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方法文章

沉默电火花：利用CRISPR/Cas9在弱电鱼中进行基因组编辑

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DOI：

10.3791/60253

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2019年10月27日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology, Michigan State University, 2Faculty of Life Sciences, Unit of Biology and Ecology of Fishes, Humboldt University, 3Department of Biology, Cape Breton University

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于制备和培育CRISPR/Cas9基因组敲除电鱼的实验方案。详细阐述了开展该实验所需的分子生物学操作、繁育条件和饲养要求，适用于一种裸背电鳗目（gymnotiform）和一种长颌鱼科（mormyrid）电鱼，并介绍了通过显微注射技术获得Cas9诱导的F0代插入缺失（indel）幼鱼的方法。

摘要

在脊椎动物的进化历史中，电感受和电发生能力发生了显著变化。这些独立演化而来的表型表现出高度的趋同性，并共享相同的基本遗传架构。这一现象最典型的例子是 Gymnotiformes（裸背电鳗目）和 Mormyridae（象鼻鱼科），这两个物种丰富的硬骨鱼类支系均能产生并感知微弱的电场，被称为弱电鱼类。自发现弱电鱼类利用电能感知环境和进行交流以来的50年中，越来越多的科学家群体在发育进化、系统与神经回路神经科学、细胞生理学、生态学、进化生物学以及行为学等领域取得了巨大进展。近年来，电鱼的基因组资源迅速增加。这些资源的利用已显著推动了对这些物种中基因型与表型之间关联的理解。然而，目前将基因组数据与弱电鱼类表型数据整合起来的主要障碍在于缺乏有效的功能基因组学工具。本文报告了一套完整的利用内源性DNA修复机制在弱电鱼类中实施CRISPR/Cas9诱变的实验方案。我们通过CRISPR/Cas9靶向钠离子通道基因scn4aa第一外显子中的插入缺失突变（indels）和点突变，证明该方案在象鼻鱼科物种Brienomyrus brachyistius和裸背电鳗目物种Brachyhypopomus gauderio中均同样有效。利用该方案，我们获得了这两个物种的胚胎，并通过基因分型确认了钠离子通道基因scn4aa第一外显子中存在预期的突变。通过电生理记录进一步验证了基因敲除的成功表型：与未注射的体型匹配对照组相比，突变个体的电器官放电幅度显著降低。

引言

在脊椎动物的进化历史中，电感受和电发生能力发生了变化。两个硬骨鱼类类群——骨舌鱼目（Osteoglossiformes）和鲇形目（Siluriformes）——独立地平行演化出了电感受能力，而五个硬骨鱼类谱系（裸背电鳗目 Gymnotiformes、象鼻鱼科 Mormyrids，以及 Astroscopus、Malapterurus 和 Synodontis 属）则独立地平行演化出了电发生能力。这些独立演化出的表型表现出显著的趋同性，且共享一种共同的遗传结构1,2,3。

这一点在两种物种丰富的硬骨鱼类支系——即能够产生和感知微弱电场的裸背电鳗目（gymnotiforms）和长颌鱼目（mormyrids）——所表现出的众多趋同特征上体现得尤为明显，这两类鱼被称为弱电鱼类。自发现弱电鱼类利用电场感知环境并进行交流以来的50年中4，不断壮大的科研群体已在发育演化1,5,6、系统与神经回路神经科学7,8,9,10、细胞生理学11,12、生态学与能量学13,14,15,16,17、行为学18,19以及宏观演化3,20,21等领域获得了极为丰富的科学见解。

近年来，针对电鱼的基因组、转录组和蛋白质组资源迅速增多1,22,23,24,25,26,27,28。这些资源的应用已经为理解这些物种中基因型与表型之间的关联提供了重要见解1,2,3,28,29,30。目前将基因组数据与弱电鱼类表型数据整合的主要障碍在于缺乏有效的功能基因组学工具31。

其中一种工具是近期开发的成簇规律间隔短回文重复序列与Cas9核酸酶配对的技术（CRISPR/Cas9，简称CRISPR）。CRISPR/Cas9是一种基因组编辑工具，已在模式生物32,33,34和非模式生物35,36,37中得到广泛应用。CRISPR/Cas9技术已发展到这样一个阶段：任何具备基本分子生物学条件的实验室均可通过非克隆方法以较低成本轻松制备针对特定基因的短向导RNA（sgRNA）探针38。相较于其他基因敲除或基因沉默策略（如吗啉代寡核苷酸39,40、转录激活因子样效应物核酸酶 (TALENs)以及锌指核酸酶（ZFNs）），CRISPR具有显著优势，后者的每个靶基因都需要耗费高昂成本且耗时较长的构建过程。

CRISPR/Cas9 系统通过靶向基因组中的特定区域来实现基因敲除，该过程由 sgRNA 序列引导，并造成双链断裂。细胞会识别该双链断裂，并优先通过非同源末端连接（NHEJ）途径激活内源性 DNA 修复机制。该修复途径具有高度的错误倾向性：在修复过程中，DNA 分子常在双链断裂位点引入插入或缺失（indels）。这些 indels 可能导致基因功能丧失，原因包括：(1) 开放阅读框发生移码，(2) 引入提前终止密码子，或 (3) 基因产物关键一级结构发生改变。在本实验方案中，我们利用 CRISPR/Cas9 编辑技术，在弱电鱼类物种中通过 NHEJ 途径靶向目标基因的点突变。尽管该诱变方法比其他技术更简单且高效，但预期在 F0 代个体中会产生不同程度的表型严重性，这归因于基因嵌合性41,42,43,44。

生物体的选择
为了促进未来对弱电鱼类比较基因组学的研究，需要为裸背电鳗目（gymnotiforms）和长颌鱼科（mormyrids）分别选择一个代表性物种用于实验方案的开发。在2016年于乌拉圭蒙得维的亚举行的电鱼会议期间经过讨论后，学界达成共识，优先选用已在实验室条件下实现繁殖且具备基因组资源的物种。裸背电鳗目 Brachyhypopomus gauderio 和象鼻鱼 Brienomyrus brachyistius 符合这些标准的物种被选中。在这两个物种中，诱导和维持繁殖条件的自然信号在圈养环境中均易于模拟。 B. gauderio一种来自南美洲的裸背电鳗目物种，具有较低的饲养要求：可在相对较小（4 L）的水族箱中以较高密度饲养。 B. gauderio 在人工饲养条件下也具有较快的世代更替速度. 在实验室条件下， B. gauderio 大约4个月即可从卵发育为成虫。

B. brachyistius 是一种来自西中非的 Mormyridae 科鱼类，在人工饲养条件下易于繁殖。B. brachyistius 可通过观赏鱼贸易 readily 获得，已被广泛应用于多项研究，目前已有多种基因组资源可供使用。其生命周期为 1−3 年，具体时长取决于实验室条件。该物种的饲养要求相对较高，由于其在繁殖期间具有攻击性，需使用中等尺寸的水族箱（50−100 L）。

研究其他种类电鱼的实验室，只要该物种可进行繁殖，并能收集单细胞胚胎且将其培育至成年，便应能轻松地采用本方案。不同物种在饲养条件、幼体培育以及体外受精（IVF）率方面可能会有所差异；然而，本方案可作为其他弱电鱼类繁殖尝试的起点。

概念验证的理想基因靶点：scn4aa
弱电鱼类中的 Mormyridae（象鼻鱼科）和 Gymnotiformes（裸背电鳗目）通过放电一种称为电器官的特化器官来产生电场（发电）。电器官放电（EOD）源于电器官细胞（称为电细胞）同时产生动作电位。EOD 被皮肤中的一系列电感受器检测，从而形成对鱼类周围环境的高分辨率电图像45。弱电鱼类还能够检测同种个体 EOD 波形的特征18以及其放电频率46，使得 EOD 除了具有感知功能外，还可作为类似鸟类鸣叫或蛙类鸣声的社会交流信号47。

在骨舌鱼目和裸背鱼目弱电鱼类的发电细胞中，动作电位产生的一个主要组分是电压门控钠通道NaV1.42。非发电硬骨鱼类表达两个旁系同源基因拷贝scn4aa和scn4ab，编码电压门控钠通道NaV1.430。在裸背鱼目和骨舌鱼目弱电鱼类的进化谱系中，scn4aa基因均经历了快速演化，并发生了大量影响其动力学特性的氨基酸替换48。最重要的是，在这两个谱系中，scn4aa基因的表达均已特异性地局限于电器官2,3。scn4aa在电器官中的相对特异表达及其在放电波形（EOD）产生中的关键作用，使其成为CRISPR/Cas9基因敲除实验的理想靶点，因其几乎不会产生有害的多效性影响。由于弱电鱼类在受精后6−8天（DPF）即开始使用幼体电器官放电，因此针对scn4aa的基因操作非常适合在胚胎显微注射后进行快速表型分析。

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方案

本文所述所有方法均已获得密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 选择sgRNA靶点

注意： 步骤 1.1 中提供了人工设计 sgRNA 的方案。该方案已用于 scn4aa 靶点的选择。此外，步骤 1.2 提供了利用 EFISHGENOMICS 网络平台简化此过程的另一种方案。建议用户选择方案 1.2，该方案具备多项自动“检查”功能，可确保为自定义靶点成功设计 sgRNA。

  1. 设计sgRNA靶点。
    1. 为生成sgRNA引导寡核苷酸，最好靶向第1个外显子或其他5’端外显子。虽然也可靶向5’非翻译区（5’ UTR），但优先选择靶向5’端编码序列。建议使用基因组信息，但也可利用转录组数据成功设计sgRNA。优先采用包含内含子/外显子边界（基因组数据）或外显子/外显子边界的注释信息。
    2. 从1.1中的候选基因组序列中搜索符合5’-N(18)-NGG-3’模式的潜在靶序列。此步骤可通过桌面序列分析软件、自定义脚本或手动序列检查自动完成。
    3. 可使用 Doench 等人的方法对序列进行优先级排序。49 用于评估靶向活性。此外，还可通过BLAST搜索在基因组/转录组数据库中对靶序列进行脱靶结合评估。
    4. 确保能够设计出扩增目标序列两侧的标准PCR引物。引物应位于切割位点（NGG序列上游三个碱基）两侧至少20 bp处。理想情况下，PCR产物长度应为150−200个碱基对（bp）。
    5. 使用以下模板设计符合上述标准的寡核苷酸，该模板包含位于N上游的T7启动子（5’端）18）以及一个互补区域（N 的 3’端18）用于与恒定寡核苷酸（1.1.6）退火：5’-TAATACGACTCACTATAGG-N18-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’
      注意： 的 N18 序列不包含NGG原间隔序列邻近基序（PAM）序列。请勿将其包含在寡核苷酸中。
    6. 订购恒定寡聚体（表1用于合成所有sgRNA、sgRNA靶点的寡核苷酸（步骤1.1.5）以及PCR引物（步骤1.1.4）的寡核苷酸，均通过寡核苷酸合成服务以标准脱盐级别制备。寡核苷酸和PCR引物可直接订购为标准脱盐产物，无需额外纯化。
  2. 执行sgRNA靶点的自动化设计。
    1. 利用基因组数据选择目标基因。若已知外显子/内含子边界，也可使用转录组数据。可通过 EFISHGENOMICS 门户网站（http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu）鉴定目标序列。理想的目标应位于第一外显子内；然而，其他5’端外显子和5’非翻译区也可作为候选区域。
    2. 一旦确定目标序列，加载可免费使用的 EFISHGENOMICS CRISPR 网络工具（http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/）。该网络工具采用定制版本的 CRISPOR 算法生成目标序列50,51.
    3. 在方框中 步骤 1输入序列名称，并将目标序列填入相应的输入框中。
  3. 选择序列所来源的适当基因组。目前，可获取的基因组数据包括 B. brachyistius 和 B. gauderio使用此工具无需基因组序列，但基因组序列有助于评估潜在的非靶向效应。
  4. 选择合适的PAM序列。推荐使用20 bp-NGG PAM，但具体可选的PAM序列有多种，取决于所用的Cas9蛋白。
  5. 系统将生成一份报告，显示目标序列在基因组中的位置及推荐的向导序列。选择三个预测脱靶效应低、特异性评分高且效率评分高的靶点。左侧以绿色高亮显示得分最高的向导序列。应尽量避免选择以黄色和红色高亮的向导游戏副本
  6. 点击选定的目标序列可生成一份全面的 CRISPOR 报告。该报告中的关键信息用于“通过重叠寡核苷酸进行 T7 体外表达”。从该报告中提取以下信息：推荐的 sgRNA 寡核苷酸序列、目标位点的 PCR 引物，以及一条用于合成所有 sgRNA 的恒定寡核苷酸。
  7. 从寡核苷酸生产服务公司订购所选的寡聚体（步骤1.6）。寡聚体和PCR引物可订购为标准脱盐级别产品，无需额外纯化。

2. 生成sgRNA

  1. 在PCR管中退火寡核苷酸：加入1 µL 100 µM的恒定寡核苷酸、1 µL 100 µM的sgRNA特异性寡核苷酸，以及8 µL无核酸酶的H2O
  2. 在热循环仪中进行寡核苷酸退火，程序如下：95 °C加热5分钟，以-2 °C/s速率降温至85 °C，再以0.1 °C/s速率降温至25 °C，最后在4 °C保温。
  3. 为生成sgRNA模板，向第2.2步退火后的寡核苷酸混合物中加入2.5 µL dNTP混合液（10 mM）、2 µL 10×缓冲液、0.5 µL T4 DNA聚合酶和5 µL无核酸酶的H2O。在12 °C孵育20分钟。
  4. 按照制造商说明书，使用PCR纯化柱对模板进行纯化。
  5. 用20–30 µL洗脱液洗脱。使用分光光度计估计浓度和纯度。模板浓度应为100–200 ng/µL，A260/280比值为1.8–1.9。
  6. 通过琼脂糖凝胶电泳验证，上样量为1–5 µL。主条带应为120 bp。代表性结果见图1A。
  7. 将经凝胶验证的sgRNA模板储存于-20 °C（长期）或4 °C（短期，1–4周）。
  8. 使用T7 RNA转录试剂盒在室温下进行sgRNA转录：向1.5 mL微量离心管中加入8 µL dNTP混合液（dA、dT、dG、dC等体积混合）、2 µL 10×缓冲液（室温）、2 µL T7 RNA聚合酶、100−200 ng sgRNA模板，以及无核酸酶的H2O，总体积为20 µL。短暂离心使液体沉至管底。在37 °C孵育2–4小时。
  9. 加入1 µL DNase，于37 °C额外孵育15分钟。
    1. 通过以下步骤纯化sgRNA：向转录产物中加入1 µL糖原、30 µL无核酸酶的H2O、30 µL 5 M醋酸铵和180 µL 100%乙醇。充分混匀，于-80 °C至少孵育20分钟（直至冻结）或于-20 °C过夜。在4 °C以最大转速离心15分钟。
  10. 小心移除并弃去上清液，避免扰动沉淀，然后加入1 mL用-20 °C预冷的无RNase 70%乙醇洗涤。在4 °C以最大转速再离心5分钟。
  11. 小心移除并弃去上清液，避免扰动沉淀，将沉淀在空气中干燥5分钟。
  12. 用30 µL无核酸酶的H2O重悬沉淀，并通过紫外分光光度法测定纯度和产量（最低产量为200 ng/µL）。
  13. 在无RNase的凝胶上检测sgRNA的存在。由于二级结构的存在，sgRNA在50–150 bp范围内呈现两条带（图1B）。
  14. 分装为每管3 µL，储存于-80 °C。

3. 体外验证切割效率

  1. 使用商业DNA提取试剂盒从目标物种中提取基因组DNA。由于组织可再生，因此可使用腹部鳍条剪取样，而无需牺牲鱼类。
  2. 使用步骤1.6和1.7中设计的引物，通过标准PCR扩增目标DNA区域。通过凝胶电泳验证扩增产物。建议对扩增片段进行测序以确认目标区域被正确扩增，但并非必需。代表性结果如下 scn4aa 模板如图所示 图2.
  3. 使用已建立的实验室或公司方案纯化PCR片段。
  4. 将扩增的DNA在-20 °C保存。建议分装成小份，以减少冻融循环次数。
  5. 确定每种组分所需的量和体积。建议设置阴性对照（分别排除sgRNA或Cas9）、阳性对照（使用先前已验证可切割目标PCR扩增DNA的sgRNA，若有），以及sgRNA的浓度梯度系列。
  6. 在室温下，按以下顺序于PCR管中配制反应体系，为获得最佳效果，最后加入sgRNA和Cas9蛋白：50–100 ng目标DNA的PCR产物、1 µL 10×缓冲液3、1 µL 10× BSA（0.1 g/mL）、50–200 ng Cas9蛋白（1 mg/mL，建议使用150 ng）和30–200 ng sgRNA（建议使用100 ng）。
    1. 在37 °C下孵育反应1小时，然后在65 °C下孵育10分钟以灭活Cas9蛋白。
    2. 将整个样品连同阳性和阴性对照一起在2%–3%琼脂糖凝胶上电泳（预期条带大小为30–200 bp）。成功切割的样本可能仍保留部分PCR产物，同时出现两条较小的条带。代表性结果如下图所示 图2.

4. 获取胚胎

注意：获取弱电鱼类的胚胎可能具有挑战性。成功开展繁殖项目的关键在于仔细监测水质、为鱼类护理提供充足的时间以及定期喂食。鱼类必须首先经过数周的驯化以促进繁殖52，具体方法见方案步骤4.1。在此之后，本文提供了促进自然配子发生的方案（4.2），用于自然产卵行为（4.3），以及一种近期开发的体外技术方案，可用于获得精确计时的胚胎（4.4）。方案4.3对B. brachyistius和B. gauderio均有效，而方案4.4在B. gauderio中效果更优。

  1. 亲鱼培育
    1. 将短鳍弓背鱼（B. brachyistius）以成对或小群体（100–150 L 水族箱）方式饲养，或在非常大的水族箱中（约 475 L 水族箱中饲养 2 条雄鱼和 5–6 条雌鱼），因为它们在繁殖条件下会变得极具攻击性。每条鱼应至少配备 1–2 根 PVC 管作为庇护所（图 3A、B）。
    2. 高体弓背鱼（B. gauderio）可高密度饲养。在 100 L 水族箱中最多可饲养 8 条个体（2 条雄鱼和 6 条雌鱼）。每条鱼应至少配备 1 根 PVC 管作为庇护所。添加缠绕的纱线可增加环境丰富度和藏身之处。在水族箱顶部添加带有直径 1 cm 孔洞的 50 mL 离心管，以便成鱼自然将卵产入管中（图 3C）。
    3. 在繁殖季节，每天投喂新鲜的黑纹虫，并辅以冷冻的血虫。可根据需要在食物中添加维生素和营养补充剂。
    4. 正常情况下，将鱼饲养在电导率相对较高（300–600 µS）、pH 值平衡的水体中。在繁殖季节，通过 1–3 周时间逐步将电导率至少降低一半，以诱导性腺再发育和产卵。通过每日添加反渗透（RO）水来降低电导率，并在低电导率时密切注意 pH 值（pH <6）。
    5. 繁殖条件可维持约 3–5 个月，期间产卵量逐渐减少。此后，用 1–3 周时间缓慢将鱼恢复至高电导率环境。再维持 3 个月高电导率后，方可再次进入繁殖条件。
  2. 使用促排卵剂（SGnRHa + 多潘立酮）注射
    1. 在繁殖条件下识别外观怀卵的雌鱼（图 4）。在 B. gauderio 中，雌鱼泄殖腔后方的性腺会肿胀；B. brachyistius 雌鱼腹部膨大，体形显得较深（图 4A）。雄鱼通常无精子生成问题，但优先选择体型较大的个体，因其可收集到更多的精液量。
      注意：促排卵剂是一种商业激素混合物，可促进配子成熟并协调产卵行为。若鱼此前已接受过促排卵剂注射，两次注射之间应间隔至少 >4 周，并保证充分喂养。建议至少注射 2 条雄鱼和 4–5 条雌鱼，以确保获得数批卵子和充足的精子。
    2. 用 MS-222（0.4 g/3 L）麻醉鱼数分钟，直至其无法维持体位、静止不动，但仍有鳃盖运动（II 期53）。
    3. 称量鱼体质量（g），计算促排卵剂用量（0.5 µL/g + 0.5 µL）。额外的 0.5 µL 用于补偿移液误差。
    4. 将促排卵剂加入 4 倍体积的缓冲液（1× PBS 或 DPBS）中，置于 PCR 管内并充分混匀。溶液将变得浑浊。建议先将促排卵剂滴加至热塑性材料表面，再用移液器量取计算剂量。由于促排卵剂黏稠，务必确保完全排出全部剂量，并小心操作移液。
    5. 将注射液滴加至热塑性材料表面，用精密玻璃注射器吸取，避免产生气泡。推荐使用 28 G、长度 19–25 mm、斜面针头。
    6. 以平稳速度将溶液注入背部躯干肌肉。针头停留 2–4 秒后拔出。立即将鱼放入新鲜系统水中恢复。
    7. 约 24 小时后准备收集胚胎（见 4.3 或 4.4）。准备好所有必要材料，包括单细胞显微注射所需物品（见第 5 节）。
  3. 通过自然产卵获取胚胎
    1. 将注射促排卵剂后的成鱼（4.2）置于大型 450 L 水族箱中。最有效的性别比例通常为 1–2 条雄鱼和 3–4 条雌鱼，提供足够的 PVC 管作为藏身处，并在水族箱底部铺设深色玻璃珠基质，以防止鱼吞食卵子。与 B. gauderio 相比，玻璃珠对 B. brachyistius 更为重要，后者更倾向于将黏性卵产在缝隙或如上所述的 50 mL 离心管中。
    2. 将鱼置于反向光照周期中，使夜间产卵与常规实验室工作时间相匹配。使用市售消费级安防系统，通过红外照明远程监控鱼的行为，以尽量减少干扰（图 3）。
    3. 鱼通常在促排卵剂注射后约 24 小时的黑暗光周期内自发产卵。
    4. 产卵开始后，在产卵行为持续期间每小时收集一次卵子。B. brachyistius 的卵子可用小直径虹吸管配合细棉网收集，以尽量减少对新产卵子的损伤。B. gauderio 的卵子则从 50 mL 离心管或水族箱基质中收集。使用低强度红光头灯操作，以最小干扰高效完成工作。由于首次卵裂约在受精后 1 小时（HPF）发生，大部分卵子适合进行单细胞显微注射。
    5. 立即进行显微注射（见第 5 节）。
  4. 挤压雄鱼进行 B. gauderio 的体外受精
    1. 按《斑马鱼手册》54 所述配制精子稀释液（SES）：10 mM HEPES、80 mM KCl、45 mM NaCl、45 mM 醋酸钠、0.4 mM CaCl2 和 0.2 mM MgCl2。
      1. 用 ddH2O 定容，并用 1 M NaOH 调节 pH 至 7.7。
      2. 置于冰箱中保存。
      3. 使用前经 0.22 µm 滤膜过滤。
    2. 用 MS-222（0.4 g/3 L）麻醉鱼数分钟，直至其无法维持体位、静止不动，但仍有鳃盖运动（II 期53）。将 500 µL 的 SES 分装至冰上预冷。
    3. 彻底擦干手和鱼体，尤其是头部和泄殖腔区域。将鱼腹面朝上、头端朝左（适用于右利手操作者）放置于聚苯乙烯泡沫/海绵支架上，支架表面覆盖浸有 MS-222 的湿润纸巾。鱼头应尽可能与桌面平行。
      注意：步骤 4.4.4–4.4.6 应尽快完成，鱼离水时间应控制在 30–60 秒内。
    4. 从尾部向头部方向施加压力，轻轻从中部向泄殖腔挤压性腺区域。鱼可能排出废物。若有废物排出，需小心用精细擦拭纸清洁泄殖腔。切勿将废物与精子一同收集。根据雄鱼体型不同，通常可收集 10–60 µL 精液。
    5. 使用带吸头的微量移液器，当精子被挤出时，以 50 µL 为增量小心收集。立即将精子直接加入冰上预冷的 500 µL SES 分装液中。可由另一位研究人员协助收集精子，一人挤压，一人收集。精子应尽快使用，但在至少 1 小时内仍保持活性。
    6. 收集完成后立即将鱼放回新鲜系统水中恢复。鱼离水时间应控制在 30–60 秒内。
  5. 挤压雌鱼进行 B. gauderio 的体外受精
    1. 用 MS-222（0.4 g/3 L）麻醉鱼数分钟，直至其无法维持体位、静止不动，但仍有鳃盖运动（II 期53）。在工作台上铺设聚四氟乙烯片。
      注意：步骤 4.5.1–4.5.5 应尽快完成，鱼离水时间应控制在 30–60 秒内。
    2. 彻底擦干手、工具、聚四氟乙烯片和鱼体，尤其是头部和泄殖腔区域。将鱼侧放，头端朝前（适用于右利手操作者）。
    3. 从尾部向头部方向施加压力，轻轻从中部向泄殖腔挤压性腺区域。鱼可能排出废物。若有废物排出，需小心用精细擦拭纸清洁泄殖腔。根据鱼体大小，通常可获得 20–150 枚卵子。使用聚四氟乙烯涂层的刮刀/工具小心收集从泄殖腔挤出的卵子。迅速将卵子转移至小型培养皿中并加盖。确保此过程中卵子保持干燥。或者，在挤压后将卵团轻触小型培养皿底部或聚四氟乙烯片表面，使其自然附着。
    4. 收集完成后立即将鱼放回新鲜系统水中恢复。
  6. 进行 B. gauderio 的体外受精
    1. 将充分混匀的 100 µL 精子 SES 悬液直接滴加至卵团上方。
    2. 加入 1 mL 经 0.22 µm 滤膜过滤的系统水，充分混合 30–60 秒。
    3. 再加入额外 1–2 mL 系统水（培养皿中留出一定空间），放入培养箱。在培养皿上记录体外受精时间，并置于 29 °C 培养箱中。设定 50 分钟计时器以检查发育进展（例如动物极单细胞形成，见 图 6）。在此期间，准备显微注射所需材料。

5. 单细胞显微注射

  1. 在进行显微注射（步骤 4.2）或自然产卵（步骤 4.3）之前，预先拉制显微注射针。使用带内丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.0 mm，内径 0.58 mm，长度 10 cm）和拉针仪来拉制显微注射针。每种计划的注射处理需准备 2–4 根注射针。
    注意：推荐使用带内丝的后向装样针头，因为内丝可将溶液虹吸至针尖并消除气泡。然而，也可使用无内丝的针头，前向装样对实验结果应无影响。针头应具有较长但坚固的锥形结构。可将以下参数作为拉针程序的起始设置：加热温度 = 500；拉力 = 70；速度 = 70；时间 = 100。代表性针头形态见图 5A。
  2. 配制注射溶液并准备针头。
    1. 在 PCR 管中加入 0.9 µL sgRNA 和 0.9 µL Cas9 酶（1 mg/mL），再加入 0.2 µL 10% 或 100% 酚红溶液（分别得到终浓度为 1% 和 10% 的酚红）。充分混匀后置于冰上静置 2−5 分钟，使 sgRNA 与 Cas9 形成复合物。计算注射溶液中 sgRNA、Cas9 和酚红的终浓度。
      注意：若使用上述配方出现针头堵塞或切割效率低的问题，可尝试加入 1× 终浓度的盐/缓冲液混合物，以稳定 Cas9 并防止针头堵塞。
    2. 使用微量加样器吸头将 2 µL 溶液从针尾装入显微注射针中，并尽可能将液体排至针尖附近。
    3. 将针头装入显微操作仪，并设定压力参数（初始设置建议为：775 pi，0.1−0.2 秒，8–12 pc）。
    4. 在显微镜下，用一对精细镊子以斜面角度折断针尖。折断位置应靠近针头开始变硬的锥形起始处。建议先靠近针尖处折断，测试注射液滴大小，必要时再进一步折断。针孔应尽可能小，同时保持针尖锥形部分足够坚固（图 5A）。
    5. 使用矿物油和千分尺测量注射液滴体积。通常使用 1–2 nL；直径 0.1 mm 对应 0.5 nL。
    6. 调整针尖或压力参数，使注射体积符合设定要求。
  3. 识别正在发育的受精卵并准备注射平台。搭建注射平台：取一个直径 100 mm 的培养皿，将底部倒置，置于同样倒置的盖子下方。将一块玻璃载玻片放置在倒置的盖子上。根据显微操作仪在显微镜上的安装方式，倒置底座带来的额外高度可能并非必需。
    1. 观察发育中的卵子，在体外受精（IVF）后 50–60 分钟识别假定已受精的合子。动物极将开始形成，卵黄与动物细胞交界处周围会出现过量的小脂滴（图 6）。
    2. 使用塑料移液管（略微剪切管尖以便卵子通过）尽可能少地带水收集 10–20 枚卵，将其放置在载玻片边缘。水分会被虹吸至载玻片下方，并将卵子拉向边缘。
    3. 使用精细擦拭纸轻轻按压载玻片，去除多余水分，使卵子牢固附着于载玻片边缘。应保留刚好足够的水分以保持卵子湿润，同时尽量减少残留水分，避免注射过程中卵子移动。
  4. 直接注射至单细胞中。
    1. 将卵子垂直排列紧贴载玻片边缘，使其方向与进针方向垂直（图 5B）。
    2. 使用显微操作仪将针头对准卵膜。以约 45° 角将针头插入卵膜，随后进入单细胞。可通过卵黄部分进入单细胞。在注射过程中，一手自由移动注射平台，另一手操控显微操作仪，有助于更好地控制操作（图 5B）。
    3. 将 sgRNA/Cas9/酚红溶液注射入单细胞中，小心撤出针头。继续处理下一枚卵子，重复步骤 5.4.1–5.4.3，直至所有卵子完成注射。
    4. 用精细镊子移除注射过程中破裂的卵子。使用装有 0.22 µm 滤膜过滤系统水的喷瓶，轻轻将卵子从注射平台冲洗至新的直径 100 mm 培养皿中。
    5. 重复步骤 5.3.3–5.4.6，直至所有卵子完成注射或已发育至二细胞期。务必预留约 20 枚假定已受精的卵子作为未注射对照组，用于评估受精率和注射成功率。对于较大的产卵批次，可选择已发育至二细胞期的未注射胚胎作为对照；对于较小的产卵批次，则预留假定已受精的卵子。
    6. 此外，可设置 sgRNA/注射对照组：将 15–25 枚胚胎注射 Cas9 与针对基因组中不存在基因的 sgRNA 复合物。对于野生型胚胎，推荐使用靶向 GFP 基因的 sgRNA。在每个培养皿上记录卵子数量、亲本信息、体外受精时间及日期，并注明 sgRNA 靶标或标记为“未注射”。将培养皿转移至 29 °C 培养箱中。

6. 动物饲养

  1. 卵的护理。
    1. 注射后4–6小时检查卵的存活率。
    2. 记录死亡卵的数量，以及未受精卵的数量。未受精卵通常在八细胞期停止发育，并在动物极形成细胞的玫瑰花状排列（图6）。根据死亡卵的数量及水中卵碎片的多少，更换50%–80%的水，并补充过滤后的系统用水。若培养皿底部形成细胞碎片膜或生物膜，可轻轻刷洗皿底以保持清洁。
    3. 在接下来的2–3天内，每天检查卵1–2次。每次检查卵时均需重复步骤6.1.2–6.1.3。
    4. 2–3天后幼鱼将开始孵化。幼鱼孵化时应及时清除所有卵壳。可使用移液器轻柔吹打，帮助半孵化的幼鱼完全脱离卵壳。
  2. 幼鱼的护理。
    1. 每天检查卵1–2次。每次检查幼鱼时均需重复步骤6.1.2–6.1.3。
    2. 在6–14日龄（DPF）期间，向幼鱼投喂醋线虫。投喂量可略多于需求，因为醋线虫可在培养皿中存活较长时间。每次检查和清洁培养皿时均应补充醋线虫。
    3. 在11–14日龄期间，除醋线虫外，每尾幼鱼还需额外添加5–10只新孵化的Artemia。此阶段幼鱼将逐渐学会摄食自由游动的Artemia。
    4. 在15日龄时，将幼鱼转移至带有流水、过滤和充气系统的水族箱中的卵杯内（见第6.2.5节）。每个卵杯中幼鱼数量不应超过约25尾。卵杯为底部带有网状筛网的塑料杯。可在卵杯底部加装一个100 mm培养皿的盖子或底座，以防止食物从网眼中漏出。使用卵杯可在保证良好水质的前提下增加水体体积，同时维持个体分组管理。在15–18日龄期间，继续为每尾幼鱼投喂醋线虫及15–30只新孵化的Artemia。每日清洁培养皿部件，并用移液器清除死亡Artemia的聚集物。
    5. 在18–30日龄期间，仅投喂新孵化的Artemia。随着鱼体生长，或观察到咬尾行为时，应增加投喂量。
    6. 约30天后，将鱼转移至10 L（2.5加仑）的水族箱中，每箱约25尾。确保水族箱具备过滤、充气系统，并提供可供躲藏的空间。可考虑使用圆柱形生物过滤介质和小直径PVC管作为遮蔽物。
    7. 从约30–45日龄起，投喂新孵化的Artemia和黑蠕虫。维持标准的清洁程序和换水频率（即每周至少更换10%–20%的水）。
    8. 约45日龄后，仅投喂黑蠕虫，直至约60日龄。
    9. 约60日龄后，将约15尾鱼组成的群体转移至40 L（10加仑）水族箱，并开始成鱼饲养管理。在箱内添加PVC管和纱线“拖把”（将棕色纱线捆扎于软木塞上形成的团状物）作为躲藏处（图3C）。受精后约3–4个月，鱼体应接近性成熟大小（10–12 cm）。

7. 成年动物饲养

  1. 每天投喂足够量的黑蠕虫，使下次投喂时仍可见少量黑蠕虫残留。这种自由摄食方式可促进斑马鱼最大程度地生长。
  2. 每周可补充投喂几次血蠕虫，以辅助黑蠕虫的喂养。
  3. 每2至4周清洁一次鱼缸，换水20%–30%。若纱线拖把上附着大量生物膜或藻类，可在反渗透水下揉搓清洗干净。

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结果

如第1节所述，在scn4aa基因的B. gauderio和B. brachyistius外显子1中鉴定了sgRNA靶向位点。sgRNA的制备方法如第2节所述。在成功完成sgRNA筛选与合成后（图1），进行了体外切割实验（图2）。选择在体外具有切割活性的sgRNA用于单细胞显微注射。

成年鱼类经繁殖条件驯化（第4.1节）后，注射促排卵剂（第4.2节），随后进行挤压取卵（B. gauderio），用于第4.4节所述的体外受精（IVF）；或让其自然产卵（B. brachyistius），如第4.3节所述。上述操作在两种鱼类中均获得了单细胞胚胎，用于显微注射。如第5节所述，在单细胞期向胚胎注射1.5−2.0 nL的scn4aa sgRNA/Cas9/酚红复合物（终浓度为65–190 ng/µL sgRNA、450 ng/µL Cas9、1%–10%酚红）。同一窝的卵...

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讨论

弱电鱼类表型的丰富性，加上近年来基因组学资源的迅速增加，促使人们对弱电鱼类这一模式生物的功能基因组学工具产生了迫切需求。该体系尤其具有吸引力，是因为在多个平行的鱼类谱系中，众多表型性状发生了趋同进化，且这些鱼类易于在实验室中饲养。

本文所述方案展示了CRISPR/Cas9技术在弱电鱼类谱系中的有效性，这些鱼类在进化过程中平行演化出了发电和电感受能力，因此对该模型在表型进化比较基因组学未来研究中的应用前景具有重要意义。

这种简单的方法学仅需基本的分子生物学技能和培训，其基础是广泛用于斑马鱼的Gagnon方案38。值得注意的是，随着技术的发展，目前已有更多用于sgRNA制备的商业试剂盒，以及可合成向导RNA的公司，这使得缺乏分子生物学经验与设备的实验室也能更容易地采用该方案。我们首先注意到，该方法具有较高的诱变效率，可直接对显微注射后的幼体进行表型分析。然而，表型嵌合现象较为显著，这并不罕见，且与文献报道一致41,...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Monica Lucas、Katherine Shaw、Ryan Taylor、Jared Thompson、Nicole Robichaud和Hope Healey在鱼类饲养、数据收集以及早期方案开发方面所做出的杰出贡献。我们还要感谢三位审稿人对本文稿提出的宝贵建议。在认真回应并处理了审稿意见后，我们认为最终成果的质量得到了显著提升。本研究得到了美国国家科学基金会（项目编号#1644965和#1455405）对JRG的资助，以及加拿大自然科学与工程研究理事会DG项目对VLS的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20 mg/mL RNA级糖原赛默飞世尔科技R0551
50 bp DNA ladderNEBN3236L
带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管Sutter InstrumentBF100-58-10（外径 1.0 mm，内径 0.58 mm，长度 10 cm）
带有NLS的Cas9蛋白；1 mg/mLPNA 生物学CP01
Dneasy 血液 & 组织试剂盒Qiagen69506
Eppendorf FemptoJet 4i 显微注射仪Fisher ScientificE5252000021
Eppendorf Microloader 吸头Fisher Scientific10289651
汉密尔顿注射器Fisher Scientific14-824-654称为 "精密玻璃注射器" 在实验方案中
KimwipeFisher Scientific06-666称为 "精细任务擦拭" 在实验方案中
MEGAscript T7 转录试剂盒InvitrogenAM1334
NEBuffer 3NEBB7003S用于体外切割实验
OneTaq DNA 试剂盒NEBM0480L
OvaprimSyndel USAhttps://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html称为 "催产剂" 在实验方案中
ParafilmFisher ScientificS37440称为 "热塑性塑料" 在实验方案中
拉管仪WPISU-P97sutter 品牌
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28106
可重复使用的针头——需要定制Fisher Scientific7803-02定制为 0.7 英寸长；点样式 4，角度 25
T4 DNA聚合酶NEBM0203L使用随附的10x NEB缓冲液
聚四氟乙烯涂层工具bonefolder.comT-SPATULA4PIECE称为 "聚四氟乙烯" 在实验方案中

参考文献

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基因编辑显微注射技术电器官放电钠通道基因比较基因组学功能验证胚胎注射突变胚胎
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