坐骨神经挤压损伤大鼠模型功能评估的三维运动学分析

摘要

我们介绍一种运动学分析方法，该方法使用包含四个摄像头的三维运动捕捉装置和数据处理软件，用于在涉及啮齿类动物模型的基础研究中进行功能评估。

摘要

与坐骨神经功能指数（SFI）相比，运动学分析是一种更为可靠且敏感的方法，可用于对坐骨神经损伤啮齿类动物模型进行功能评估。在本实验方案中，我们描述了一种新颖的运动学分析方法，该方法利用三维（3D）运动捕捉装置，结合大鼠坐骨神经 crush 损伤模型进行功能评估。首先，使大鼠适应跑台行走。随后，将标记物固定于指定的骨性解剖标志点，并让大鼠以设定速度在跑台上行走。同时，使用四台摄像机记录大鼠后肢的运动过程。根据所使用的软件，通过自动和手动模式生成标记点轨迹，并在进行细微调整后获得所需数据。这种基于三维运动捕捉装置的运动学分析方法具有多种优势，包括更高的精确性和准确性，可在全面的功能评估中检测更多参数。然而，该方法也存在若干不足之处需加以考虑：系统成本较高，操作可能较为复杂，且由于皮肤移动可能导致数据偏差。尽管如此，基于三维运动捕捉装置的运动学分析仍适用于前后肢功能的评估。未来，该方法可能在对多种创伤和疾病进行精确评估方面发挥越来越重要的作用。

引言

坐骨神经功能指数（SFI）是进行坐骨神经功能评估的基准方法¹。SFI已被广泛采用，并频繁应用于多种关于大鼠坐骨神经损伤的功能评估研究中^2,3,4,5,6。尽管该方法广受欢迎，但仍存在若干问题，包括自残行为⁷、关节挛缩风险以及足迹涂抹不清⁸。这些问题严重影响了其预后判断价值⁹。因此，亟需一种替代性的、更少误差的方法来取代SFI。

一种替代方法是运动学分析，包括利用附着在骨性标志或关节上的追踪标记进行的全面步态分析。运动学分析正越来越多地用于功能评估⁹。该方法正逐步被认可为一种可靠且敏感的功能评估工具¹⁰，且不存在SFI所存在的局限性^11,12。

在本实验方案中，我们描述了一系列使用三维运动捕捉装置进行的运动学分析方法，该装置包括一台跑步机、四台120 Hz的电荷耦合器件（CCD）摄像机以及数据处理软件（参见材料表）。这种运动学分析方法不同于一般的视频步态或行走分析^13,14。通过将两台摄像机置于不同方向，可从单侧记录后肢的运动。随后，利用计算机图形学技术构建后肢的三维数字模型⁹。通过精确还原实际肢体的尺寸，我们可计算特定关节角度，如髋关节、膝关节、踝关节和趾关节的角度。此外，我们还可确定多种参数，例如步幅/步长以及支撑相与摆动相的时间比值。这些重建基于由两组摄像机传输的数据生成的完整三维后肢数字模型。甚至可以自动计算假想的重心（CoG）轨迹。

我们使用该3D运动捕捉装置来引入并评估多种运动学参数，以揭示在大鼠坐骨神经 crush 损伤模型背景下随时间推移的功能变化。

方案

本实验方案已获京都大学动物实验委员会批准，所有操作步骤均遵循京都大学动物实验委员会指南（批准编号：MedKyo17029）。

1. 让大鼠熟悉跑台行走

1. 在跑步机两侧设置两块透明塑料板，使一只12周龄的雄性Lewis大鼠沿直线向前行走，然后打开电击网格。
2. 让每只大鼠在跑步机上行走。逐渐将跑步机加速至目标速度（20 cm/s 或 12 m/min），并让大鼠以该速度正常行走5分钟。每次行走结束后，给予1–2分钟的休息时间。每天重复此过程3次，每周5天，持续1周。
   注意：在进入第2步前1周开始跑步机行走训练。
3. 将大鼠每三只一组共同饲养于笼中，保持12小时光照-12小时黑暗的循环周期，并自由提供商业大鼠饲料和自来水。

2. 实施坐骨神经挤压损伤

1. 将大鼠放入麻醉诱导室，并通入5%异氟烷吸入液。
2. 向大鼠腹腔注射由0.15 mg/kg盐酸美托咪定、2 mg/kg咪达唑仑和2.5 mg/kg酒石酸布托啡诺配制而成的复合麻醉剂。检查足底反射是否消失。然后使用电动剃毛器剃除从左侧大转子至大腿中段区域的毛发。
3. 铺开一块无菌布，将大鼠置于其上，并使其保持左侧卧位。同时将无菌手术器械放置在无菌布上。
4. 使用手术刀10号刀片从大转子至大腿中段做一直线切口。然后使用手术止血钳在股四头肌与股二头肌之间进行钝性分离，以暴露坐骨神经。
5. 用两把显微镊子将坐骨神经从周围组织中游离出来，使用标准手术止血钳在臀肌粗隆正下方部位对坐骨神经进行夹伤处理，持续10秒，造成长度为2 mm的压榨性损伤。
6. 使用显微镊子在损伤近端进行9-0尼龙表层神经外膜缝合，然后用4-0尼龙缝线缝合肌肉和皮肤。
7. 向大鼠腹腔注射由0.3 mg/kg盐酸阿替美唑配制而成的麻醉拮抗剂，以在10分钟内唤醒大鼠。待大鼠从麻醉中恢复后，将其尾根部提起使其悬空，观察其左脚趾活动情况。若脚趾完全无法伸展，则表明手术成功。
8. 术后将大鼠单独饲养，维持12小时光照-12小时黑暗循环，自由摄取商品化大鼠饲料和自来水。

3. 安装标记物

1. 将训练好的大鼠放入麻醉诱导室，通入5%异氟烷吸入溶液。通过捏压脚趾检查翻正反射是否消失。
2. 使用麻醉面罩（2%异氟烷吸入溶液）持续麻醉大鼠。在大鼠维持稳定麻醉状态下，使用电动剃毛器剃除从下背部至双侧内、外踝区域的毛发。
   警告：为防止研究人员暴露于泄漏的异氟烷，请确保面罩紧密覆盖大鼠的头部和面部。
   注意：为避免损伤大鼠，应尽可能轻柔地剃除毛发。
3. 将大鼠置于俯卧位。使用黑色记号笔在剃毛后的皮肤上标记以下骨性标志点：沿腰椎至骶椎棘突的连线、双侧髂前上棘、大转子、膝关节、外踝、第五跖趾关节以及第四趾末端。
   注意：沿棘突的连线用于判断双侧标记点是否呈轴向对称。
4. 除腰椎至骶椎棘突连线及第四趾末端外，在其余骨性标志点处使用液体粘合剂粘贴半球形标记物。为避免混淆，每隔一个标记点使用不同颜色。第四趾末端用粉色墨水标记。
   警告：注意避免将粘合剂滴到操作者暴露的皮肤上。
5. 完成所有标记物粘贴后，将大鼠放回笼中。在大鼠未完全从麻醉中恢复前，切勿将其放置于跑步机上。
   注意：若大鼠未完全恢复意识，其正常行走能力可能受到严重影响。

4. 校准与软件设置

1. 在跑步机两侧设置两块透明塑料板，并将校准盒放置在跑步机中央。打开采集软件，然后点击显示屏上的校准图像图标（补充文件1）。
2. 点击采集图标，使用120 Hz CCD相机从四个方向录制1–2秒的视频。再次点击采集图标以停止录制。
   注意：录制停止后，视频将自动保存。
3. 在计算软件中打开视频文件。点击并拖动屏幕右下角校准盒3D模型的特征点，使其与校准模式中由视频自动生成的四幅图像上的对应标记对齐（补充文件2）。然后点击保存图标。
   注意：校准完成后，切勿移动相机的位置。

5. 记录行走过程

1. 从跑步机中取出校准箱，打开电击网格，将完全清醒的大鼠放置在跑步机上。启动记录软件，并输入大鼠的基本信息，包括序列号、行走速度以及主要操作人员的姓名。
2. 启动跑步机并将速度设置为 20 cm/s。待大鼠适应该速度并能够正常行走后，点击显示屏上的 记录 图标，使用四个摄像头记录大鼠行走过程。当记录足够多的步态周期后（>10 步），再次点击该图标停止录制，并关闭跑步机。
   注意：录制停止后，视频将自动保存。
3. 将大鼠重新放入麻醉诱导舱进行麻醉。在大鼠通过麻醉面罩持续接受麻醉的过程中，小心移除半球形标记物。
   注意：应尽可能轻柔地移除标记物，避免对大鼠造成疼痛。
4. 在指定时间点（例如术后 1 周、3 周或 6 周），通过重复步骤 3.1–5.3 对大鼠进行运动学测量。对于未接受手术的大鼠（即对照组），仅在实验开始时进行一次运动学测量。

6. 标记物示踪

1. 打开计算软件，并在界面中打开视频文件。
2. 点击并拖动视频进度条上的双侧控制栏，确保仅显示一段包含10个步态周期的跑步机行走记录（补充文件3）。将屏幕右下角3D模型中的每个特征点依次拖动至各摄像机所拍摄视频前四帧图像中对应的标记点位置（补充文件4）。
3. 点击自动追踪图标，启动自动标记点追踪过程（补充文件5，补充文件6）。若系统未能准确追踪某一标记点，请点击手动数字化图标切换至手动追踪模式（补充文件7），先点击3D模型中的追踪特征点，再点击图像中对应的标记点。
4. 点击标记点后，确保图像切换至视频的下一帧，随后持续点击该标记点直至完成整个追踪过程。完成后，点击保存图标。

7. 运动学分析

1. 打开分析软件，然后在界面上打开已处理的视频文件。
2. 点击 设置 图标，在右侧弹出窗口中选择并添加指定参数（如踝关节角度、趾关节角度以及骨盆位移（X轴和Z轴））至 显示列表（补充文件 8）。点击 确定，使代表各参数数值变化的曲线显示在界面上。
3. 点击 测量 图标，并在其下拉菜单中选择 平滑处理。在弹出窗口中输入 20 Hz，以滤除曲线中高于 20 Hz 的频率成分（补充文件 9）。
4. 确认界面上显示五个面板：大鼠行走视频、动态三维模型、表示10步周期内各参数数值变化的曲线、表示参数平均值变化的曲线，以及表示支撑相与摆动相比例的直方图和示意图（补充文件 10）。
5. 右键单击显示参数平均值变化曲线的面板，在下拉菜单中选择 数据输出（补充文件 11），即可获得后肢关节角度（包括踝关节和趾关节角度）、骨盆位移以及其他所需参数在10步周期内的平均值。

结果

我们选择了四个参数来研究大鼠坐骨神经挤压损伤模型中随时间推移的功能变化，分别为站立相与摆动相的比值、重心（CoG）轨迹、踝关节角度以及“足趾离地”阶段的足趾角度⁹。将24只大鼠随机分为四组：对照组（C），以及左侧坐骨神经挤压损伤后第一周（1w）、第三周（3w）和第六周（6w）的实验组。

通过三维运动学分析，系统自动计算了10步周期中支撑相或摆动相的平均比率，并在界面上显示（图1A-D）。我们发现，术后支撑相与摆动相的比率得到恢复。

重心（CoG）是一个虚拟点，可通过三维运动捕捉设备使用虚拟标记进行追踪。它位于两侧髂前上棘与对侧股骨大转子连线的交点处。因此，当使用三维构建的骨盆模型时，冠状面（X轴和Z轴）上的实时骨盆移动会同时引起重心的移动，该移动也可被自动测量。重心轨迹被描述为10步周期内X轴和Z轴上骨盆移动平均值的变化曲线。正常的重心轨迹形状类似于无穷大符号（∞）。我们发现，术后6周内...

讨论

在本实验方案中，一只稳定且持续行走的大鼠是运动学分析中最关键的部分。跑步机速度设定为 20 cm/s。如果大鼠在无空间限制的情况下活动，该行走速度绝不能被视为"高"速¹⁶。然而，对于未经训练的大鼠而言，此速度过快，难以在跑步机上稳定行走，可能导致异常步态和不均匀的运动。这些情况会严重影响数据的可靠性和真实性。但若跑步机速度低于 20 cm/s，则可能导致大鼠间歇性停止行走，从而产生较大偏差并降低数据可靠性。因此，训练大鼠能够在跑步机上沿直线稳定向前行走，对于实现精确的运动学分析极为重要。

此外，操作人员在运动学分析过程中不应忽视重新确认和精细调整的必要性。我们发现，正常大鼠步态周期中摆动相约占25%。这意味着后肢在摆动相期间的运动加速到摄像系统无法持续且准确捕捉其运动的程度。同时，环境光线过亮或过暗、透明跑台表面的污渍，以及行走过程中偶然出现的异常运动模式，都可能导致追踪标签相对于大鼠身上标记物的位置出现明显偏离。这些因素会降低动作捕捉过程的准确性。为此，我们在标记物追踪系统中引入了手动调整功能。通过手动调整，可以在标...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
9-0 尼龙缝合线	Bear Medic Corporation.	T06A09N20-25
小型动物麻醉装置	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
异氟烷吸入溶液	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
Kine Analyzer	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	一种分析软件
液体粘合剂	KANBO PRAS CORPORATION	PT-B180
微型镊子	BRC CO.	16171080
Motion Recorder	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	一种记录软件
标准外科止血钳	Fine Science Tools, Inc.	12501-13
10号外科刀片	FEATHER Safety Razor CO., LTD	100D
外科止血钳	World Precision Instruments	503740
三维运动捕捉装置（KinemaTracer for Animal）	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	一种由摄像头组成的三维运动分析系统
三维（3D）计算器	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	一种标记点追踪软件
跑步机	MUROMACHI KIKAI CO.,LTD	MK-685	配备附属电刺激器、透明隔板和速度控制装置的跑步机