通过物理性各向同性膨胀实现人体组织切片的纳米级成像

摘要

对临床组织样本进行纳米级成像有助于加深对疾病发病机制的理解。扩展病理学（ExPath）是扩展显微技术（ExM）的一种改进版本，经过优化可兼容常规临床组织样本，从而利用传统的衍射受限显微镜研究生物分子的纳米级空间排布。

摘要

在现代病理学中，光学显微镜通过揭示临床标本的微观结构，在疾病诊断中发挥着重要作用。然而，由于基本的物理衍射极限，使用传统的光学成像方法难以观察纳米尺度的组织结构和细微的病理变化。本文介绍一种简单且低成本的方案，称为扩展病理学（ExPath），可用于对常见类型的临床原代组织标本进行纳米级光学成像，包括固定冷冻组织切片和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片。该方法通过将组织样本化学转化为组织-水凝胶杂化物，并在纯水中实现多尺度的各向同性物理扩展，从而克服光学衍射极限。由于组织的扩展，原本无法分辨的分子得以分离，因此可以使用常规光学显微镜进行观察。

引言

在三维（3D）环境中研究组织的分子结构，有助于深入理解生物学功能及疾病的发生发展。然而，这些纳米级结构超出了传统衍射受限显微镜（200−300 nm）的分辨能力，其中最小可分辨距离 d 由公式 d α λ/NA 定义。此处 λ 为光的波长，NA 为成像系统的数值孔径（NA）。近年来，随着新型超分辨率成像技术的发展，荧光标记分子的直接可视化已成为可能^1,2,3，这些技术包括受激辐射损耗显微技术（STED）、光激活定位显微技术（PALM）、随机光学重建显微技术（STORM）以及结构光照明显微技术（SIM）。尽管这些成像技术极大地推动了人们对纳米尺度生物学功能的理解，但在实际应用中，它们往往依赖昂贵和/或专用的设备以及复杂的图像处理步骤，成像速度通常较传统光学成像更慢，并且需要具有特定性质的荧光染料（如具备光开关能力或高光稳定性）。此外，在组织样本上实现三维超分辨率成像仍面临诸多挑战。

膨胀显微技术（Expansion microscopy，ExM）于2015年首次提出⁴，通过将固定后的样本嵌入可膨胀的聚电解质水凝胶中并进行物理膨胀，从而实现对纳米级结构（<70 nm）成像的一种替代方法。在此技术中，关键的生物分子和/或标记物被原位锚定在聚合物网络中，经过化学处理后可实现各向同性的膨胀。由于物理膨胀提高了整体有效分辨率，因此可以利用传统的衍射极限成像系统分辨目标分子。自最初报道该方法以来，当时使用的是定制合成的荧光标记物锚定至聚合物网络⁴，后续已发展出多种新策略，包括直接将蛋白质（蛋白质保留型ExM，proExM）^5,6,7,8,9 和RNA^9,10,11,12 锚定到水凝胶中，并通过迭代膨胀¹³ 或优化凝胶化学组成^8,14,15 来进一步提高物理放大倍数。

本文介绍了一种经过改进的 proExM 方法，称为扩展病理学（expansion pathology, ExPath）¹⁶，该方法已针对临床病理学样本格式进行了优化。本实验方案可将临床样本（包括福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本、苏木精-伊红（H&E）染色样本以及贴附于玻璃载玻片上的新鲜冷冻人组织样本）转化为适用于扩展显微技术（ExM）的形态。随后将蛋白质锚定于水凝胶中，并进行机械均质化处理（图1）¹⁶。通过对样本实现4倍的线性扩展，即使使用分辨率仅为~300 nm的传统共聚焦显微镜，也可获得多色超分辨率（~70 nm）图像，并且该方法还可与其他超分辨率成像技术联用。

方案

1. 储存试剂和溶液的制备

1. 准备凝胶溶液组分。
   注意：溶液浓度以 g/mL（w/v 百分比）表示。
   1. 配制以下储存液：38% (w/v) 丙烯酸钠 (SA)、50% (w/v) 丙烯酰胺 (AA)、2% (w/v) N,N′-亚甲基双丙烯酰胺 (Bis) 和 29.2% (w/v) 氯化钠 (NaCl)。将各化合物溶解于双蒸去离子水 (ddH₂O) 中。以表1中的用量为参考；所配制的溶液可根据需要按比例放大或缩小体积。例如，配制 10 mL 的 38% (w/v) SA 溶液时，将 1.9 g SA 加入 10 mL 刻度量筒中，并加入 ddH₂O 至 5 mL 体积。
   2. 按照表1所示，配制 9.4 mL 单体溶液，浓度为 1.06x。
      注意：加入引发剂、加速剂和抑制剂后，最终浓度将为 1x。单体储存液可在 4 °C 保存最多 3 个月，或在 -20 °C 长期保存。
   3. 分别在 ddH₂O 中配制以下储存液：0.5% (w/v) 抑制剂 4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基 (4HT)，该抑制剂可抑制凝胶化，从而促进凝胶溶液在组织中的扩散；10% (v/v) 引发剂四甲基乙二胺 (TEMED)，可加速过硫酸铵 (APS) 产生的自由基生成；以及 10% (w/v) APS，用于启动凝胶化过程。
      注意：4HT 和 TEMED 的储存液可分装为 1 mL 等份，在 -20 °C 保存至少 6 个月。APS 经长期储存后活性会下降，建议在凝胶前立即以小量 (<0.1 mL) 新鲜配制。
2. 通过混合以下组分配制消化缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，25 mM EDTA，0.5% [w/v] 非离子型表面活性剂，0.8 M NaCl）：25 mL 1 M Tris pH 8（将 3.03 g Tris 碱溶于 25 mL ddH₂O 中）、25 mL EDTA（0.5 M pH 8）、2.25 g 非离子型表面活性剂和 23.38 g NaCl，最后用 ddH₂O 定容至 500 mL。
   注意：可根据需要调整溶液体积，并在 4 °C 保存。蛋白酶 K (ProK) 应在消化步骤前立即加入。
3. 将 2.941 g 三水合柠檬酸钠二水合物溶于 500 mL ddH₂O 中，室温 (RT) 下调节 pH 至 8.0，配制成 20 mM 柠檬酸钠溶液。根据需要调整储存液体积。
4. 配制锚定化合物 6-((丙烯酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯（丙烯酰基-X，SE；AcX）的储存液。将 AcX 溶于 500 µL 无水二甲基亚砜 (DMSO) 中，终浓度为 10 mg/mL。
   注意：该溶液可分装为 20 µL 等份，在 -20 °C 干燥环境中保存。
5. 若不使用商业免疫染色缓冲液，则需配制封闭缓冲液。使用含 5% (v/v) 正常动物血清和 0.1% (w/v) 非离子型表面活性剂的 1x 磷酸盐缓冲液 (PBS)，并根据二抗的宿主动物选择相应血清。例如，为制备用于山羊来源抗体的 500 mL 封闭缓冲液，可混合 25 mL 山羊血清、0.45 g 非离子型表面活性剂，并用 1x PBS 定容至 500 mL。

2. ExPath 所用存档及新鲜临床组织切片的制备

1. 将组织转换为 ExPath 兼容的格式。根据样本的制备方式，从以下四个步骤（2.1.1−2.1.4）中选择其一：福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片、染色的 FFPE 切片，或未固定或已固定的置于最佳切割温度（OCT）溶液中的冷冻组织切片。
   注意：这些步骤基于病理样本的标准回收流程，并非 ExPath 方案所特有。
   1. FFPE 临床样本
      1. 准备 30 mL 的 95% 乙醇、70% 乙醇和 50% 乙醇。量取 30 mL 二甲苯、100% 乙醇和 ddH₂O。
      2. 用镊子将带有样本的切片放入 50 mL 锥形管中，加入 15 mL 二甲苯。盖紧管盖，水平放置于摇床上，约 60 rpm，室温孵育 3 分钟，每种溶液均如此操作。用剩余的 15 mL 二甲苯重复一次。
      3. 用 100% 乙醇、95% 乙醇、70% 乙醇、50% 乙醇和 ddH₂O 替代二甲苯，重复步骤 2.1.1.2。
   2. 已染色并封片的永久切片
      1. 将切片放入 100 mm 培养皿中，用二甲苯覆盖。用刀片小心去除盖玻片。若盖玻片不易去除，将切片重新放回二甲苯中，直至盖玻片松动。
      2. 按照 FFPE 样本的步骤进行处理（步骤 2.1.1.1−2.1.1.3）。
         注意：对于 H&E 染色切片，染料将在扩增过程中被去除。
   3. 置于 OCT 溶液中的未固定冷冻组织切片
      1. 在 -20 °C 下用丙酮固定组织 10 分钟。
      2. 用 1x PBS 溶液在室温下洗涤样本，每次 10 分钟，共洗 3 次。
   4. 先前已固定、冷冻的临床组织切片
      1. 在室温下孵育 2 分钟，使 OCT 溶液融化。
      2. 用 1x PBS 溶液在室温下洗涤样本，每次 5 分钟，共洗 3 次。
2. 在完成格式转换后，对所有样本进行热处理以实现抗原修复。
   1. 在耐热容器（如切片染色缸）中加入 20 mM 枸橼酸溶液（室温下 pH 为 8）。
      注意：溶液量应足以覆盖切片上的组织（标准切片染色缸需约 50 mL）。
   2. 将枸橼酸溶液在微波炉中加热至 100 °C，然后将切片放入溶液中。立即转移至孵育箱，在 60 °C 下孵育 30 分钟。
      注意：此处可暂停实验流程。切片可放入培养皿中，用 1x PBS 覆盖，并在 4 °C 下保存。
3. 使用标准免疫荧光（IF）/免疫组化（IHC）染色方案对样本进行染色。
   注意：一抗和二抗的具体浓度及染色时间取决于制造商建议或针对特定实验的优化条件。
   1. 使用疏水笔在切片上的组织区域周围画出边界，以减少覆盖组织所需的溶液体积。将切片放入足够大的培养皿中。对于标准的 3 英寸切片，使用 100 mm 培养皿。
      注意：疏水笔不会干扰样本的聚合反应或消化过程。
   2. 在 37 °C 下用封闭缓冲液孵育组织 1 小时，或在室温下孵育 2 小时，或在 4 °C 下过夜，以减少非特异性结合。
   3. 将一抗用适量的封闭缓冲液（或其他首选染色缓冲液）稀释至所需浓度。在室温或 37 °C 下，将组织与一抗溶液孵育至少 3 小时，或在 4 °C 下过夜。
      注意：样本应置于湿润容器中（如内含湿纸巾的培养皿），以防组织干燥。通常，抗体在 200−500 µL 缓冲液中稀释至 1:100−1:500，具体取决于组织大小和所用抗体。
   4. 在室温下用封闭缓冲液（或其他首选洗涤缓冲液）洗涤组织 3 次，每次 10 分钟。
   5. 将二抗（如需要，可加入 300 nM 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 [DAPI]）用封闭缓冲液（或其他首选染色缓冲液）稀释至约 10 µg/mL。在室温或 37 °C 下，将组织与二抗溶液孵育至少 1 小时。
      注意：孵育时间可根据所用抗体和组织厚度进行调整。含有氰染料（Cy3、Cy5、Alexa 647）的二抗在聚合前应用时与 ExM 方案不兼容。推荐染料包括 Alexa 488（绿色）、Alexa 546（橙色/红色）和 Atto 647N 或 CF633（远红）。DAPI 必须在扩增后重新染色，因其在扩增过程中会被洗脱。
   6. 在室温下用封闭缓冲液（或其他首选洗涤缓冲液）洗涤组织 3 次，每次 10 分钟。
      注意：此处可暂停实验流程。切片可放入培养皿中，用 1x PBS 覆盖，并在 4 °C 下保存。
   7. 使用常规宽场显微镜、共聚焦显微镜或其他成像系统进行荧光成像。
      注意：此步骤是必需的，用于通过比较扩增前后的图像，结合扩增倍数确定生物学长度。为便于扩增后成像，应选择易于识别的兴趣区域，并采集低倍和高倍图像。

3. 样品的原位聚合

1. 将样本在锚定溶液中孵育。
   1. 通过将 AcX 储存液用 1× PBS 稀释，配制锚定溶液（通常 250 µL 即足以覆盖组织切片）：对于使用非醛类固定剂固定的样本，稀释至浓度为 0.03 mg/mL；对于使用醛类固定剂固定的样本（其可用于与 AcX 反应的游离胺较少），稀释至浓度为 0.1 mg/mL。
   2. 将载玻片放入 100 mm 培养皿中，并用移液器将锚定溶液滴加至组织上。在室温下孵育至少 3 小时，或在 4 °C 下过夜孵育。
2. 将样本在凝胶溶液中孵育。
   1. 准备至少 100 倍体积过量的凝胶溶液。每 200 µL，按以下顺序混合：188 µL 单体溶液、4 µL 0.5% 4HT 储存液（1:50 稀释，终浓度：0.01%）、4 µL 10% TEMED 储存液（1:50 稀释，终浓度 0.2%）、以及 4 µL 10% APS 储存液（1:50 稀释，终浓度 0.2%）。
      注意：凝胶溶液应在使用前立即配制。溶液应保持在 4 °C，APS 溶液应最后加入，以防止提前凝胶化。
   2. 去除组织切片上的多余液体，并将载玻片放入 100 mm 培养皿中。向样本中加入新鲜且低温的凝胶溶液，并在 4 °C 下孵育 30 分钟，以使溶液充分扩散进入组织。
3. 在载玻片上围绕样本构建一个腔室（图 2A），注意不要扰动凝胶溶液。
   1. 使用金刚石刀将盖玻片薄切，制成凝胶腔室的间隔垫。
      注意：为便于扩增后的成像，间隔垫的厚度应接近组织样本的厚度，以减少组织上方空白凝胶的厚度。对于标准临床样本（5−10 µm），可使用 1.5 号玻璃。对于较厚的样本，可堆叠多片盖玻片作为间隔垫。
   2. 在组织两侧使用水滴（约 10 µL）固定间隔垫。
   3. 小心地将盖玻片盖在载玻片上，确保组织区域上方不产生气泡（图 2B）。
4. 将样本置于湿润环境（如内含湿巾的密闭培养皿）中，在 37 °C 下孵育 2 小时。
   注意：此处可暂停实验流程。载玻片腔室可密封后在 4 °C 下保存。

4. 样品消化

1. 用刀片轻轻插入封片与凝胶之间，缓慢将封片从凝胶表面抬起，取下胶固室的盖子。修剪组织周围的空白凝胶以减小体积。将凝胶切成不对称形状，以便在均质化后追踪凝胶的方向，因为样品会变得透明。
   1. 使用前将蛋白酶K（ProK）用消化缓冲液按1:200稀释（终浓度为4 U/mL）。准备足量溶液以完全浸没凝胶；每个四孔塑料细胞培养板的单个孔至少需要3 mL溶液。
   2. 将样品置于含有消化缓冲液的密闭容器中，60 °C孵育3小时。若样品在消化过程中未从载玻片上脱落，可用刀片轻轻将其取下。
      注意：样品应完全浸没在消化缓冲液中，以防干燥，并置于可封口的密闭容器（如小型载玻片盒、塑料孔板、培养皿等）中，容器需用封口膜密封。

5. 样本扩增与成像

1. 使用软毛刷将样本转移至1x PBS中 与所需成像系统兼容且足以容纳完全膨胀凝胶的容器。若使用倒置成像系统，应将组织样本面朝下放置；若使用正置成像系统，则应将样本面朝上放置，以最大限度缩短成像物镜与样本之间的距离。必要时可用软毛画笔轻轻翻转凝胶。
   注意： LED 侧向照明可用于使液体中的样品可见。标准的 6 孔板可容纳预扩张直径小于 0.6 cm 的样品。在倒置系统上进行成像时，应使用玻璃底孔板。
2. 在室温下用1×PBS洗涤样本10分钟。如有需要，由于消化过程会洗去原有的DAPI染色，可使用300 nM DAPI对样本重新染色。吸除PBS，加入用1×PBS稀释的300 nM DAPI，在室温下染色20分钟，随后在室温下用1×PBS洗涤10分钟。
   注意： 样品可用1×PBS覆盖，并在4 °C保存，直至进行下一步操作。
3. 为扩增样品，用 ddH₂O 替换 PBS 并过量洗涤₂O（至少为最终凝胶体积的10倍）重复洗涤3−5次，每次10分钟，室温下进行。
   注意： 3之后^rd 或 4^th 洗涤后，样本的膨胀应开始趋于平稳。储存时，为防止细菌生长，需将ddH₂O 可补充 0.002%−0.01% 叠氮化钠（NaN₃）。在这种情况下，最终的膨胀因子可逆地降低了10%。
4. 使用传统的宽场显微镜、共聚焦显微镜或其他选定的成像系统进行荧光成像。
   注意： 为防止凝胶漂移，可移除点样孔中的多余液体。也可使用1.5−2%低熔点琼脂糖固定凝胶。在容积为溶液体积2−4倍的容器中，配制1.5−2%（w/v）的低熔点琼脂糖水溶液。将溶液置于40 °C水浴或微波炉中加热10−20秒，以完全溶解。用移液器将熔化的琼脂糖沿凝胶边缘加入。待琼脂糖在室温或4 °C下凝固后，向样品中加入水以防止脱水。

结果

如果实验方案成功实施（图1），样品在机械匀浆后将呈现为平坦且透明的凝胶状（图3A），并在水中膨胀3−4.5倍（图3B），其有效分辨率可达约70 nm，具体数值取决于最终的膨胀倍数和所使用的成像系统^5,16。图4展示了采用ExPath方案处理的5 µm厚福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肾组织样本的成像结果。凝胶化样品完全膨胀后在水中达到4.5倍的膨胀倍数，使用数值孔径（NA）为0.95的物镜成像时，有效分辨率约为63 nm。组织首先经二甲苯预处理以去除石蜡并进行再水化（第2.1.1节），随后使用柠檬酸缓冲液进行抗原修复（第2.2节）。修复后的组织使用针对α-辅肌动蛋白4（ACTN4）和波形蛋白（vimentin）的抗体进...

讨论

本文介绍了ExPath方案¹⁶，它是proExM⁵的一种改进版本，适用于病理学中常用的多种临床活检样本类型，包括福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）、苏木精-伊红（H&E）染色以及玻璃载片上的新鲜冷冻样本。样本的格式转换、抗原修复和免疫染色均采用常规通用方案，无需专用于ExPath。与原始的proExM方案⁹不同，ExPath在消化缓冲液中使用更高浓度的EDTA，从而改善了福尔马林固定组织的膨胀效果，这一点已在最初的ExPath研究中得到验证¹⁶。该方案已在5−10 µm厚的临床样本中得到验证¹⁶，但经过适当调整后也可用于更厚的组织样本。本方案中最关键的步骤包括：1）凝胶化步骤的时间控制；2）凝胶化腔室的设置；3）样本均质化的参数设定；以及4）对凝胶的处理。

该方案最关键的参数是凝胶化步骤的时间控制。如果凝胶溶液过早聚合，样本将无法充...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-羟基-TEMPO（4HT）	Sigma Aldrich	176141	抑制剂
6孔玻璃底培养板（#1.5 盖玻片）	Cellvis	P06-1.5H-N
丙酮	Fischer Scientific	A18-500
丙烯酰胺	Sigma Aldrich	A8887
丙烯酰基-X，SE（AcX）	Invitrogen	A20770
琼脂糖	Fischer Scientific	BP160-100
过硫酸铵（APS）	Sigma Aldrich	A3678	引发剂
兔源抗ACTN4抗体	Sigma Aldrich	HPA001873
鼠源抗IV型胶原抗体	Santa Cruz Biotech	sc-59814
鸡源抗波形蛋白抗体	Abcam	ab24525
Aqua Hold II 疏水笔	Scientific Device	980402
乳腺常见疾病组织芯片	Abcam	ab178113
DAPI（1 mg/mL）	Thermo Scientific	62248	细胞核染色剂
88 CM号金刚石刀	General Tools	31116
乙醇	Pharmco	111000200
乙二胺四乙酸 （EDTA）0.5 M	VWR	BDH7830-1
石蜡包埋肾组织样本	USBiomax	HuFPT072
镊子
山羊抗鸡IgY（H+L），高度交叉吸附CF488A	Biotium	20020
山羊抗鸡IgY（H+L），高度交叉吸附CF633	Biotium	20121
山羊抗兔IgG（H+L），高度交叉吸附Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010
MAXbind 染色液	Active Motif	15253	可用非商业性染色缓冲液替代。
MAXblock 封闭液	Active Motif	15252	可用非商业性封闭缓冲液替代。
MAXwash 洗涤液	Active Motif	15254	可用非商业性洗涤缓冲液替代。
显微盖玻片 #1（24 mm × 60 mm）	VWR	48393 106
显微盖玻片 #1.5（24 mm × 60 mm）	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- 四甲基乙二胺（TEMED）	Sigma Aldrich	T9281	加速剂
N,N′-亚甲基双丙烯酰胺	Sigma Aldrich	M7279
正常山羊血清	Jackson Immunoresearch	005-000-121	用于配制封闭缓冲液。需根据二抗的动物来源选择。
Nunclon 4孔×5 mL 多孔细胞培养皿	Thermo Fisher	167063	多孔塑料细胞培养皿
Nunclon 6孔细胞培养皿	Thermo Fisher	140675
Nunc 15 mL 离心管	Thermo Fisher	339651
Nunc 50 mL 离心管	Thermo Fisher	339653
旋转摇床
画笔
pH计
磷酸盐缓冲液（PBS），10倍浓缩液	Fischer Scientific	BP399-1
塑料培养皿（100 mm）	Fischer Scientific	FB0875713
蛋白酶K（分子生物学级）	Thermo Scientific	EO0491
剃须刀片	Fischer Scientific	12640
SafeLock 微量离心管 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
SafeLock 微量离心管 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
丙烯酸钠	Sigma Aldrich	408220
氯化钠	Sigma Aldrich	S6191
柠檬酸三钠二水合物	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Tris碱	Fischer Scientific	BP152-1
吐温X-100	Sigma Aldrich	T8787
CF640R标记的麦胚凝集素	Biotium	29026
二甲苯	Sigma Aldrich	214736