宁公司，美国 | ||
| Colibri 镊子 | Geuder AG，德国 | ||
| 角膜剪 | Geuder AG，德国 | ||
| Eppendorf 移液器 | 德国 Eppendorf AG | ||
| 眼球固定器 | L. Klein，德国 | ||
| 眼科剪 | Geuder AG，德国 | ||
| 折叠滤膜 ø 185 mm | Whatman，美国 | ||
| 曲棍球刀 | Geuder AG，德国 | ||
| 100 mL 带盖实验室玻璃瓶 | 德国肖特公司 | ||
| 磁力搅拌子 | 卡尔·罗斯有限责任公司 & Co. KG，德国 | ||
| MillexGV 滤器（5 µm) | 默克密理博有限公司，美国 | ||
| 持针器 | Geuder AG，德国 | ||
| 培养皿 | VWR International，美国 | ||
| 移液器吸头 | Sarstedt AG & Co., 德国 | ||
| 手术刀（一次性），三角形刀片 | Aesculap AG & Co. KG，德国 | ||
| 10 mL 血清移液管 | Sarstedt AG & Co., 德国 | ||
| 5 mL 血清移液管 | Sarstedt AG & Co.，德国 | ||
| 无菌杯 | Greiner Bio-One Ö奥地利 | ||
| 无菌手套 | Paul Hartmann AG，德国 | ||
| 无菌手术巾 | Paul Hartmann AG，德国 | ||
| 缝合剪刀 | Geuder AG，德国 | ||
| 缝线 Ethilon 10-0 聚酰胺 6 | 美国强生公司 | ||
| 注射器（5 mL） | Becton Dickinson，美国 | ||
| 环钻 ø 7.5 mm | 自主生产 | ||
| 持针器 | Geuder AG，德国 | ||
| 称量纸 | neoLab Migge GmbH，德国 | ||
| <强>仪器设备 &和软件 | |||
| 双目手术显微镜 | 卡尔·蔡司股份公司，德国 | ||
| 显微镜上安装的相机 | 日本 Olympus | ||
| CellSens Entry（软件） | 日本 Olympus | ||
| 冷光源 | 德国肖特公司 | ||
| 培养箱 | 贺利氏有限公司，德国 | ||
| 倒置相差显微镜 | 德国 Olympus 公司 | ||
| 带加热功能的磁力搅拌器 | IKA-Werke GmbH & Co. KG，德国 | ||
| pH计 pHenomenal | VWR International，美国 | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems，美国 | ||
| 精密天平 | Ohaus Europe GmbH，瑞士 |
参考文献
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