用于生产PET示踪剂的固体阶段11C甲基化、纯化和配方

摘要

我们报告一种高效的碳-11放射性标签技术，使用固体相提取盒生产与正电子发射断层扫描（PET）相关的临床示踪剂。¹¹C甲基化剂通过预装前体的盒，并连续用水乙醇洗脱提供高放射性化学产量的化学和放射化学纯PET示踪剂。

摘要

用于正电子发射断层扫描（PET）的放射性跟踪器的常规生产主要依靠湿化学，其中放射性合成素与溶液中的非放射性前体发生反应。这种方法需要通过高性能液相色谱法（HPLC）对示踪剂进行纯化，然后重新配方在生物相容性溶剂中用于人体管理。我们最近开发了一种新型^{的 11}C 甲基化方法，用于高效合成碳-11 标记 PET 放射性药物，利用固相盒作为一次性"三合一"单元进行合成、纯化和重新制定示踪剂。这种方法消除了对预准备HPLC的使用，并减少了示踪剂在传输线和放射性衰变造成的损失。此外，基于墨盒的技术提高了合成可靠性，简化了自动化流程，并便于符合良好制造规范 （GMP） 要求。在这里，我们演示了这项技术，在生产PET示踪剂匹兹堡化合物B（=11C_PiB）的例子，一个金标准在体内的淀粉样斑块在人脑中。

引言

正电子发射断层扫描（PET）是一种分子成像模式，它依赖于检测附着在生物活性分子上的同位素的放射性衰变，从而能够对生化过程、信号和转化进行体内可视化.碳-11（t_1/2 = 20.3分钟）是PET中最常用的放射性同位素之一，因为它在有机分子中丰富，而且半寿命短，允许在同一天对同一人类或动物主体进行多次示踪剂，并且减轻病人的辐射负担。许多标有这种同位素的示踪剂用于临床研究和基础健康研究，用于经典和新兴生物相关靶点体内 PET 成像 - [¹¹C]d₂/D₃受体的 raclopride，[11 C]用于淀粉样斑块的 PiB， =¹¹C_PBR28 用于转位蛋白 - 仅举几例。

碳-11标记的PET示踪剂^{主要通过11}个C-甲基化的非放射性前体生产，这些前体含有-OH（酒精、苯酚和甲氧乙酸）、-NH（胺和酰胺）或-SH（二醇）组。简单地说，同位素^{通过14N（p，α）11C}核反应在回旋加速器的气体靶中生成，化学形式为11C+CO2。后者然后通过湿化学（减少至+ 11 C_CH 3 I）转化为¹¹C_甲基碘化物 （=¹¹C_CH₃I），减少至 +¹¹C_CH₃OH，LiAlH_4，然后用 HI 淬火）¹或干燥化学（催化还原到+¹¹C_CH_4，然后是分子 I₂的基基碘化 ）²。[¹¹C]CH₃I 然后可以通过在银三聚苯甲柱³上将其转换进一步转换为反应性更强^{的 11}C-甲基三聚醚（=¹¹C_CH₃OTf）。然后，通过将放射性气体冒泡成有机溶剂中的非放射性前体溶液，或通过更优雅的自有溶剂"循环"^{方法4、5进行11C}甲基化。然后，通过HPLC^对11种C-示踪剂进行纯化，在生物相容性溶剂中重新配制，并通过无菌过滤器，然后施用给人体。鉴于碳-11的半寿命很短，所有这些操作都必须快速可靠。然而，使用HPLC系统会大大增加示踪剂的损失和生产时间，通常需要使用有毒溶剂，使自动化复杂化，偶尔会导致合成失败。此外，对反应器和HPLC柱进行必要的清洁延长了后续示踪剂批次合成之间的延迟，并增加了人员对辐射的暴露。

氟-18（t_1/2 = 109.7分钟）的放射性化学，另一种广泛使用的PET同位素，最近通过开发基于盒式试剂盒的试剂盒，消除了对HPLC纯化的需要而得到推进。通过采用固相萃取 （SPE） 盒，这些完全一次性试剂盒可实现^{18 种}F 示踪剂的可靠常规生产，包括¹⁸F_FDG、18 F_FMISO、18 F_FMC 等，合成更短时间、减少人员参与和最少的设备维护。碳-11在PET成像中仍然不太受欢迎的同位素的原因之一是缺乏用于常规^生产11种C示踪剂的类似试剂盒。它们的开发将大大提高合成可靠性，提高放射性化学产量，并简化生产模块的自动化和预防性维护。

目前可用的生产套件利用廉价的一次性 SPE 墨盒，而不是 HPLC 柱，用于将放射性追踪器与未反应的放射性同位素、前体和其他放射性和非放射性副产品分离。理想情况下，无线电标记反应也在同一墨盒上进行;例如，在生产前列腺癌成像PET示踪剂PET示踪剂时，二甲基氨基甲醇^的18F_氟甲基化与气态性 =¹⁸F_CH₂BrF^发生于阳离子交换树脂盒上^6.虽然已报告在墨盒上对^几个11个C示踪剂进行放射性标记的类似^{程序7，8，}并且^对11C_choline⁹的放射合成特别强大和[¹¹C_美色^氨酸10，这些例子仍然限于肿瘤PET示踪剂，其中通常不需要从前体分离。我们最近报告了用于^生产[11C]CH₃I¹¹和随后^{11 C}甲基化以及固体相支持合成¹²的"[11 C]基套"的开发，^简化了11种C示踪剂的常规生产。在这里，我们希望以固相支持放射性合成^的11C_PiB为例来展示我们的进步，这是A+成像的放射跟踪器，在2003年首次开发时彻底改变了阿尔茨海默氏病（AD）成像领域（图 1）^13，14.在这种方法中，挥发性 =¹¹C_CH₃OTf （bp 100 °C） 通过沉积在一次性墨盒树脂上的 6-OH-BTA-0 前体传递。PET 示踪剂 =¹¹C_PiB 然后通过从盒中洗脱具有生物相容性水乙醇从前体和放射性杂质中分离出来。此外，我们使用遥控无线电化学合成模块和一次性盒式试剂盒试剂盒，自动化了这种¹¹C_PiB 放射合成方法。具体来说，我们在一个20瓣放射性化学模块上实现了这种放射合成，该模块配备了注射器驱动（分配器），适合标准的20 mL一次性塑料注射器、气体流量控制器、真空泵和仪表。由于这种方法的简单性，我们相信它可以被修改为大多数市售的自动合成器，无论是盒式或带有固定阀门的。这种固相支持技术有助于符合良好制造规范 （GMP） 法规^{的 11}C_PiB 生产，并提高合成可靠性。此处描述的技术还减少了放射性合成所需的前体量，只使用"绿色"生物相容性溶剂，并减少了连续生产批次之间的时间。

方案

1. 制备缓冲液和埃鲁剂

1. 将2.72克醋酸钠三水合物溶解在100 mL水中，制备0.2M醋酸钠溶液（溶液A）。
2. 将11.4 mL的冰川醋酸溶解在1L水中，制备0.2M醋酸溶液（溶液B）。
3. 将50 mL溶液A与450 mL溶液B结合，根据缓冲器参考^中心15制备pH 3.7（缓冲1）的醋酸缓冲液。使用 pH 条或 pH 计验证缓冲液的 pH。
4. 将 12.5 mL 的绝对乙醇与 87.5 mL 的缓冲液 1 结合，使 12.5% 的 AOH 溶液（洗涤 1）在 100 mL 瓶中。
5. 将 15 mL 的绝对乙醇与 85 mL 的缓冲液 1 结合，在 100 mL 瓶中制成 15% 水性 EtOH 溶液（洗涤 2）。
6. 将 5 mL 的绝对乙醇与 5 mL 的缓冲液 1 结合，制成 50% 水性 EtOH 溶液（最终渗出液），并将此溶液的 2.5 mL 放入 10 mL 注射器中。

2. 前体在墨盒中的应用

1. 通过 10 mL 的水，然后 5 mL 的丙酮通过 tC18 墨盒，以预置它。
2. 以 50 mL/min 的速度将墨盒干燥 1 分钟。
3. 在1mL无水丙酮中溶解2毫克前体6-OH-BTA-0。
4. 向下拿着 Luer-tip 250 μL 精密玻璃注射器，在液体顶部提取 100 μL 的前体溶液和 50 μL 的气垫。取出针头，将前体溶液从母端涂抹在tC18墨盒上，缓慢向下推柱塞。不要进一步推动解决方案！

3. 设置自动合成的歧管

1. 将标准 5 端口一次性歧管固定在合成模块上，然后按照下图 2和步骤 3.2 - 3.5 进行组装。
   注:我们建议使用耐丙酮歧管（参见材料表）。
2. 端口 1 有两个位置。将水平入口连接到装有 20 mL 注射器的自动分配器。用洗涤 1 将垂直入口连接到瓶子。
3. 将产生 +¹¹C_CH₃OTf 的模块输出连接到歧管的端口 2。
4. 在端口 3 和 4 之间安装装载前体 6-OH-BTA-0 的 tC18 墨盒。
5. 端口 5 有两个位置。将水平出口连接到必须至少容纳 200 mL 的废瓶。将垂直出口连接到无菌小瓶，通过无菌过滤器收集示踪剂。

4. 放射性合成 =¹¹C_PiB

注意:所有涉及放射性同位素的操作必须由接受适当训练的人员在含铅热电池中进行，以便使用放射性物质。
注:本协议不包括在回旋加速器中^生产+11C+CO₂及其使用放射化学模块^转换为+11C_CH₃OTf的细节。这些程序将取决于放射化学实验室的单个设备，并且不在本协议的范围之内。我们的 PET 中心配备了 IBA 回旋加速器，它通过 14 N（p，α） ¹¹C（μ）¹¹C 核反应，在气体中产生¹¹C+CO₂的化学形式碳-11，以及 N₂/O₂气体混合物 （99.5:0.5）目标，并通过"干法"（催化还原至+¹¹C_CH_4，然后是基碘）生产¹¹C_CH₃ I的商用模块。[¹¹C]CH₃OTf 是通过通过 +¹¹C_CH₃I 在银三充气柱上加热到 175 °C，在 20 mL/min 上产生的。

1. 通过端口 2 将^{11 C_CH}₃OTf 送入歧管，然后以 20 mL/min 输出流量通过装载的 tC18 盒，由 *¹¹C_CH₃OTf 模块调节，通过端口 3 和 4 进入废瓶，如上所示图 2A.
2. 一旦所有放射性被转移并被困在 tC18 磁带盒上，由墨盒支架后面的放射性探测器监控，则通过关闭端口 2 来阻止气体流动。让墨盒坐2分钟完成反应。
3. 从100 mL瓶中取出19 mL的洗涤1溶液（参见步骤1.4），通过端口1以100 mL/min将100mL/min插入分配器注射器，如图2B所示。
4. 通过端口 3 和 4从分配器通过 tC18 墨盒将 18.5 mL 的洗涤 1 溶液通过端口 3 和 4，以 50 mL/min 的速度将 18.5 mL 的洗涤 1 溶液放入废瓶中，如图2C所示。确保歧管中无气泡，因为它们可能会降低分离效率。
5. 重复步骤4.3和4.4四次，每次提取和分配18.5 mL洗涤1溶液。通过tC18的洗涤1溶液总体积为92.5 mL;但是，根据所使用的特定合成模块，它可以在 90 - 100 mL 范围内变化。
6. 将端口 1 上的输入线从洗涤 1 切换到洗涤 2 溶液（参见步骤 1.5）。
7. 重复步骤4.3和4.4三次，每次提取和分配18.5 mL的洗涤2溶液。通过tC18的洗涤2溶液总体积为55.5 mL。但是，根据所使用的特定合成模块，它可以在 50 - 60 mL 范围内变化。
8. 将阀 5 转向最终小瓶，如图2D所示。断开分配器的线路，并将其连接到含有 2.5 mL 的最终渗出溶液（50% 水性 EtOH，参见步骤 1.6）和 7.5 mL 空气的 10 mL 注射器。
9. 将注射器向下握住，手动将最终渗滤液 （2.5 mL） 推动，然后通过端口 3 和 4 通过 tC18 墨盒将空气 （7.5 mL） 推入无菌小瓶，通过无菌过滤器收集示踪剂，如图所示2D.
10. 断开空注射器，连接含有10 mL无菌磷酸盐缓冲液的10 mL注射器（配方未包括，因为它可能有所不同），并将整个体积通过tC18墨盒推入无菌小瓶，如上所述（图2D).断开注射器，用同一注射器用10 mL的空气冲洗管线。
11. 提取最终示踪剂配方的0.7 mL，并收集样品用于质量控制程序（0.1 mL）、细菌内毒素检测（0.1 mL）和不育（0.5 mL）。

5. 质量控制程序

注意:每批放射跟踪器在释放到 PET 成像现场进行给人或动物主体进行管理之前，必须经过适当的质量控制程序 （QC）。本手稿的作者不负责其他中心生产的放射跟踪器遵守当地卫生当局的规定。

1. 执行预释放质量控制程序，其中必须包括放射性化学特性 （RCI）、放射化学纯度 （RCP）、示踪剂的化学纯度和摩尔活性以及配方的剩余溶剂含量和 pH 值测试。
2. 通过配备紫外线（350 nm 监测）和放射性探测器以及反向相柱的分析 HPLC 系统，确定 RCI、RCP、化学纯度和摩尔活性。确定 6-OH-BTA-0 和 6-OH-BTA-1 的保留时间，并校准仪器以量化每种化合物的含量。
3. 通过配备毛细管柱的分析气相色谱系统确定残留溶剂含量。确定丙酮和乙醇的保留时间，并校准仪器以量化每种溶剂的含量。
4. 使用配备合适墨盒的墨盒读取器执行细菌内毒素测试。
5. 在合成后至少 14 天对样品进行无菌分析，以确保没有细菌生长，或将无菌样品送往当地卫生当局认可的实验室。

结果

为了总结典型放射性合成的 [¹¹C_PiB， 气态 ]¹¹C_CH₃OTf 首先通过预装前体溶液的 tC18 盒 （图 1）。然后，通过连续洗脱水乙醇溶液实现反应混合物的分离，如下所示。首先，12.5% EtOH洗脱大多数未反应的 [¹¹C_CH₃OTf 和 6-OH-BTA-0》，然后 15% EtOH 洗掉残留杂质，最后 50% 乙醇溶液将所需的 [¹¹C]PiB 排脱到无菌小瓶中。然后用无菌磷酸盐缓冲液稀释示踪剂，并在释放至PET成像现场之前经过严格的QC程序。图3中所示，适用于给药^的*11C_PiB批次的典型分析HPLC紫外线和放射性色谱图。

总放射合成时间是10分钟，从交付...

讨论

尽管最近出现和FDA批准^几个18F标记PET示踪剂，如花贝贝，弗洛贝贝本和长笛元醇，#¹¹C_PiB仍然是淀粉样蛋白成像的黄金标准示踪剂，由于快速的大脑吸收和低非特异性绑定。目前这种示踪剂是通过湿^化学16或使用"干循环"^方法4，17合成的。两种方法都需要HPLC纯化，然后重新配方在水乙醇，这大约需要20-30分钟^{开始#11C_CH}_3OTf。受到先前关于固相的一些报告的启发，^支持了11种C甲基化^技术和[11C]PiB的临床重要性，我们旨在利用廉价的一次性固相萃取（）SPE） 墨盒作为用于反应、纯化和配方的"三联一"实体。

成功生产用于人体体内成像的PET示踪剂最关键的步骤是:1）将放射性同位素纳入示踪分子;2） 分离示踪剂与未反应的放射性和非放射性物种;3） 在生物相容的溶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-OH-BTA-0	ABX 高级生化化合物	5101	[11C]PiB 的非放射性前体
6-OH-BTA-1	ABX 高级生化化合物	5140	[11C]PiB 的非放射性标准
Agilent 1200 HPLC 系统	Agilent	Agilent 1200	分析 HPLC 系统
乙醇无水		432526
类（鲁尔接头，250 和微量;L）	Hamilton	HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120	MZ-Analysentechik GmbH	MZ1440-100040	分析型 HPLC 色谱柱
Perkin Elmer Clarus 480 气			相色谱仪
聚碳酸酯歧管	Scintomics	ACC-101	合成歧管
Restek MTX-蜡柱（30 m，0.53 mm）	Restek	70625-273	分析型气相色谱柱
Scintomics GRP 模块	Scintomics	Scintomics GRP	自动合成装置
Sep-Pak tC18 Plus	Waters	WAT020515	固相萃取柱
耐溶剂萃取装置	Scintomics	ACC-201	合成歧管
脊髓针	BD	405181
无菌延长线	B. Braun	8255059
无菌过滤器	Millipore	SLLG013SL
无菌小瓶 （20mL）	华艺	SVV-20A
无菌水	Baxter	JF7623
Synthra MeIplus Research Synthra MeIplus		Research	[11C]CH3I/[11C]CH3OTf 模块
注射器 （10 mL）	BD	309604
注射器 （1mL）	BD	309659
注射器 （20 mL）	B. Braun	4617207V	分配器 注射器
通气过滤器	Millipore	TEFG02525