固相11C-甲基化、纯化及制剂制备用于生产PET示踪剂

摘要

我们报道了一种高效的碳-11放射性标记技术，该技术利用固相萃取小柱制备适用于临床的正电子发射断层扫描（PET）示踪剂。¹¹C-甲基化试剂通过预装有前体的固相萃取小柱，随后以含水乙醇依次洗脱，即可获得化学纯度和放射化学纯度均较高的PET示踪剂，并具有较高的放射化学产率。

摘要

正电子发射断层扫描（PET）中所用放射性示踪剂的常规生产主要依赖于湿化学法，即放射性合成子在溶液中与非放射性前体发生反应。该方法需要通过高效液相色谱法（HPLC）对示踪剂进行纯化，随后将其重新配制于适用于人体给药的生物相容性溶剂中。我们近期开发了一种新型 ¹¹利用固相小柱作为一次性用品的碳-甲基化方法用于高效合成碳-11标记的PET放射性药物 "三合一" 用于示踪剂的合成、纯化和再配制的单元。该方法避免了制备型高效液相色谱（HPLC）的使用，减少了示踪剂在传输管线中的损失以及因放射性衰变造成的损失。此外，基于小柱的技术提高了合成的可靠性，简化了自动化过程，并有助于符合药品生产质量管理规范（GMP）的要求。本文以正电子发射断层显像（PET）示踪剂匹兹堡化合物B（[¹¹C]PiB）是一种用于活体成像人类大脑中淀粉样斑块的金标准显像剂。

引言

正电子发射断层扫描（PET）是一种分子成像技术，其原理是通过检测与生物活性分子结合的放射性同位素衰变所释放的正电子，从而实现对生物体内生化过程、信号传递及转化的活体可视化。碳-11（t_1/2 = 20.3 分钟）是PET中最常用的放射性同位素之一，因其在有机分子中广泛存在，且半衰期较短，可在同一天对同一人或动物受试者多次给予示踪剂，同时降低患者所受辐射剂量。目前已有多种标记该同位素的示踪剂被用于临床研究和基础健康科学研究中，以实现对经典及新兴生物学相关靶点的活体PET成像——例如用于D₂/D₃受体的[¹¹C]雷氯必利、用于淀粉样斑块成像的[¹¹C]PiB，以及用于转位蛋白成像的[¹¹C]PBR28等。

碳-11标记的PET示踪剂主要通过以下方式生产 通过 ¹¹含羟基（醇、酚和羧酸）、氨基（胺和酰胺）或巯基（硫醇）的非放射性前体的碳甲基化。简言之，该同位素在回旋加速器的气体靶中生成 通过 a ¹⁴N(p,α)¹¹C核反应以[C的化学形式¹¹C]CO₂后者随后被转化为[¹¹C]碘甲烷（[¹¹C]CH₃I) 通过 湿化学法（还原为[¹¹C]CH₃OH与LiAlH₄ 随后用 HI 淬灭¹ 或干化学法（催化还原为[¹¹C]CH₄ 随后使用分子碘进行彻底的碘化反应₂)². [¹¹C]CH₃随后可进一步转化为更具反应活性的 ¹¹C-甲基三氟甲磺酸酯（[¹¹C]CH₃OTf) 通过三氟甲磺酸银柱进行纯化³。该 ¹¹然后通过将放射性气体通入有机溶剂中非放射性前体的溶液，或 通过 更优的受限溶剂 "环" 方法^4,5。该 ¹¹随后通过高效液相色谱法（HPLC）纯化C-示踪剂，重新配制于生物相容性溶剂中，并经无菌滤器过滤后给予人体受试者。由于碳-11的半衰期较短，所有这些操作必须快速且可靠。然而，使用HPLC系统会显著增加示踪剂的损失和生产时间，通常需要使用有毒溶剂，使自动化过程复杂化，并偶尔导致合成失败。此外，反应器和HPLC色谱柱所需的清洗步骤延长了后续批次示踪剂合成之间的间隔时间，并增加了工作人员的辐射暴露风险。

氟-18（t_1/2 = 109.7 分钟），另一种广泛使用的正电子发射断层扫描（PET）同位素，近期已取得进展 通过 基于卡式盒的试剂盒的开发，避免了高效液相色谱（HPLC）纯化的需要。通过使用固相萃取（SPE）小柱，这些完全一次性使用的试剂盒可实现可靠、常规的生产 ¹⁸F-示踪剂，包括[¹⁸F]FDG，[¹⁸F]FMISO, [¹⁸F]FMC 和其他方法相比，具有合成时间更短、人员参与更少以及设备维护需求最低等优势。碳-11 在 PET 成像中仍属于使用较少的同位素，其原因之一是缺乏可用于常规制备的类似试剂盒 ¹¹C-示踪剂。其开发将显著提高合成的可靠性，增加放射化学产率，并简化生产模块的自动化和预防性维护。

目前可用的生产试剂盒利用廉价的一次性固相萃取（SPE）小柱，替代高效液相色谱（HPLC）柱，以实现放射性示踪剂与未反应的放射性同位素、前体以及其他放射性和非放射性副产物的分离。理想情况下，放射性标记反应也在同一根小柱上进行；例如，[¹⁸F]氟甲基化气态[与二甲氨基乙醇的反应¹⁸F]CH₂BrF在前列腺癌成像PET示踪剂生产中的应用¹⁸F]氟甲基胆碱存在于阳离子交换树脂柱中⁶. 尽管存在若干类似的放射性标记程序 ¹¹已有报道称色谱柱上的C-示踪剂^7,8 并特别适用于[¹¹C]胆碱⁹ 和[¹¹C]甲硫氨酸¹⁰，这些示例仍局限于肿瘤学PET示踪剂，其中通常无需从前体中分离。我们近期报道了 "[¹¹C]试剂盒" 用于 [¹¹C]CH₃我¹¹ 以及后续的 ¹¹C-甲基化，以及固相支持合成¹² 在我们致力于简化常规生产的过程中 ¹¹C-示踪剂。在此，我们希望通过固相支持的放射合成[¹¹C]PiB，一种用于Aβ成像的放射性示踪剂，自2003年首次研发以来，彻底改变了阿尔茨海默病（AD）成像领域图1)^13,14。在此方法中，挥发性[¹¹C]CH₃OTf（沸点 100 °C）流经负载在一次性色谱柱树脂上的 6-OH-BTA-0 前体。PET 示踪剂 [¹¹C]PiB 随后通过使用生物相容的水性乙醇从柱 cartridge 中洗脱，实现与前体及放射性杂质的分离。此外，我们对该方法进行了自动化。¹¹C]PiB 的放射性合成采用远程操作的放射化学合成模块及一次性盒式试剂套件完成。具体而言，本实验在配备有注射器驱动装置（分配器）的20阀放射化学合成模块上实施，该装置可适配标准的20 mL一次性塑料注射器，同时配备气体流量控制器、真空泵及压力表。由于该方法操作简便，我们相信其可适用于大多数市售的自动化合成仪，无论是基于盒式卡匣的系统，还是配备固定阀门的设备。该固相支持技术有助于[¹¹C]PiB 的生产符合药品生产质量管理规范（GMP）要求，并提高了合成的可靠性。此处所述技术还减少了放射性合成所需的前体用量，仅使用 "绿色" 生物相容性溶剂，并缩短连续生产批次之间的时间间隔。

方案

1. 缓冲液和洗脱液的制备

1. 将 2.72 g 三水合乙酸钠溶解于 100 mL 水中，配制 0.2 M 乙酸钠溶液（溶液 A）。
2. 将 11.4 mL 冰醋酸溶解于 1 L 水中，配制 0.2 M 乙酸溶液（溶液 B）。
3. 取 50 mL 溶液 A 与 450 mL 溶液 B 混合，根据缓冲液参考中心¹⁵配制 pH 3.7 的乙酸盐缓冲液（缓冲液 1）。使用 pH 试纸或 pH 计检测缓冲液的 pH 值。
4. 将 12.5 mL 无水乙醇与 87.5 mL 缓冲液 1 混合，在 100 mL 瓶中配制 12.5% 的水性乙醇溶液（洗涤液 1）。
5. 将 15 mL 无水乙醇与 85 mL 缓冲液 1 混合，在 100 mL 瓶中配制 15% 的水性乙醇溶液（洗涤液 2）。
6. 将 5 mL 无水乙醇与 5 mL 缓冲液 1 混合，配制 50% 的水性乙醇溶液（最终洗脱液），并用 10 mL 注射器吸取 2.5 mL 该溶液。

2. 将前体物质应用于色谱柱

1. 将 10 mL 水和 5 mL 丙酮依次通过 tC18 小柱，以进行预处理。
2. 用流速为 50 mL/min 的氮气吹扫小柱 1 分钟，使其干燥。
3. 将 2 mg 前体 6-OH-BTA-0 溶解于 1 mL 无水丙酮中。
4. 将带有鲁尔接头的 250 µL 精密玻璃注射器针筒朝下，吸取 100 µL 前体溶液，并在液面上方保留 50 µL 空气垫。取下针头，从 tC18 小柱的雌性接口端缓慢将活塞完全推到底，使前体溶液流入小柱。切勿进一步推动溶液！

3. 设置自动化合成的多通道装置

1. 将标准的5通道一次性分配阀固定在合成模块上，并根据 图2 以及下文的步骤 3.2 - 3.5。
   注意：我们建议使用耐丙酮的歧管（参见 材料表).
2. 端口1有两个位置。将水平入口连接至装有20 mL注射器的自动分配器。将垂直入口连接至盛有洗涤液1的瓶子。
3. 连接产生[的模块的输出¹¹C]CH₃OTf 连接到多通阀的 2 号端口。
4. 在3号和4号端口之间安装装有前体6-OH-BTA-0的tC18柱。
5. 5号端口有两个位置。将水平出口连接至废液瓶，废液瓶容量必须至少为200 mL。将垂直出口连接至无菌小瓶，用于收集示踪剂。 通过 无菌滤器

4. [¹¹C]PiB 的放射性合成

警告：所有涉及放射性同位素的操作必须由具备放射性物质操作资质的人员在铅屏蔽热室中进行。
注意：本方案未涵盖[¹¹C]CO₂ 在回旋加速器中及其转化为[¹¹C]CH₃使用放射化学模块进行OTf标记。这些操作步骤将取决于放射化学实验室的具体设备，不在本方案的范围之内。我们的PET中心配备了一台IBA回旋加速器，可生产以[11C]形式存在的碳-11。¹¹C]CO₂ 通过 的 ¹⁴N(p,α)¹¹C与N的核反应₂/0₂ 气体混合物（99.5:0.5）在气体靶中，以及用于生产[¹¹C]CH₃我 通过 的 "干法" （催化还原为[¹¹C]CH₄ 随后进行彻底的碘化反应。[¹¹C]CH₃OTf 是通过使[¹¹C]CH₃以20 mL/min的流速通过加热至175 °C的三氟甲磺酸银柱。

1. 递送 [¹¹C]CH₃通过2号端口将OTf通入流路系统，并以20 mL/min的流速（由[调控]）通过已装填的tC18小柱¹¹C]CH₃OTf 模块， 通过 端口3和4，并流入废液瓶中，如图所示 图2A.
2. 当放射性物质完全转移并被tC18柱吸附后（通过柱后放射性探测器监测确认），关闭2号端口以停止气体流动。让柱子静置2分钟，以完成反应。
3. 从100 mL瓶中通过1号端口以100 mL/min的速度，将19 mL洗涤液1（见步骤1.4）吸入分配器注射器中，如图所示。 图2B.
4. 从分配器中将18.5 mL洗涤液1通过tC18柱进行洗脱 通过 3号和4号端口，并以50 mL/min的流速流入废液瓶 图2C确保歧管中无气泡，因为气泡可能会降低分离效率。
5. 重复步骤 4.3 和 4.4 共四次，每次吸取并 dispensing 18.5 mL 的洗涤液 1。通过 tC18 的洗涤液 1 总体积为 92.5 mL；然而，根据所使用的特定合成模块，该体积可在 90 - 100 mL 范围内有所变化。
6. 将1号端口的输入管路从洗涤液1切换至洗涤液2（参见步骤1.5）。
7. 重复步骤 4.3 和 4.4 三次，每次吸取并 dispensing 18.5 mL 的 wash 2 溶液。通过 tC18 的 wash 2 溶液总体积为 55.5 mL。然而，根据所使用的特定合成模块，该体积可在 50 – 60 mL 范围内有所变化。
8. 将五号切换阀转向最终小瓶，如图所示 图2D断开分配器的管路，将其连接至含有2.5 mL洗脱液（50%水溶液EtOH，见步骤1.6）和7.5 mL空气的10 mL注射器。
9. 将注射器朝下，手动推动最终洗脱液（2.5 mL）及随后的空气（7.5 mL）通过tC18柱 通过 3号和4号端口以及用于收集示踪剂的无菌小瓶 通过 无菌滤器，如图所示 图2D.
10. 断开空注射器，连接含有10 mL无菌磷酸盐缓冲液（配方未提供，因其可能有所不同）的10 mL注射器，并将全部液体体积如上所述推过tC18柱进入无菌小瓶中（图2D断开注射器，并使用同一注射器注入10 mL空气冲洗管路。
11. 吸取0.7 mL最终示踪剂配方溶液，分别收集用于质量控制程序的样品（0.1 mL）、细菌内毒素检测（0.1 mL）和无菌检测（0.5 mL）。

5. 质量控制程序

警告：每批放射性示踪剂在释放至正电子发射断层扫描（PET）成像场所并用于人体或动物受试者之前，必须经过适当的质量控制程序（QC）。本稿件的作者不对其他中心生产的放射性示踪剂是否符合当地卫生主管部门法规负责。

1. 执行放行前的质量控制程序，必须包括对示踪剂的放射化学鉴定（RCI）、放射化学纯度（RCP）、化学纯度和摩尔活度，以及制剂中残留溶剂含量和pH值的检测。
2. 使用配备紫外检测器（在350 nm处监测）和放射性检测器的反相高效液相色谱（HPLC）系统，测定RCI、RCP、化学纯度和摩尔活度，并采用反相色谱柱。确定6-OH-BTA-0和6-OH-BTA-1的保留时间，并校准仪器以定量各化合物的含量。
3. 使用配备毛细管柱的气相色谱（GC）系统测定残留溶剂含量。确定丙酮和乙醇的保留时间，并校准仪器以定量每种溶剂的含量。
4. 使用配备合适检测卡的卡式读数仪进行细菌内毒素检测。
5. 在合成后至少14天进行样品的无菌分析，以确认无细菌生长；或将在规定时间点采集的无菌样品送至由当地卫生主管部门认证的实验室进行检测。

结果

总结典型的[¹¹C]PiB放射性合成过程：首先将气态的[¹¹C]CH₃OTf通入预装有前体溶液的tC18小柱中（图1）。随后通过依次使用不同浓度的乙醇水溶液洗脱实现反应混合物的分离。首先，12.5% EtOH洗脱大部分未反应的[¹¹C]CH₃OTf和6-OH-BTA-0；接着，15% EtOH去除残留杂质；最后，使用50%乙醇溶液将目标产物[¹¹C]PiB洗脱至无菌小瓶中。随后，示踪剂用无菌磷酸盐缓冲液稀释，并在释放至PET成像中心前经历严格的质控程序。适用于给药的[¹¹C]PiB批次典型的高效液相色谱（HPLC）紫外吸收和放射性检测色谱图如图3所示。

从 [¹¹

讨论

尽管近期出现了多种并获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的 ¹⁸F标记的PET示踪剂，例如florbetapir、florbetaben和flutemetamol，[¹¹C]PiB 由于其快速进入大脑且非特异性结合较低，仍是淀粉样蛋白成像的金标准示踪剂。目前该示踪剂的合成方法为 通过 湿法化学¹⁶ 或使用一个 "干燥环" 方法^4,17两种方法均需经过高效液相色谱纯化，随后在水性乙醇中重新配制，从[开始，整个过程约需20至30分钟¹¹C]CH₃OTf。受先前一些关于固相支持的报道启发 ¹¹C-甲基化技术及其在临床上的重要性¹¹C]PiB，我们旨在开发一种使用廉价的一次性固相萃取（SPE）小柱作为分离手段的该示踪剂放射性合成方法 "三合一" 用于反应、纯化和制剂的实体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-OH-BTA-0	ABX advanced biochemical compounds	5101	[11C]PiB的非放射性前体
6-OH-BTA-1	ABX advanced biochemical compounds	5140	[11C]PiB的非放射性标准品
Agilent 1200 HPLC system	Agilent	Agilent 1200	分析型高效液相色谱系统
乙醇（绝对）	Commercial alcohols	432526
Hamilton 注射器（鲁尔接头，250 µL）	Hamilton	HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120	MZ-Analysentechik GmbH	MZ1440-100040	分析型高效液相色谱柱
Perkin Elmer Clarus 480 气相色谱系统	Perkin Elmer	Clarus 480	气相色谱仪
聚碳酸酯反应装置	Scintomics	ACC-101	合成用反应装置
Restek MTX-Wax 色谱柱（30 m，0.53 mm）	Restek	70625-273	分析型气相色谱柱
Scintomics GRP 模块	Scintomics	Scintomics GRP	自动化合成装置
Sep-Pak tC18 Plus	Waters	WAT020515	固相萃取小柱
耐溶剂反应装置	Scintomics	ACC-201	合成用反应装置
脊髓穿刺针	BD	405181
无菌延长管路	B. Braun	8255059
无菌滤器	Millipore	SLLG013SL
无菌小瓶（20 mL）	Huayi	SVV-20A
无菌水	Baxter	JF7623
Synthra MeIplus Research	Synthra	MeIplus Research	[11C]CH3I/[11C]CH3OTf 合成模块
注射器（10 mL）	BD	309604
注射器（1 mL）	BD	309659
注射器（20 mL）	B. Braun	4617207V	分配用注射器
通气滤器	Millipore	TEFG02525