利用磁共振成像与活检数据指导前列腺癌生物样本库的取样流程

摘要

该方法通过利用前列腺癌患者的临床诊断数据，以指导根治性前列腺切除术后组织生物样本库的取样流程。此方法解决了既往发表的方法在组织样本获取效率以及新鲜组织可用于更广泛下游应用方面的局限性。

摘要

既往在根治性前列腺切除术后对前列腺组织进行生物样本库保存的方法通常采用随机取样。为了提高效率并支持更广泛的下游应用，现已开发出一种更有针对性的前列腺组织取样方法。本文中，我们结合磁共振成像（MRI）和穿刺活检数据，对器官内的特定区域进行靶向取样。该方法采用一种先前已发表的前列腺切片装置，从前列腺预设区域切取一个5 mm的横断面切片，随后从该切片的预定位置获取6 mm的钻孔活检样本。这些样本可用于冷冻保存或固定以用于生物样本库建设，也可直接新鲜使用，其肿瘤成分含量的可信度可达70%，而随机取样法的可信度仅为10%。该方法不仅适用于基因组学、蛋白质组学或组织学等常规下游技术，还可支持需要新鲜组织的实验，如活体组织成像或离体培养。

引言

获取高质量的人类前列腺癌组织是推动该领域有效研究的关键要求。目前已有多种方法可在根治性前列腺切除术后采集前列腺组织用于研究。通常这些方法包括使用穿刺活检针从新鲜、冷冻或固定的前列腺组织切片中随机取样，并通过苏木精-伊红染色回顾性确认每个样本中是否存在肿瘤。 & 伊红（H&E）由泌尿病理学家评估^1,2,3,4,5最近的一篇综述汇总了这些现有方法的概述⁶这些方法适用于某些后续应用，其中组织可被保存并在日后评估肿瘤含量，例如国际癌症基因组联盟（ICGC）和癌症基因组图谱（TCGA）等大规模基因组分析项目。^4,7然而，若能利用磁共振成像（MRI）和/或活检数据来靶向前列腺特定区域进行取样，这些方法仍有改进空间。这种改进将从两方面提升研究方法：首先，通过减少采集的组织样本数量，提高效率，减轻病理科的工作负担并降低样本储存成本；其次，可直接立即使用新鲜组织，无需等待肿瘤成分的即时确认，从而支持诸如活体组织成像、类器官生成或离体培养等前沿下游技术的应用。这一科研需求推动了PEOPLE（PatiEnt prOstate samPLes for rEsearch，用于研究的患者前列腺样本）方法的建立，采用PEOPLE方法所采集的前84例生物样本库病例的研究结果已近期发表。⁸该方法的一种改进版本已发表，采用三维（3D）打印切片装置和患者特异性模具，以促进对固定前和固定后组织进行离体 MRI 检测^9,10. 

方案

该方案遵循当地指南，并已获得伦敦大学学院/伦敦大学学院医院生物样本库研究伦理委员会（参考编号：15/YH/0311）的批准。

注意：由于本方法涉及人体组织取样，在开始实验方案之前，必须事先遵守所有关于伦理和知情同意的本地规定。如果在手术前已有 MRI 和活检数据，且肿瘤直径 ≥5 mm，则可纳入根治性前列腺切除术病例。如果主要病灶定义不明确（即 MRI 仅显示弥散性改变），则应排除该病例。

1. 前列腺切片装置

1. 购买前列腺切片装置（材料表）。或者，可使用3D打印机打印刀片手柄，方法如先前文献所述¹⁰。
   注意： 本实验所用装置及一次性刀片系通过材料转让协议从英国伦敦癌症研究所（Institute of Cancer Research, London, UK）购得。

2. 肿瘤靶向

1. 查阅临床记录，根据诊断性活检结果确定病灶位置，例如左侧后部。
2. 查阅 MRI 图像，测量上述肿瘤的位置。
   1. 找到在轴状面上肿瘤显示最清晰的序列，例如 T2 加权像。
   2. 逐层浏览轴状面图像，找到肿瘤面积最大的层面，并打印该图像作为参考。
   3. 在相应的冠状面图像上，测量从前列腺基底部到所选轴状面位置的距离，以及前列腺从尖部到基底部的全长（mm），并打印作为参考。

3. pProstate 的收集

1. 检查患者病历，确保已为此项操作及任何后续科研应用获得适当的知情同意。
2. 行根治性前列腺切除术后，将前列腺组织置于干燥容器中收集。确保未向前列腺组织中添加福尔马林或其他固定液。
3. 转移至合适的无菌环境进行取样，例如病理科的超净工作台。
4. 如需新鲜组织，应尽快进行取样。
   注意：对于某些应用（例如DNA检测，其降解速度较RNA慢），可将标本冷藏，并于次日取样。

4. 样品制备

1. 根据当地去污染规程，采用无菌技术准备层流罩和前列腺切片装置。此处，喷洒70%乙醇并擦拭所有表面。使用无菌的一次性针头和手术刀。切片刀片最多可使用三次；每次使用后用热水和肥皂清洗，然后喷洒并用70%乙醇擦拭。
2. 使用标准天平称量前列腺（g）。
3. 对前列腺进行染色标记。左侧涂蓝色墨水，右侧涂黑色墨水。将墨水覆盖整个包膜和精囊 ，以便后续标识手术切缘。
   注意：染色标记操作可能因地区而异，可根据实际情况进行调整。

5. 前列腺切片

1. 将切片装置的侧壁垂直插入支架底座中，组装切片装置（图1A）。
2. 放置前列腺，使其基底部和尖端分别朝向相对的两个侧壁，后侧朝下，前侧朝上。在前列腺周围放置金针。如有必要，可轻微向内推动前列腺，以实现紧密贴合，从而在切片过程中提供支撑。
3. 使用直尺测量前列腺从基底部到尖端的长度，并与磁共振成像（MRI）测得的前列腺长度进行比较。如果前列腺发生收缩，则需对预期的从基底部到目标横切面的距离进行经验性校正。例如，若MRI图像中前列腺全长为50 mm，而此时用直尺测量为45 mm，则应将预期切片位置缩短10%。
4. 从基底部开始测量至所需横切面的位置，并选择最接近该测量值的金针作为切片参考。
5. 佩戴防割链甲手套以防止受伤，手持切片装置（图1B），将刀片置于已选定金针的两侧，并使用间隔器使两刀片之间保持5 mm距离。通过缓慢而有力地进行长距离的上下前后移动完成切片（图1C）。在拆卸装置前，确保已完全分离出一个完整的切片。
6. 移除侧壁和金针，戴手套后小心地将切片转移至无菌的软木板上。

6. 组织取样

1. 肉眼检查横断面切片，并与轴向 MRI 图像进行比较。在某些情况下，肿瘤区域可能比周围组织颜色更浅。
2. 轻轻触诊横断面切片。在某些情况下，肿瘤可能比周围组织更坚硬。
3. 以轴向 MRI 图像为引导，选择一个或多个取样区域。
4. 对目标组织区域进行活检打孔取样。
   1. 使用直径为 6 mm 的打孔器，垂直按压目标组织区域。
   2. 原位旋转打孔器并向下压紧软木垫，以确保组织完全分离；必要时使用锋利的手术刀辅助分离。
   3. 取出打孔器，通过推动活塞将组织样本弹出，根据需要放入试管或模具中。
   4. 根据需要，使用独立的无菌活检打孔器对其他肿瘤及良性组织样本重复上述操作。用红色墨水标记已取样的孔位。
   5. 记录每个打孔位置，以及前列腺的重量和对组织颜色/硬度的任何观察结果。

7. 前列腺样本用于本地诊断的提交

1. 在固定前，使用无菌一次性针头将前列腺固定在软木上，以防止组织收缩和变形，从而避免影响手术切缘的外观。
2. 固定于软木后，将前列腺送至组织病理学部门进行常规临床诊断。

8. 仪器的去污染

1. 按照当地规定，将所有一次性设备丢弃至生物医学废物处理系统和/或锐器容器中。
2. 根据适用于人体组织的当地风险评估要求，对层流罩和前列腺切片装置进行去污染处理（例如，喷洒70% EtOH后擦拭）。 

结果

采用PEOPLE方法采集的新鲜前列腺组织可用于多种下游技术，包括基因组测序和离体培养。此前已发表使用该方法采集的前59例样本，与早期版本的方法进行了比较，并提供了初步的下游数据⁸。从开始切取前列腺组织到冷冻或固定穿刺活检样本的时间约为1分钟，该时间被尽可能缩短，以避免RNA降解。从前列腺切除到开始切片的时间也应尽可能缩短，但由于我们的手术室和病理科实验室位于不同地点，此过程耗时约20分钟。

根据下游应用的不同，通常至少采集两个样本：一个来自预期的肿瘤组织区域，另一个来自预期的良性组织区域。评估取样方法本身成功与否的关键指标是测定特定样本中的肿瘤含量。

纳入10万基因组项目时，需由泌尿病理学家评估苏木精-伊红（H&E）染色的组织切片，且样本中必须包含至少40%的肿瘤细胞。若样本中肿瘤细胞比例低于40%，但经成功宏观显微切割后仍可被纳入项目。在最初以此方式采集的92例病例中，64%的样本含有至少40%的肿瘤细胞，无需宏观显微切割即提交至10万基因组项目。所有病例的DNA均被成功提取，且产量与质量均满足要求（表1）。其中最初的59个样本子集此前已发表，并与早期方法进行了比较⁸。

对于离体培养，匹配的肿瘤组织和良性组织必须具有足够的质量，以耐受72小时培养而不发生显著降解。来自总共三名患者的多个组织样本已成功进行了培养⁸。

图1：前列腺切片装置。 该装置根据材料转移协议从癌症研究所获得。（A）壁板垂直插入底座中，金针插入底座中，围绕前列腺（前列腺未图示）。（B）可更换的平行刀片插入刀柄中。（C）刀片穿过金针之间，以切取5 mm厚的前列腺组织切片。请点击此处查看该图的放大版本。

	n (%)
命中（>40% 肿瘤）	59 (64%)
部分命中（5–30% 肿瘤）	6 (7%)
未命中（0% 肿瘤）	27 (29%)
总计	92 (100%)

表1：肿瘤检出率。 肿瘤检出率由专长于前列腺癌的顾问病理学家在复查苏木精-伊红（H&E）染色组织后确定。根据英国基因组学（Genomics England）指南，肿瘤细胞含量>40% 的样本被认为符合纳入十万基因组计划（100,000 Genomes Project）的标准。

讨论

本方案中的关键步骤包括确定取样肿瘤区域、前列腺测量以及组织取样。首先，需测量MRI图像以确定正确的取样区域，这是至关重要的。我们在配套视频中演示了该方法；但同时也建议初次操作时与放射科医生共同确认测量结果。理想情况下，应提供清晰的临床记录，明确指出MRI图像中包含优势病灶的区域，以指导研究人员定位。其次，进行前列腺测量时应谨慎操作，确保将标尺倾斜放置，以平行于前列腺前缘的方向完整测量从基底部到尖部的全长。第三，在取样前应通过以下方式确认肿瘤区域：将组织切片与原始MRI图像进行视觉比对，触诊组织（在某些情况下，肿瘤区域触感更为致密），以及观察组织颜色（在某些情况下，肿瘤组织颜色较周围良性组织更苍白）。

该方案已在伦敦大学学院（UCL）/伦敦大学学院医院（UCLH）由非临床博士后研究人员、病理学专科培训医师、病理学顾问医师以及研究技术人员完整实施。根据我们的经验，无论技术背景如何，所有操作步骤均可在不足十例样本中掌握。然而，我们建议初次操作时由放射科医师指导MRI测量，由病理学家指导切片操作。该方案可通过使用已发表的3D打印切片手柄进行改进¹⁰。

该技术的潜在局限性包括可能影响诊断的风险。前列腺切片是一个关键步骤，若操作不当，可能会影响分级或阳性切缘率。这里存在两个潜在问题。首先，如果将全部索引病灶切除并立即用于新鲜组织实验，则该病灶将无法接受常规临床诊断，患者可能被误诊为较低级别的癌症。为避免此情况，研究人员应在取样前与常规负责该病例复核的顾问病理学家讨论取样方案，并就取样数量和取样位置达成一致。出于这一原因，小肿瘤可能被局部排除在外。其次，若在固定前未将前列腺包膜正确地固定在软木板上，则可能导致内部组织在固定过程中向外凸起，从而改变手术切缘。这可能造成假阳性切缘，即残留肿瘤看似位于包膜处，而实际上仅仅是由于组织变形所致。

该技术相较于现有方法的重要性主要体现在肿瘤靶向性方面。迄今为止，已有多种针对根治性前列腺切除标本取样的方法被发表；然而，这些方法均依赖于完全或部分随机取样策略^{1,2,3,4,5,6,7}。本方法中应用活检尤其是MRI数据，提高了取样效率，可在减少取样量的同时更可靠地获取肿瘤组织⁸。

该方法的未来应用相比以往的取样方法，可采用更广泛的下游技术。例如，由于所获取的新鲜组织含有肿瘤的概率较高，因此可以使用成本较高和/或劳动密集型的新鲜组织技术，且无需大量样本即可确保肿瘤的存在。这些技术包括但不限于离体培养、离体磁共振成像（MRI）、先进成像技术以及转录组学。 

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 mm 活检打孔器	Fisher Scientific	13404607	一次性活检打孔器，用于获取6 mm组织样本
黑色墨水	Leica Biosystems	3801753	组织标记 &与边缘染料
蓝色墨水	Leica Biosystems	3801751	组织标记 && 荧光标记染料
链甲手套	Arco	1456803	切割时佩戴链甲手套以保护手部
软木板	Fisher Scientific	12396447	用于固定前列腺以进行后续取样操作的软木板
针头	SLS（科学实验室用品）	SYR6112	用于取样后将组织固定在软木板上的无菌针头
前列腺切片装置	伦敦癌症研究所	NA - 必须通过材料转移协议（MTA）获取	包含切片手柄、刀片、间隔器、底座、侧壁和销钉的套装