原位监测细菌、酵母和人类细胞中瞬时形成的分子伴侣复合物

摘要

同源J结构域蛋白与Hsp70分子伴侣协同作用，参与从蛋白质折叠到降解等多种生物学过程。本文介绍了一种原位邻近连接实验方法，可用于在细菌、酵母和人类细胞中监测这些短暂形成的分子伴侣复合物。

摘要

J结构域蛋白（JDP）是真核细胞中最大且最多样化的一类共伴侣蛋白家族。最近的研究发现，JDP家族中的特定成员可在真核生物中形成瞬时异源复合物，从而精细调控70 kDa热休克蛋白（Hsp70）伴侣介导的蛋白去聚集酶对底物的选择。这些JDP复合物可靶向急性或慢性应激诱导形成的蛋白聚集体，并可能通过招募多个Hsp70至蛋白聚集体表面，协助去聚集酶的组装。然而，这些物理相互作用的JDP所形成的蛋白质质量控制（PQC）网络在体内的范围仍 largely未被表征。本文中，我们描述了一种基于显微镜的原位蛋白质相互作用检测方法，称为邻近连接检测法（proximity ligation assay, PLA），该方法能够稳健地捕获在真核细胞不同亚细胞区域中瞬时形成的伴侣蛋白复合物。 我们的研究将PLA的应用范围从人类细胞拓展至酵母（Saccharomyces cerevisiae）和细菌（Escherichia coli），从而提供了一种重要的工具，用于监测原核和真核细胞中瞬时形成的蛋白质组装体的动态变化。

引言

由于我们对细胞相互作用组的理解尚不完整，大量基因组信息仍无法解读。传统的蛋白质-蛋白质相互作用检测方法，如蛋白质共免疫沉淀（无论是否结合化学交联）以及蛋白质共定位，尽管被广泛使用，但仍存在一系列缺点。其中一些主要缺点包括对相互作用的定量能力较差，以及可能引入非天然的结合事件。  相比之下，新兴的基于邻近性的技术为捕获细胞内蛋白质相互作用提供了另一种强大而有效的途径。邻近连接实验（proximity ligation assay, PLA）¹目前已作为专有试剂盒提供，其利用 抗体特异性地识别相互作用亚基之间空间邻近的蛋白质复合物。

PLA 由以下步骤启动：  由初级和次级抗体与小段DNA标签（PLA探针）在靶向蛋白质复合物表面形成的支架结构（图1，步骤1-3）。接下来，根据DNA标签的邻近性，通过与连接寡核苷酸杂交生成环状DNA分子（图1，步骤4）。环状DNA的形成通过DNA连接步骤完成。新形成的环状DNA片段可作为后续反应的模板 基于与抗体支架相连的共价结合寡核苷酸标签引物的滚环扩增（rolling circle amplification, RCA）聚合酶链式反应（PCR），生成一条通过抗体支架与蛋白质复合物相连的单链串联重复DNA分子

方案

1. HeLa 细胞准备

1. 准备以下材料：PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，1.8 mM KH₂PO₄)，pH 7.4；含10% FCS和1%青霉素-链霉素的DMEM；PBS中含4%多聚甲醛；PBS中含0.5% Triton-X100；TBS-T（150 mM NaCl，20 mM Tris，0.05% Tween），pH 7.4；0.0001%无菌聚-L-赖氨酸溶液；10孔诊断用载玻片；湿盒；滤纸；以及Coplin染色缸。
   注意： 为确保最佳固定效率，每次实验前应新鲜配制多聚甲醛溶液。
2. 用湿纸巾铺满密闭盒子的底部，制备一个湿化室。实验开始前将湿化室置于37 °C环境中，以确保酶促反应孵育期间湿化室温度保持在37 °C。
3. 在T25培养瓶中培养HeLa细胞，加入5 mL DMEM（高糖、含谷氨酰胺和丙酮酸钠）培养基，添加10% FCS和1%青霉素-链霉素，置于37 °C CO₂培养箱中培养。₂ 含5% CO₂的培养箱₂使用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化贴壁细胞。细胞解离后加入新鲜DMEM，用细胞计数板计数细胞，并接种于湿盒内的诊断玻片上进行培养。
4. 在无菌细胞培养罩中通过紫外线照射对诊断载玻片进行30分钟灭菌处理。
....

结果

我们先前利用纯化蛋白进行的体外研究表明，一部分人类A类和B类JDP能够形成瞬时的混合型JDP复合物，从而高效靶向多种聚集蛋白，并可能促进基于Hsp70的蛋白去聚集酶的组装⁷。我们采用邻近连接实验（PLA）检测混合型（A+B）JDP复合物是否存在于人宫颈癌细胞（HeLa）中。针对人类JDP蛋白DNAJA2（A类）和DNAJB1（B类），使用了高度特异性的初级抗体及相应的PLA次级探针（图2A-C）。红色荧光点的出现表明，在HeLa细胞中存在DNAJA2与DNAJB1组成的混合型复合物（图2C），该结果验证了我们此前的生化研究发现⁷。每个荧光点代表HeLa细胞胞质/细胞核中发生的一次独立蛋白质相互作用事件。

先前通过荧光共振能量转移（FRET）获得的生化结果表明，由于FRET可通过检测连接于一种蛋白质的激发态供体荧光团向连接于第二种蛋白质的.......

讨论

基于免疫共沉淀和共定位的方法长期以来被用于表征蛋白质复合物。然而，利用这些传统方法检测瞬时形成的特异性分子伴侣复合物仍面临重大挑战，因此以往的研究结果在很大程度上局限于定性分析。  解释。基于细胞裂解的免疫共沉淀技术通常需要交联以稳定蛋白质-蛋白质相互作用。 细胞裂解会增加破坏瞬时形成的分子伴侣复合物的风险，而交联可能引入非天然的相互作用，尤其是由于大多数分子伴侣本身具有“黏性”所致。在利用共免疫沉淀分析Hsp70分子伴侣系统时，可能出现的假象包括 源于（a）分子伴侣的高表达水平和（b） 溶解度 与膜或蛋白质聚集体相关的问题 结合的分子伴侣复合物。此外，基于免疫共沉淀的技术无法提供被捕获蛋白质复合物的细胞定位信息，而这些信息对于阐明其相关功能可能至关重要。使用免疫共沉淀技术的缺点在基于共定位的方法中有所减少，后者能够保持 蛋白质定位信息。然而，两种或多种蛋白质的共定位可能表明蛋白质之间存在直接相互作用，也可能仅反映这些蛋白质被分配到细胞中的同一微区。因此，共定位分析在预测蛋白质相互作用方面最多仅具有推测性，且无法提供任何接近程度的量化信息。由于该技术对靶标蛋白质的检测.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
37% 甲醛	Merck	103999
丙酮	Sigma-Aldrich	32201
抗 DNAJA2 抗体	Abcam	ab157216
抗 DNAJB1 抗体	Enzo Life Sciences	ADI-SPA-450
抗 DnaK 抗体	本实验室制备
抗 mCherry 抗体	Abcam	ab125096
抗 Sis1 抗体	Cosmo Bio Corp	COP-080051
抗 Ydj1 抗体	StressMarq Biosciences	SMC-150,
抗 YFP 抗体	本实验室制备
Coplin 染色缸	Sigma-Aldrich	S5516
诊断用载玻片	Marienfeld	1216530
DMEM 培养基	Thermo-Fischer	31966021
DuoLink 原位检测试剂（橙色）	Sigma-Aldrich	DUO92007
DuoLink 原位封片介质 + DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040
DuoLink 原位 PLA 探针 抗小鼠 MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
DuoLink 原位 PLA 探针 抗兔 PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
DuoLink 原位洗涤缓冲液（荧光用）	Sigma-Aldrich	DUO82049
胎牛血清	Thermo-Fischer	10082147
溶菌酶	Sigma-Aldrich	62971
甲醇	Sigma-Aldrich	32213
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
青霉素/链霉素	Thermo-Fischer	15070063
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P47-07
山梨醇	Sigma-Aldrich	S7547
吐温-X100	Merck	108643
胰蛋白酶	Thermo-Fischer	25300096
吐温-20	Sigma-Aldrich	P1379
Zymolase 100T / / 溶壁酶	United States Biological	Z1004