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方法文章

用于原代肝细胞保存的大体积液滴玻璃化冷冻法

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DOI：

10.3791/60250

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2019年10月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, 2Shriners Hospitals for Children, Boston, 3Department of Surgery, University of Amsterdam

本文内容

摘要

本论文描述了一种用于大量大鼠肝细胞的无冰冷冻保存方法，该方法将原代细胞在低浓度冷冻保护剂中预孵育，然后以大液滴形式进行玻璃化冷冻。

摘要

玻璃化是一种有前景的无冰替代方法，可用于生物样本的经典慢速冷冻（约 1 °C/min）低温保存。玻璃化需要极快的冷却速率，以使水转变为玻璃态，同时避免有害冰晶的形成。尽管使用冷冻保护剂（CPA）预孵育可降低生物样本的临界冷却速率，但通常仍需要较高浓度才能实现玻璃化法的无冰低温保存。因此，玻璃化受到 CPA 毒性的限制，并仅适用于可快速冷却的小样本。最近的研究表明，这些固有局限性可通过大体积液滴玻璃化技术得以克服。利用这一新方法，细胞首先在低细胞内 CPA 浓度条件下进行预孵育。借助快速渗透性脱水，在玻璃化前直接浓缩细胞内 CPA，而无需使毒性 CPA 浓度达到完全平衡。细胞脱水过程在微流控装置中完成，并与连续高通量生成大尺寸液滴的技术集成，随后将液滴投入液氮中实现玻璃化。这种 CPA 毒性最小化的无冰低温保存方法适用于大量细胞，与传统的慢速冷冻低温保存相比，可显著提高肝细胞的存活率和代谢功能。本文详细描述了成功实施大体积液滴玻璃化的实验方法。

引言

肝细胞在冷冻保存后细胞活力和代谢功能的丧失仍然是限制其临床应用的主要问题1,2,3。肝细胞冷冻保存的基准方法是慢速冷冻法，该方法通过将肝细胞预先与冷冻保护剂（二甲基亚砜[DMSO]、葡萄糖和白蛋白）共孵育，随后以受控速率（约1 °C/min）降温至深低温状态4,5。尽管已有大量优化方案被报道，但冷冻保护剂的毒性、冷冻过程中有害的渗透压失衡以及冰晶形成所导致的机械应力，仍是慢速冷冻法的根本性缺陷6,7。

与慢速冷冻相比，玻璃化冷冻的优势在于通过水直接转变为玻璃态的相变过程，完全避免了因冰晶形成造成的损伤6。然而，为了达到纯水的玻璃化转变温度（-137 °C），必须以每秒约一百万摄氏度的冷却速率（即临界冷却速率）进行降温，才能防止在玻璃化转变温度以上形成冰晶8。添加冷冻保护剂（CPA）可降低临界冷却速率，并提高水溶液的玻璃化转变温度9。然而，即使使用高浓度的冷冻保护剂（例如40% v/v DMSO或更高），成功实现玻璃化仍需要快速的冷却速率8,9。

所需的快速冷却速率和高浓度冷冻保护剂（CPA）导致玻璃化冷冻存在两个主要缺点。首先，为了实现快速冷却，样品必须具有较低的热质量。其次，为了避免渗透性损伤，同时达到较高的 CPA 浓度，必须缓慢引入 CPA，并确保细胞内外环境之间充分平衡6。这会延长细胞暴露于有毒 CPA 的时间。综上所述，这些因素使得玻璃化冷冻成为一个繁琐的过程，每次仅限处理少量小体积样品（微升级）。液滴玻璃化冷冻被提出作为克服这些限制的潜在解决方案。通过将含有细胞的极小液滴（纳升级）暴露于液氮中，可显著提高冷却速率，从而大幅降低所需 CPA 浓度10,11,12,13,14。尽管可同时使用多个高频液滴生成喷嘴，但极小的液滴尺寸仍将处理通量限制在每分钟几微升10，因此无法实现对大体积细胞样品的高效玻璃化冷冻，也无法达到每分钟毫升级的更高处理速率。

最近研究表明，通过大体积液滴玻璃化冷冻技术可以克服玻璃化冷冻的这些固有局限性15。这种新方法利用快速渗透性脱水，在玻璃化冷冻前立即提高细胞内冷冻保护剂（CPA）浓度至7.5%（v/v）的乙二醇和二甲基亚砜（DMSO），从而无需使细胞长时间平衡于高浓度有毒CPA环境中。细胞脱水过程在微流控装置中完成，将肝细胞短暂暴露于高浓度细胞外CPA溶液中。尽管该暴露可引起快速的渗透性脱水，但时间过短，高浓度CPA尚不足以扩散进入细胞内。脱水完成后，细胞立即被装载到液滴中，并直接在液氮中进行玻璃化冷冻。该方法避免了细胞内完全摄取高浓度CPA的需求，同时高浓度细胞外CPA使得大体积液滴的玻璃化冷冻成为可能，从而实现高通量冷冻保存，并将CPA毒性降至最低。

与传统的慢速冷冻法相比，液滴玻璃化冷冻技术可改善原代大鼠肝细胞保存后的直接存活率和长期活力，同时改善其形态和代谢功能15。本文提供了原代大鼠肝细胞批量液滴玻璃化冷冻的具体方法学细节。

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方案

本方案所用的原代肝细胞分离工作由美国马萨诸塞州波士顿市麻省总医院细胞资源中心（CRC）完成。动物实验方案（#2011N000111）已获麻省总医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 大体积液滴玻璃化冷冻

  1. 配制玻璃化冷冻溶液。
    1. 将 40 mg 牛血清白蛋白（BSA）加入 17.0 mL 威斯康星大学溶液（UW）中，配制成玻璃化冷冻溶液 1（V1）。使用 0.22 µm 滤器对 V1 溶液进行无菌过滤，并在 4 °C 下保存。
      注意：UW 是一种常用的器官保存液，其成分包括：50 g/L 羟乙基淀粉、35.83 g/L 乳糖酸、3.4 g/L 磷酸二氢钾、1.23 g/L 七水合硫酸镁、17.83 g/L 五水合棉子糖、1.34 g/L 腺苷、0.136 g/L 别嘌呤醇、0.992 g/L 总谷胱甘肽、5.61 g/L 氢氧化钾，以及氢氧化钠用于调节 pH 至 7.4。
    2. 将 7.0 mL UW、6.5 mL 二甲基亚砜（DMSO）、6.5 mL 乙二醇（EG）、40 mg BSA 和 5.48 g 蔗糖混合，配制成玻璃化冷冻溶液 2（V2）。使用 0.22 µm 滤器对 V2 溶液进行无菌过滤。将 3.5 mL 无菌过滤后的 V2 溶液装入 3 mL 注射器中，并在 4 °C 下保存。
      注意：为便于冷冻保护剂（CPA）溶解，溶液的配制量通常大于实际所需量。
  2. 准备批量液滴玻璃化冷冻装置。
    1. 准备混合针时，首先沿混合针外层灰色套管的一侧剪开，然后将其弯曲打开并从混合针上取下。
    2. 将两段 25 mm 的硅胶管分别套在混合针的入口端，并用胶水固定其位置（图 1A）。
    3. 将针切割至 20 mm 长度（即内部混合螺旋的长度），如 图 1A 所示。
      注意：混合针的长度与针内体积成正比，因此可通过调整长度来控制肝细胞暴露于高浓度冷冻保护剂溶液的时间。
    4. 将混合针的截断出口端插入一支 20 G 注射针头中（图 1B）。
      注意：注射针头的尺寸会影响液滴的大小。
    5. 通过高压灭菌对混合针组件进行灭菌。
    6. 将无菌杜瓦瓶装满液氮。在将杜瓦瓶放入无菌超净细胞培养操作台之前，用异丙醇对外表面进行消毒。
      注意：在液滴直接接触液氮的过程中，污染是一个重要考虑因素。尽管在本方案中使用未经灭菌的液氮未出现污染，但如有需要，液氮可通过过滤或辐照处理以确保无菌16。
    7. 将一个外径与液氮杜瓦瓶内径相同的漏斗插入 50 mL 锥形管中，制成液滴收集装置（图 1C−E）。
    8. 使用大号镊子缓慢下压，将液滴收集装置垂直浸入液氮中。确保锥形管在杜瓦瓶底部保持垂直状态（图 1D−E）。
      注意：漏斗应保持插入并置于锥形管上。液氮液面应低于漏斗入口高度 1 cm，如 图 1D 所示。
    9. 通过将注射泵底部的绳子系在细胞培养操作台壁上突出的螺丝上，将注射泵垂直固定在操作台壁上。
    10. 将装有液滴收集装置的液氮杜瓦瓶放置在垂直安装的注射泵下方（图 1E）。
  3. 冷冻保护剂预孵育。
    1. 获得新鲜分离的大鼠肝细胞后，采用台盼蓝排斥法计数原液浓度，并取 4000 万个活细胞。
      注意：悬浮状态下的肝细胞操作必须轻柔，以防止细胞死亡。
    2. 在 50 × g 条件下离心 5 分钟，不启用刹车。
    3. 吸除上清液，并将肝细胞重悬于 3.4 mL V1 溶液中。
    4. 在冰上孵育 3 分钟。
    5. 向肝细胞中加入 150 µL DMSO 和 150 µL EG，轻轻混匀。
    6. 在冰上继续孵育 3 分钟。
    7. 再次向肝细胞中加入 150 µL DMSO 和 150 µL EG，轻轻混匀。
    8. 将 3.5 mL 混合液装入 3 mL 注射器中。
  4. 进行玻璃化冷冻。
    1. 将装有预孵育肝细胞的注射器和装有 V2 溶液的注射器安装到注射泵适配器上。
    2. 在两个注射器上连接雌性鲁尔锁软管接头，并将混合针组件的硅胶管套在接头的卡箍上（图 1F）。
    3. 将整个装置放入注射泵中（图 1E）。
    4. 在最后一次向肝细胞中加入 DMSO 和 EG 后 3 分钟，启动注射泵，流速设为 2 mL/min。
    5. 当所有肝细胞均已加入液氮后，停止注射泵。

2. 冷冻保存

  1. 使用20 G针头在50 mL锥形管盖上刺10个小孔，并用柔性薄膜包裹盖子外部，如图1B所示。此操作可形成一个阀门，使残留的液氮蒸发后得以逸出。
  2. 为收集玻璃化肝细胞液滴，首先从液氮杜瓦瓶中取出漏斗。然后用长镊子将含有液滴的锥形管从液氮中取出，并缓慢倾倒出锥形管中多余的液氮。
  3. 用带孔的盖子盖紧锥形管，并直接将装有玻璃化肝细胞液滴的封闭锥形管放回液氮杜瓦瓶中。
  4. 将锥形管从液氮中转移至液氮气相冷冻罐中。

3. 玻璃化保存肝细胞液滴的复温

  1. 配制复温溶液。
    1. 将 17.13 g 蔗糖溶解于 100 mL DMEM 肝细胞培养基中，制备复温溶液。使用 0.22 µm 滤器对复温溶液进行无菌过滤，并将其预热至 37 °C。
  2. 复温肝细胞。
    1. 从液氮罐中取出装有玻璃化肝细胞的锥形管，并将其置于液氮杜瓦瓶中转移至细胞培养超净台。
    2. 轻轻松开管盖，然后将锥形管放回液氮中。
    3. 将玻璃化肝细胞液滴加入一个空烧杯中，立即加入预热（37 °C）的复温溶液，并立即搅拌 10 秒。
      注意：操作必须迅速，以避免复温过程中发生再冻结。 根据实验需求，可一次性复温少量至全部玻璃化液滴。
  3. 去除复温溶液。
    1. 将含有肝细胞的复温溶液平均分装至两个 50 mL 锥形管中。
    2. 在 4 °C 条件下，以 100 × g 离心 2 分钟，离心时不启用刹车。
    3. 参考锥形管上的刻度标记，吸除上清液，使每管剩余体积为 12.5 mL，然后每管加入 12.5 mL 冰冷 DMEM，将复温溶液稀释至 50%。
    4. 重悬肝细胞，并在冰上孵育 3 分钟。
    5. 每管加入 25 mL 冰冷 DMEM，将复温溶液进一步稀释至 25%。
    6. 在 4 °C 条件下，以 50 × g 离心 5 分钟，离心时不启用刹车。
    7. 吸除上清液，将肝细胞重悬于 2 mL 所需的培养基中用于后续实验。
      注意：如需去除死细胞，可在细胞悬液中采用密度梯度离心法进行纯化。

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结果

采用来自五只不同大鼠肝脏的新鲜分离原代肝细胞，对整体液滴玻璃化保存法与文献中报道的经典慢速冷冻方案4,5进行直接比较。简言之，将肝细胞悬浮于添加了牛血清白蛋白（BSA，2.2 mg/mL）、葡萄糖（333 mM）和二甲基亚砜（DMSO，10% v/v）的UW液中，并使用程序降温仪进行冷冻。经-196 °C保存后，样本在温水浴中解冻。待冰完全融化后，直接稀释DMSO，同时在多个步骤中逐步降低葡萄糖浓度，以减少渗透压损伤。具体操作方案详见其他文献15。保存时间从2至8天不等，每次生物学重复实验中，整体液滴玻璃化保存与慢速冷冻保存的保存时长保持一致，以确保可比性。尽管出于实际考虑也测试了较短的保存时间，但需注意，原代肝细胞在-196 °C条件下可保存数年而 viability 不会下降5。

通过台盼蓝排斥试验（用于测定细胞膜完整性）检测，批量液滴玻璃化保存后肝细胞的直接存活率为...

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讨论

通过慢速冷冻法冻存肝细胞会导致细胞活力和代谢功能下降。玻璃化冷冻为传统冻存方法提供了一种有前景的替代方案，因其完全避免了冰晶损伤9。然而，为降低临界冷却速率，需预先用冷冻保护剂（CPA）进行孵育8。因此，玻璃化冷冻受限于CPA的毒性17，且仅适用于小体积样品。为克服这些限制，本文提出了一种块状液滴玻璃化冷冻方法，可在使用低浓度预孵育CPA的同时实现大量细胞的玻璃化冷冻15。与文献报道的最优慢速冷冻冻存方法相比，该块状液滴玻璃化冷冻可显著提高肝细胞的存活率和代谢功能。本文提供了该块状液滴玻璃化冷冻的完整操作流程，并详细阐述了实验过程中的各项实际操作要点。

该方案中的多个步骤至关重要，需额外注意。使用未灭菌的液氮填充杜瓦瓶可能导致半无菌状态。根据本方案中所述的预防措施，我们在长期胶原三明治培养过程中未发现任何污染。然而，若认为必要，可采取额外的灭菌措施。液氮可通过辐射或过滤方式进行灭菌

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披露

作者声明存在竞争性财务利益。de Vries、Weng、Toner、Tessier 和 Uygun 博士拥有与本研究相关的临时专利申请。Uygun 博士在 Organ Solutions 公司拥有财务利益，该公司致力于开发器官保存技术。所有研究人员的利益均根据麻省总医院（MGH）和 Partners HealthCare 的利益冲突政策进行管理。

致谢

特此致谢美国国立卫生研究院（R01DK096075、R01DK107875 和 R01DK114506）以及美国国防部（DoD RTRP W81XWH-17-1-0680）提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD 一次性 3 mL 带鲁尔锁扣针头注射器Fisher Scientific14-823-435
烧杯Sigma-AldrichCLS1000-250
贝尔策 UW 冷保存液生命之桥BUW-001
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906
Cole-Parmer 雌性鲁尔接头转 1/16" 低剖面半刚性管接头，聚丙烯Cole-ParmerEW-45508-12
低温储存罐 / 液氮罐Chart IndustriesMVE 800
二甲基亚砜Sigma-AldrichD8418
DMEM，粉末，高葡萄糖，丙酮酸钠Life Technologies12800-082
乙二醇Sigma-Aldrich107-21-1
超长镊子Fisher Scientific10-316C
Fisherbrand 高速易读塑料离心管 - 平顶盖Fisher Scientific06-443-18
钓鱼线强度SOFS4-15
液氮Airgas7727-37-9
Masterflex L/S 铂金硫化硅胶管，L/S 14Cole-ParmerEW-96410-14
混匀枪头，适用于 3HPW1格雷格纳3WRL7
Nalgene 聚丙烯粉末漏斗ThermoFisher4252-0100
20 号针头Becton Dickinson（BD）305175
Parafilm M - 柔性薄膜Sigma-AldrichP7793-1EA
剃刀刀片Fisher Scientific12-640
刮刀Cole-ParmerEW-06369-18 
Steriflip 无菌滤器Fisher ScientificSE1M179M6
蔗糖（结晶/ACS认证）Fisher ScientificS5-500
注射泵New Era Pump Systems Inc.NE-1000
Thermo-Flask 台式液氮容器赛默飞世尔科技2122

参考文献

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