本文介绍了一种猪角膜瓣的制备与培养的逐步操作方案。由于该类器官型培养的器官培养模型在15天内的细胞死亡率与人供体角膜相当，因此成为首个无需添加有毒右旋糖酐即可实现非人角膜长期培养的模型。
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本文内容
摘要
摘要
角膜内皮细胞的实验研究面临诸多困难。人类供体角膜资源稀缺，通常需用于移植手术，极少可用于实验研究。内皮细胞培养往往难以真实反映体内情况。由于非人类角膜的生物结构特性，在培养过程中基质层容易发生显著肿胀，导致大量角膜内皮细胞丢失，使得长期培养难以实现。为对抗这一现象，常使用右旋糖酐等脱水剂。然而，这些试剂同样会引起明显的内皮细胞丢失。因此，本研究建立了一种无需使用脱水剂的离体器官培养模型。采用当地屠宰场提供的猪眼制备分割角膜片。在部分角膜打孔后，去除角膜的外层结构（包括上皮层、鲍曼层及部分基质层）。该操作显著减少了因基质层严重肿胀和后弹力层皱褶所引起的角膜内皮细胞丢失，从而在较长时间的培养过程中更好地保存了内皮细胞层的整体完整性。随后完成全层角膜打孔，并将分割角膜片从剩余的眼球上取下进行培养。通过光学显微镜在制备后不同时间点（即第1、8、15天）评估内皮细胞密度。该制备技术通过减少基质组织的肿胀，实现了对内皮细胞层更佳的保存效果，使得分割角膜片中内皮细胞密度的下降速率缓慢且呈线性，与人类供体角膜的变化趋势相似。由于这一标准化的类器官培养研究模型首次实现了至少两周的稳定培养，因此在未来针对各种外界因素对角膜内皮影响的研究中，可作为人类供体角膜的一种有价值的替代方案。
引言
角膜移植手术是全球最常开展的移植手术之一1。由于人类供体角膜严重短缺，针对人角膜内皮细胞的实验研究难以开展1。然而，在临床应用之前，对灌注液及其他眼内使用物质、眼科粘弹性材料、手术器械和技术（如超声乳化设备与技术、超声能量）对角膜内皮的影响，必须进行有效且广泛的评估。
目前用于研究的人类供体角膜替代品极少。动物研究模型虽然非常有价值，但同时耗费大量资源，且在伦理上正受到越来越多的质疑。体外细胞培养的主要缺点在于其向人眼的转化能力有限。由于细胞可能发生上皮-间质转化（EMT），导致细胞极性丧失以及细胞形态和基因表达的改变，形成类似成纤维细胞的形态，因此从细胞培养中获得的结果可能与体内实际情况不一致2。
既往报道的离体模型培养时间最长仅为120小时，而最近新建立了一种猪角膜内皮器官培养模型，通过将新鲜猪角膜培养至少15天，实现了更长时间的体外维持3,4,5,6。若在培养前去除角膜上皮及部分基质层（总计约300 µm），可减少角膜瓣....
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方案
本方案遵循本机构的伦理准则。根据本机构伦理审查委员会的规定，由于所有猪角膜均取自当地屠宰场，因此在实验前无需获得伦理批准。
1. 器官培养
- 准备猪眼。
- 从当地屠宰场获取死后不久但尚未经过热处理即被摘除的猪眼。将眼睛运送到实验室，并在数小时内进行处理。运输过程中，将眼睛置于室温（约 21 °C）下保存，直至处理。
- 使用眼科剪和细镊在消毒前去除所有眶附属组织（眼外肌、结膜、脂肪组织）。分离并弃用有明显创伤、外部损伤（如刀割伤）或可见角膜混浊的眼睛。
- 在无菌杯中配制 5% 碘-PBS 溶液（1:20），方法是将 3 mL 的 7.5% 聚维酮碘加入 57 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。另准备一个无菌杯，装入 60 mL 纯 PBS。
注意：所用碘-PBS 溶液的总体积及杯子的大小取决于待分离角膜的数量。5 至 6 只眼睛约需 60 mL 的 5% 碘-PBS 溶液以确保充分消毒。 - 将 5 至 6 只眼睛放入 5% 碘-PBS 溶液中，共浸泡 5 分钟，以彻底消毒眼球表面。每隔 1 分钟轻轻搅拌一次，确保眼球表面完全浸没并充分接触碘溶液完成消毒。
- 5 分钟后，将已消毒的眼睛转移至盛有纯 PBS 的预备杯中。再次轻轻搅拌，确保眼球表面的碘-PBS 溶液被彻底冲洗干净。
注意：此步骤应在洁净工作台上操作，以防止已消毒的眼睛受到污....
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结果
本研究所述的解剖技术涉及部分去除基质组织，从而获得更薄的角膜样本，进而减少基质肿胀（图1 和 图2）。基质肿胀减少可降低对角膜内皮产生不利影响的剪切力和夹捏力，因此导致内皮细胞丢失率更低6。与未分割的角膜纽扣片及完整的角膜巩膜样本相比，分割后的角膜纽扣片在培养15天后内皮细胞层的保存情况显著更优，表现为更少的内皮细胞丢失、更少的重排结构（≥4个细胞/细胞边界连接而非三个）、玫瑰花结样结构（五个或更多呈放射状排列的细胞在一点汇聚）以及茜素红染色（破坏）细胞数量减少6。
在15天期间内，分裂的角膜瓣显示出内皮细胞密度的持续下降，平均每周内皮细胞损失百分比为4.90%（n = 40，图3.......
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讨论
本方案提供了一种制备猪角膜裂片的方法，该方法是一种标准化且低成本的离体角膜内皮器官培养模型，可用于科研目的6。猪角膜裂片表现出的内皮细胞密度下降程度与人供体角膜在眼库中培养两周期间所观察到的内皮细胞丢失相当6,10,11,12。
此前的研究已证明，与未分割的角膜圆片以及完整的猪角膜巩膜样本相比，分割角膜圆片具有优越性6。在该研究中，三组样本分别在第1、8和15天进行比较。所有组别（角膜巩膜圆片、未分割角膜圆片、分割角膜圆片）在第1天时角膜内皮均处于良好状态，表现为内皮细胞层保存完好6。然而，由于基质肿胀，Descemet膜发生皱褶，导致完整角膜巩膜样本的大片内皮被破坏，因此无法在第8天和.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究所提出的研究模型的建立得到了德国联邦教育与研究部KMU-innovativ项目（资助编号：13GW0037F）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>主题 | |||
| 猪眼 | 当地屠宰场 | ||
| <强>物质 | |||
| 茜素红 S | Sigma-Aldrich，美国 | ||
| 培养基1，#F9016 | Biochrom GmbH，德国 | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco，美国 | ||
| 胎牛血清 | Biochrom GmbH，德国 | ||
| 盐酸（HCl）溶液 | 自主生产 | ||
| 低渗平衡盐溶液 | 自主生产 | 每升 H2O：NaCl 4.9 g；KCl 0.75 g；CaCl x H2O 0.49 g；MgCl2 x H2O 0.3 g；乙酸钠 × 3 H2O 3.9 g；柠檬酸钠 × 2 H2O 1.7 g | |
| 聚维酮碘 7.5%，Braunol | 德国 B. Braun Melsungen AG | ||
| 0.9% 氯化钠 (NaCl) | 德国 B. Braun Melsungen AG | ||
| 氢氧化钠（NaOH）溶液 | 自主生产 | ||
| 0.4% 台盼蓝 | Sigma-Aldrich，美国 | ||
| <强>材料 &和仪器 | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH，德国 | ||
| 50 mL 玻璃烧杯 | 德国肖特公司 | ||
| 钝端套管（含滤器）（5 µm) 18G | Becton Dickinson，美国 | ||
| 细胞培养板（12孔） | 康宁公司，美国 | ||
| Colibri 镊子 | Geuder AG，德国 | ||
| 角膜剪 | Geuder AG，德国 | ||
| Eppendorf 移液器 | 德国 Eppendorf AG | ||
| 眼球固定器 | L. Klein，德国 | ||
| 眼科剪 | Geuder AG，德国 | ||
| 折叠滤膜 ø 185 mm | Whatman，美国 | ||
| 曲棍球刀 | Geuder AG，德国 | ||
| 100 mL 带盖实验室玻璃瓶 | 德国肖特公司 | ||
| 磁力搅拌子 | 卡尔·罗斯有限责任公司 & Co. KG，德国 | ||
| MillexGV 滤器（5 µm) | 默克密理博有限公司，美国 | ||
| 持针器 | Geuder AG，德国 | ||
| 培养皿 | VWR International，美国 | ||
| 移液器吸头 | Sarstedt AG & Co., 德国 | ||
| 手术刀（一次性），三角形刀片 | Aesculap AG & Co. KG，德国 | ||
| 10 mL 血清移液管 | Sarstedt AG & Co., 德国 | ||
| 5 mL 血清移液管 | Sarstedt AG & Co.，德国 | ||
| 无菌杯 | Greiner Bio-One Ö奥地利 | ||
| 无菌手套 | Paul Hartmann AG，德国 | ||
| 无菌手术巾 | Paul Hartmann AG，德国 | ||
| 缝合剪刀 | Geuder AG，德国 | ||
| 缝线 Ethilon 10-0 聚酰胺 6 | 美国强生公司 | ||
| 注射器（5 mL） | Becton Dickinson，美国 | ||
| 环钻 ø 7.5 mm | 自主生产 | ||
| 持针器 | Geuder AG，德国 | ||
| 称量纸 | neoLab Migge GmbH，德国 | ||
| <强>仪器设备 &和软件 | |||
| 双目手术显微镜 | 卡尔·蔡司股份公司，德国 | ||
| 显微镜上安装的相机 | 日本 Olympus | ||
| CellSens Entry（软件） | 日本 Olympus | ||
| 冷光源 | 德国肖特公司 | ||
| 培养箱 | 贺利氏有限公司，德国 | ||
| 倒置相差显微镜 | 德国 Olympus 公司 | ||
| 带加热功能的磁力搅拌器 | IKA-Werke GmbH & Co. KG，德国 | ||
| pH计 pHenomenal | VWR International，美国 | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems，美国 | ||
| 精密天平 | Ohaus Europe GmbH，瑞士 |
参考文献
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. I....
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