通过物理性各向同性膨胀实现人体组织切片的纳米级成像

摘要

对临床组织样本进行纳米级成像有助于加深对疾病发病机制的理解。扩展病理学（ExPath）是扩展显微技术（ExM）的一种改进版本，经过优化可兼容常规临床组织样本，从而利用传统的衍射受限显微镜研究生物分子的纳米级空间排布。

摘要

在现代病理学中，光学显微镜通过揭示临床标本的微观结构，在疾病诊断中发挥着重要作用。然而，由于基本的物理衍射极限，使用传统的光学成像方法难以观察纳米尺度的组织结构和细微的病理变化。本文介绍一种简单且低成本的方案，称为扩展病理学（ExPath），可用于对常见类型的临床原代组织标本进行纳米级光学成像，包括固定冷冻组织切片和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片。该方法通过将组织样本化学转化为组织-水凝胶杂化物，并在纯水中实现多尺度的各向同性物理扩展，从而克服光学衍射极限。由于组织的扩展，原本无法分辨的分子得以分离，因此可以使用常规光学显微镜进行观察。

引言

在三维（3D）环境中研究组织的分子结构，有助于深入理解生物学功能及疾病的发生发展。然而，这些纳米级结构超出了传统衍射受限显微镜（200−300 nm）的分辨能力，其中最小可分辨距离 d 由公式 d α λ/NA 定义。此处 λ 为光的波长，NA 为成像系统的数值孔径（NA）。近年来，随着新型超分辨率成像技术的发展，荧光标记分子的直接可视化已成为可能^1,2,3，这些技术包括受激辐射损耗显微技术（STED）、光激活定位显微技术（PALM）、随机光学重建显微技术（STORM）以及结构光照明显微技术（SIM）。尽管这些成像技术极大地推动了人们对纳米尺度生物学功能的理解，但在实际应用中，它们往往依赖昂贵和/或专用的设备以及复杂的图像处理步骤，成像速度通常较传统光学成像更慢，并且需要具有特定性质的荧光染料（如具备光开关能力或高光稳定性）。此外，在组织样本上实现三维超分辨率成像仍面临诸多挑战。

方案

1. 储存试剂和溶液的制备

1. 准备凝胶溶液组分。
   注意：溶液浓度以 g/mL（w/v 百分比）表示。
   1. 配制以下储存液：38% (w/v) 丙烯酸钠 (SA)、50% (w/v) 丙烯酰胺 (AA)、2% (w/v) N,N′-亚甲基双丙烯酰胺 (Bis) 和 29.2% (w/v) 氯化钠 (NaCl)。将各化合物溶解于双蒸去离子水 (ddH₂O) 中。以表1中的用量为参考；所配制的溶液可根据需要按比例放大或缩小体积。例如，配制 10 mL 的 38% (w/v) SA 溶液时，将 1.9 g SA 加入 10 mL 刻度量筒中，并加入 ddH₂O 至 5 mL 体积。
   2. 按照表1所示，配制 9.4 mL 单体溶液，浓度为 1.06x。
      注意：加入引发剂、加速剂和抑制剂后，最终浓度将为 1x。单体储存液可在 4 °C 保存最多 3 个月，或在 -20 °C 长期保存。
   3. 分别在 ddH₂O 中配制以下储存液：0.5% (w/v) 抑制剂 4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基 (4HT)，该抑制剂可抑制凝胶化，从而促进凝胶溶液在组织中的扩散；10% (v/v) 引发剂四甲基乙二胺 (TEMED)，可加速过硫....

结果

如果实验方案成功实施（图 1），样品在机械匀浆后将呈现为平整且透明的凝胶状（图 3A），并在水中膨胀至原始体积的 3−4.5 倍（图 3B），其有效分辨率可达约 70 nm，具体数值取决于最终的膨胀倍数及所使用的成像系统^5,16。图 4 展示了采用 ExPath 方案处理的 5 µm 厚 FFPE 肾脏组织样本的成像结果。凝胶化样品完全膨胀后在水中达到 4.5 倍的膨胀倍数，使用数值孔径（NA）为 0.95 的物镜成像时，有效分辨率达到约 63 nm。组织首先经二甲苯预处理以去除石蜡并进行再水化（第 2.1.1 节），随后使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复（第 2.2 节）。修复后的组织使用针对 α-肌动蛋白 4（ACTN.......

讨论

本文介绍了ExPath方案¹⁶，它是proExM⁵的一种改进版本，适用于病理学中常用的多种临床活检样本类型，包括福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）、苏木精-伊红（H&E）染色以及玻璃载片上的新鲜冷冻样本。样本的格式转换、抗原修复和免疫染色均采用常规通用方案，无需专用于ExPath。与原始的proExM方案⁹不同，ExPath在消化缓冲液中使用更高浓度的EDTA，从而改善了福尔马林固定组织的膨胀效果，这一点已在最初的ExPath研究中得到验证¹⁶。该方案已在5−10 µm厚的临床样本中得到验证¹⁶，但经过适当调整后也可用于更厚的组织样本。本方案中最关键的步骤包括：1）凝胶化步骤的时间控制；2）凝胶化腔室的设置；3）样本均质化的参数设定；以及4）对凝胶的处理。

该方案最关键的参数是凝胶化步骤的时间控制。如果凝胶溶液过早聚合，样本将无法充.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-羟基-TEMPO（4HT）	Sigma Aldrich	176141	抑制剂
6孔玻璃底培养板（#1.5 盖玻片）	Cellvis	P06-1.5H-N
丙酮	Fischer Scientific	A18-500
丙烯酰胺	Sigma Aldrich	A8887
丙烯酰基-X，SE（AcX）	Invitrogen	A20770
琼脂糖	Fischer Scientific	BP160-100
过硫酸铵（APS）	Sigma Aldrich	A3678	引发剂
兔源抗ACTN4抗体	Sigma Aldrich	HPA001873
鼠源抗IV型胶原抗体	Santa Cruz Biotech	sc-59814
鸡源抗波形蛋白抗体	Abcam	ab24525
Aqua Hold II 疏水笔	Scientific Device	980402
乳腺常见疾病组织芯片	Abcam	ab178113
DAPI（1 mg/mL）	Thermo Scientific	62248	细胞核染色剂
88 CM号金刚石刀	General Tools	31116
乙醇	Pharmco	111000200
乙二胺四乙酸 （EDTA）0.5 M	VWR	BDH7830-1
石蜡包埋肾组织样本	USBiomax	HuFPT072
镊子
山羊抗鸡IgY（H+L），高度交叉吸附CF488A	Biotium	20020
山羊抗鸡IgY（H+L），高度交叉吸附CF633	Biotium	20121
山羊抗兔IgG（H+L），高度交叉吸附Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010
MAXbind 染色液	Active Motif	15253	可用非商业性染色缓冲液替代。
MAXblock 封闭液	Active Motif	15252	可用非商业性封闭缓冲液替代。
MAXwash 洗涤液	Active Motif	15254	可用非商业性洗涤缓冲液替代。
显微盖玻片 #1（24 mm × 60 mm）	VWR	48393 106
显微盖玻片 #1.5（24 mm × 60 mm）	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- 四甲基乙二胺（TEMED）	Sigma Aldrich	T9281	加速剂
N,N′-亚甲基双丙烯酰胺	Sigma Aldrich	M7279
正常山羊血清	Jackson Immunoresearch	005-000-121	用于配制封闭缓冲液。需根据二抗的动物来源选择。
Nunclon 4孔×5 mL 多孔细胞培养皿	Thermo Fisher	167063	多孔塑料细胞培养皿
Nunclon 6孔细胞培养皿	Thermo Fisher	140675
Nunc 15 mL 离心管	Thermo Fisher	339651
Nunc 50 mL 离心管	Thermo Fisher	339653
旋转摇床
画笔
pH计
磷酸盐缓冲液（PBS），10倍浓缩液	Fischer Scientific	BP399-1
塑料培养皿（100 mm）	Fischer Scientific	FB0875713
蛋白酶K（分子生物学级）	Thermo Scientific	EO0491
剃须刀片	Fischer Scientific	12640
SafeLock 微量离心管 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
SafeLock 微量离心管 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
丙烯酸钠	Sigma Aldrich	408220
氯化钠	Sigma Aldrich	S6191
柠檬酸三钠二水合物	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Tris碱	Fischer Scientific	BP152-1
吐温X-100	Sigma Aldrich	T8787
CF640R标记的麦胚凝集素	Biotium	29026
二甲苯	Sigma Aldrich	214736