本文介绍了一种用于制备和培育CRISPR/Cas9基因组敲除电鱼的实验方案。详细阐述了开展该实验所需的分子生物学操作、繁育条件和饲养要求，适用于一种裸背电鳗目（gymnotiform）和一种长颌鱼科（mormyrid）电鱼，并介绍了通过显微注射技术获得Cas9诱导的F0代插入缺失（indel）幼鱼的方法。
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本文内容
摘要
摘要
在脊椎动物的进化历史中，电感受和电发生能力发生了显著变化。这些独立演化而来的表型表现出高度的趋同性，并共享相同的基本遗传架构。这一现象最典型的例子是 Gymnotiformes（裸背电鳗目）和 Mormyridae（象鼻鱼科），这两个物种丰富的硬骨鱼类支系均能产生并感知微弱的电场，被称为弱电鱼类。自发现弱电鱼类利用电能感知环境和进行交流以来的50年中，越来越多的科学家群体在发育进化、系统与神经回路神经科学、细胞生理学、生态学、进化生物学以及行为学等领域取得了巨大进展。近年来，电鱼的基因组资源迅速增加。这些资源的利用已显著推动了对这些物种中基因型与表型之间关联的理解。然而，目前将基因组数据与弱电鱼类表型数据整合起来的主要障碍在于缺乏有效的功能基因组学工具。本文报告了一套完整的利用内源性DNA修复机制在弱电鱼类中实施CRISPR/Cas9诱变的实验方案。我们通过CRISPR/Cas9靶向钠离子通道基因scn4aa第一外显子中的插入缺失突变（indels）和点突变，证明该方案在象鼻鱼科物种Brienomyrus brachyistius和裸背电鳗目物种Brachyhypopomus gauderio中均同样有效。利用该方案，我们获得了这两个物种的胚胎，并通过基因分型确认了钠离子通道基因scn4aa第一外显子中存在预期的突变。通过电生理记录进一步验证了基因敲除的成功表型：与未注射的体型匹配对照组相比，突变个体的电器官放电幅度显著降低。
引言
在脊椎动物的进化历史中，电感受和电发生能力发生了变化。两个硬骨鱼类类群——骨舌鱼目（Osteoglossiformes）和鲇形目（Siluriformes）——独立地平行演化出了电感受能力，而五个硬骨鱼类谱系（裸背电鳗目 Gymnotiformes、象鼻鱼科 Mormyrids，以及 Astroscopus、Malapterurus 和 Synodontis 属）则独立地平行演化出了电发生能力。这些独立演化出的表型表现出显著的趋同性，且共享一种共同的遗传结构1,2,3。
这一点在两种物种丰富的硬骨鱼类支系——即能够产生和感知微弱电场的裸背电鳗目（gymnotiforms）和长颌鱼目（mormyrids）——所表现出的众多趋同特征上体现得尤为明显，这两类鱼被称为弱电鱼类。自发现弱电鱼类利用电场感知环境并进行交流以来的50年中4，不断壮大的科研群体已在发育演化1,5,6、系统与神经回路神经科学
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方案
本文所述所有方法均已获得密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 选择sgRNA靶点
注意： 步骤 1.1 中提供了人工设计 sgRNA 的方案。该方案已用于 scn4aa 靶点的选择。此外，步骤 1.2 提供了利用 EFISHGENOMICS 网络平台简化此过程的另一种方案。建议用户选择方案 1.2，该方案具备多项自动“检查”功能，可确保为自定义靶点成功设计 sgRNA。
- 设计sgRNA靶点。
- 为生成sgRNA引导寡核苷酸，最好靶向第1个外显子或其他5’端外显子。虽然也可靶向5’非翻译区（5’ UTR），但优先选择靶向5’端编码序列。建议使用基因组信息，但也可利用转录组数据成功设计sgRNA。优先采用包含内含子/外显子边界（基因组数据）或外显子/外显子边界的注释信息。
- 从1.1中的候选基因组序列中搜索符合5’-N(18)-NGG-3’模式的潜在靶序列。此步骤可通过桌面序列分析软件、自定义脚本或手动序列检查自动完成。
- 可使用 Doench 等人的方法对序列进行优先级排序。49 用于评估靶向活性。此外，还可通过BLAST搜索在基因组/转录组数据库中对靶序列进行脱靶结合评估。<....
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结果
如第1节所述，在scn4aa基因的B. gauderio和B. brachyistius外显子1中鉴定了sgRNA靶向位点。sgRNA的制备方法如第2节所述。在成功完成sgRNA筛选与合成后（图1），进行了体外切割实验（图2）。选择在体外具有切割活性的sgRNA用于单细胞显微注射。
成年鱼类经繁殖条件驯化（第4.1节）后，注射促排卵剂（第4.2节），随后进行挤压取卵（B. gauderio），用于第4.4节所述的体外受精（IVF）；或让其自然产卵（B. brachyistius），如第4.3节所述。上述操作在两种鱼类中均获得了单细胞胚胎，用于显微注射。如第5节所述，在单细胞期向胚胎注射1.5−2.0 nL的scn4aa sgRNA/Cas9/酚红复合物（终浓度为65–190 ng/µL sgRNA、450 ng/µL Cas9、1%–10%酚红）。同一窝的卵.......
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讨论
弱电鱼类表型的丰富性，加上近年来基因组学资源的迅速增加，促使人们对弱电鱼类这一模式生物的功能基因组学工具产生了迫切需求。该体系尤其具有吸引力，是因为在多个平行的鱼类谱系中，众多表型性状发生了趋同进化，且这些鱼类易于在实验室中饲养。
本文所述方案展示了CRISPR/Cas9技术在弱电鱼类谱系中的有效性，这些鱼类在进化过程中平行演化出了发电和电感受能力，因此对该模型在表型进化比较基因组学未来研究中的应用前景具有重要意义。
这种简单的方法学仅需基本的分子生物学技能和培训，其基础是广泛用于斑马鱼的Gagnon方案38。值得注意的是，随着技术的发展，目前已有更多用于sgRNA制备的商业试剂盒，以及可合成向导RNA的公司，这使得缺乏分子生物学经验与设备的实验室也能更容易地采用该方案。我们首先注意到，该方法具有较高的诱变效率，可直接对显微注射后的幼体进行表型分析。然而，表型嵌合现象较为显著，这并不罕见，且与文献报道一致41,.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Monica Lucas、Katherine Shaw、Ryan Taylor、Jared Thompson、Nicole Robichaud和Hope Healey在鱼类饲养、数据收集以及早期方案开发方面所做出的杰出贡献。我们还要感谢三位审稿人对本文稿提出的宝贵建议。在认真回应并处理了审稿意见后，我们认为最终成果的质量得到了显著提升。本研究得到了美国国家科学基金会（项目编号#1644965和#1455405）对JRG的资助，以及加拿大自然科学与工程研究理事会DG项目对VLS的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 20 mg/mL RNA级糖原 | 赛默飞世尔科技 | R0551 | |
| 50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
| 带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管 | Sutter Instrument | BF100-58-10 | （外径 1.0 mm，内径 0.58 mm，长度 10 cm） |
| 带有NLS的Cas9蛋白；1 mg/mL | PNA 生物学 | CP01 | |
| Dneasy 血液 & 组织试剂盒 | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i 显微注射仪 | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader 吸头 | Fisher Scientific | 10289651 | |
| 汉密尔顿注射器 | Fisher Scientific | 14-824-654 | 称为 "精密玻璃注射器" 在实验方案中 |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | 称为 "精细任务擦拭" 在实验方案中 |
| MEGAscript T7 转录试剂盒 | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | 用于体外切割实验 |
| OneTaq DNA 试剂盒 | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | 称为 "催产剂" 在实验方案中 |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | 称为 "热塑性塑料" 在实验方案中 |
| 拉管仪 | WPI | SU-P97 | sutter 品牌 |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28106 | |
| 可重复使用的针头——需要定制 | Fisher Scientific | 7803-02 | 定制为 0.7 英寸长；点样式 4，角度 25 |
| T4 DNA聚合酶 | NEB | M0203L | 使用随附的10x NEB缓冲液 |
| 聚四氟乙烯涂层工具 | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | 称为 "聚四氟乙烯" 在实验方案中 |
参考文献
- Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
- Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M.
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