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成年小鼠耳蜗表面制备

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DOI：

10.3791/60299

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2019年11月6日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2MOE Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Institute of Life Sciences, Southeast University

本文内容

摘要

本文介绍了一种改良的耳蜗表面制备方法，该方法需要进行脱钙处理，并使用细胞与组织粘附剂将耳蜗上皮组织片段粘附于10 mm圆形盖玻片上，以便对成年小鼠耳蜗进行免疫组织化学分析。

摘要

耳蜗中的听觉处理依赖于机械感觉毛细胞的完整性。在人的一生中，听力损失可由多种病因引起，例如暴露于过度噪声、使用耳毒性药物、细菌或病毒感染引起的耳部感染、头部外伤以及衰老过程。感觉毛细胞的丧失是各种获得性听力损失常见的病理特征。此外，内毛细胞突触可能因轻微损伤而受损。因此，耳蜗上皮的表面铺片结合免疫标记技术和共聚焦成像，是研究耳蜗病理变化的有力工具，可用于分析听觉纤毛突触和感觉毛细胞的丢失、毛细胞和支持细胞中蛋白质水平的变化、毛细胞再生情况，以及报告基因表达（如GFP）的检测，以验证转导是否成功并鉴定被转导的细胞类型。耳蜗是内耳中一个骨性螺旋状结构，内含听觉感受器终器——柯蒂器官（OC）。OC中的感觉毛细胞及其周围的 supporting cells 位于耳蜗管内，附着于基底膜上，按音调定位方式排列，高频声音的感受发生在耳蜗基部，低频声音的感受则位于顶部。随着分子与遗传信息的不断积累，以及基因敲除和基因敲入等基因操作技术的发展，小鼠已被广泛应用于包括听觉科学在内的生物学研究中。然而，成年小鼠的耳蜗极为微小，且耳蜗上皮被包裹在骨性迷路之中，使得显微解剖操作十分困难。尽管已有多种解剖技术在许多实验室中被开发和使用，但这种采用细胞与组织粘附剂的改良显微解剖方法更为简便和实用。该方法适用于所有类型成年小鼠耳蜗组织在脱钙后的处理。

引言

耳蜗负责声音的感知，是听觉的关键器官。耳蜗管在骨迷路内呈螺旋状盘绕，其中容纳着听觉感受器——柯蒂氏器（OC）。OC位于基底膜上，共同构成耳蜗上皮，当将其在成年CBA/CaJ小鼠中展开时，长度约为5.7 mm1,2。由于OC具有音调拓扑结构，高频声音由基部感知，低频声音由顶部感知，因此耳蜗上皮常被划分为三个部分以便进行分析比较：分别对应低、中、高频感知的顶部、中部和基部转回。除了多种支持细胞外，OC还包括一列位于内侧的内毛细胞（IHCs）和三列位于外侧的外毛细胞（OHCs），其位置关系相对于耳蜗螺旋而言。

正常的听觉处理依赖于耳蜗中感觉毛细胞的完整性。感觉毛细胞的损伤或丢失是获得性听力损失常见的病理特征，其致病原因众多，包括暴露于过度噪声、使用耳毒性药物、细菌或病毒感染引起的耳部感染、头部外伤以及衰老过程3。此外，内毛细胞与听觉神经之间的突触完整性和功能也可能因轻微损伤而受损4。随着分子和遗传信息的可获取性，以及通过基因敲除和敲入技术对基因进行操控，小鼠已被广泛应用于听觉科学研究。尽管成年小鼠的耳蜗极为微小，且耳蜗上皮被骨性囊包裹，导致显微解剖操作技术难度较高，但结合免疫标记或免疫组织化学染色与共聚焦成像的耳蜗上皮铺片技术已被广泛用于研究耳蜗病理变化，包括带状突触和毛细胞的丢失、感觉毛细胞和支持细胞中蛋白质水平的变化，以及毛细胞再生。耳蜗铺片技术还被用于确定报告基因（如GFP）的表达模式，验证基因转导的成功性，并鉴定被转导的细胞类型。这些技术此前已被用于研究成年CBA/J小鼠中与噪声诱导性听力损失相关的分子机制5,6,7,8,9。

与使用石蜡切片或冷冻切片获取耳蜗的小段横截面（每张切片包含三个外毛细胞（OHCs）和一个内毛细胞（IHC））进行免疫组织化学染色不同，耳蜗表面铺片技术可实现对整个耳蜗基底膜（OC）全长的观察，从而便于对感觉毛细胞和带状突触进行计数，并对对应特定功能频率区域的感觉毛细胞进行免疫标记。表1展示了根据Muller1以及Viberg和Canlon1,2的研究结果，成年CBA/J小鼠耳蜗螺旋长度上不同位置所对应的听觉频率映射关系。耳蜗表面铺片技术已被广泛应用于耳蜗病理学的研究4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。全装耳蜗解剖方法最早由Hans Engstrom于1966年编辑出版的书籍中描述16。此后，该技术被多位听觉科学领域的研究人员不断改进并应用于多种物种10,11,12,13,15,17，同时也被麻省眼耳医院的Eaton-Peabody实验室所采用18。最近，Montgomery等人报道了另一种耳蜗解剖方法19。耳蜗显微解剖是制备耳蜗表面铺片的关键且必不可少的步骤。然而，小鼠耳蜗的解剖具有较高的技术难度，需要大量的实践练习。本文介绍一种改良的适用于成年小鼠耳蜗的表面铺片制备方法。该方法需经过脱钙处理，并使用细胞与组织粘附剂（即Cell-Tak）将耳蜗上皮组织片段粘附于直径10 mm的圆形盖玻片上，以便进行免疫标记。细胞与组织粘附剂已在免疫组织化学中广泛应用20。与先前报道的方法相比18,19，这种改良的耳蜗显微解剖方法相对简便。

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方案

所有涉及10至12周龄雄性CBA/J小鼠和6至8周龄C57BL/6J小鼠的研究方案均经南卡罗来纳医科大学（MUSC）机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。动物照护工作由MUSC实验动物资源部监督执行。

注意：以下操作步骤中，小鼠通过腹腔注射给予氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。当小鼠对足趾夹捏等疼痛刺激不再有反应后，实施断头处死。

1. 颞骨的提取

  1. 动物死亡后立即使用手术剪（17 cm长）进行断头，并将皮肤向前拉开暴露颅骨后，沿颅骨中线从后向前用剪刀剪开颅骨。
  2. 用镊子取出脑组织，对于三个月龄及以上的小鼠，用手的拇指和食指手动去除颞骨；对于三个月龄以下的小鼠，使用小型手术剪（11 cm长）剪除颞骨。
  3. 将颞骨放入盛有冰上预冷的新鲜4%多聚甲醛（PFA）溶液（溶于磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4）的培养皿（直径30 mm）中。
    注意：在固定颞骨前应新鲜配制4% PFA溶液，并立即调节pH至7.4，因为PFA溶液pH值不当会降低免疫标记的质量。

2. 固定与灌注

  1. 用 #5 镊子从卵圆窗移除镫骨，并刺破圆窗膜。在体视解剖显微镜下，使用连接1 mL 注射器的 27 G 针头在耳蜗顶处打一个小孔。
  2. 通过圆窗和卵圆窗，缓慢轻柔地向耳蜗灌注 4% PFA 溶液，直至溶液从小孔流出。将耳蜗（每瓶一至两个耳蜗）转移至含有 10 mL 4% PFA 溶液的 20 mL 体积闪烁瓶中。
  3. 在室温（RT）下轻轻振荡闪烁瓶 2 小时，随后在 4 °C 冰箱中置于旋转器上过夜。
    注意：固定时间可根据所用抗体进行调整。例如，当使用 GluA2 抗体时，将固定时间限制在 1.5 小时，有助于突触后末端的有效免疫标记。

3. 颞骨脱钙

  1. 移除PFA溶液，用新鲜的PBS清洗耳蜗，每次5分钟，共洗3次。
  2. 向闪烁瓶中加入20 mL 4%乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）溶液（pH 7.4），置于冰箱中，在旋转器上轻轻振荡处理48–72小时。每日更换EDTA溶液，直至耳蜗完全脱钙。通过镊子轻触骨性前庭部分以评估其弹性，或直接从前庭边缘切下一小块组织进行检查。若切割后组织呈破碎状，则表明耳蜗尚未完全脱钙。
    注意： EDTA溶液可能干扰一抗的免疫反应，具体取决于溶液浓度。应使用PBS配制4% EDTA溶液，并将pH值调节至7.4。为确保颞骨脱钙效果一致，需使用新鲜配制的EDTA溶液。
  3. 脱钙完成后，将溶液更换为PBS，用于后续显微解剖。
    注意： 若耳蜗脱钙不充分，则无法进行耳蜗解剖操作。

4. 耳蜗上皮的显微解剖

注意：一旦脱钙完成，应尽快进行耳蜗上皮的显微解剖以用于免疫标记。在含有 PBS 的洁净 30 mm 培养皿中，以内耳的以下方向进行定位：以培养皿的顶部（盖子）和底部为参考，耳蜗的圆窗和卵圆窗朝向顶部；以操作者为参考，耳蜗部分朝前（远离操作者），前庭部分朝后（靠近操作者）。以下将详细描述操作步骤。

  1. 用镊子夹住颞骨的前庭部分，并用手术刀沿红色线条所示方向以45°角切割顶回图1a).
  2. 沿圆窗与卵圆窗之间隐约可见的分界线垂直切开，如红线所示（图1b) 以分离耳蜗与前庭部分（图1c).
    注意： 该耳蜗部分包含上皮的中部、基部和钩状部分。
  3. 将耳蜗部分放置于培养皿中，使基底回朝下，中回朝上，沿红色线条所示方向，从已去除顶段的一端开始，切开中回的骨性囊和侧壁图1d，e).
  4. 继续切割，以完全分离中部区域与基部及钩状区域（图1f，g).
    注意： 耳蜗钩区是耳蜗上皮的末端区域，在小鼠中对应于对48 kHz及以上频率声音的敏感区域。
  5. 将基底部分和钩状部分放置于培养皿中，使基底膜朝向培养皿底部，并沿钩状区域垂直切断蜗轴，以去除蜗轴，如红色垂直线所示（图1g).
    注意： 耳蜗轴是耳蜗的圆锥形中央轴，由松质骨、耳蜗神经及螺旋神经节组成。建议使用剪刀进行此切割操作。
  6. 按另一条红线所示，切取基部和钩状区域 图1g 以分离钩状部分（图1h).
    注意： 耳蜗现已分离为顶回、中回、底回和钩部。接下来的步骤将以中回为例，进行各单独回的最终解剖。
  7. 沿红色标示线切除中回相对较大的骨性囊壁和侧壁组织图1i).
    注意： 耳蜗管的外侧壁由螺旋韧带和血管纹构成。
  8. 用镊子夹住侧壁，使骨囊和侧壁与培养皿底部对齐，从基底膜侧切断这些组织。然后将标本展平，使感觉毛细胞表面朝上。修剪掉剩余的骨囊和侧壁（图1j).
  9. 使用镊子去除盖膜，以完全分离中部区域（图1k).
  10. 重复步骤 4.7−4.9，对剩余的转角或区域进行最终解剖，如图所示 图1l.
  11. 准备一个直径为10 mm的圆形盖玻片用于感觉上皮的黏附。用移液器将0.5 µL细胞与组织黏附剂均匀滴加在圆形盖玻片中心。室温下干燥（3–5分钟）后，将盖玻片置于盛有PBS的培养皿中。
  12. 将感觉上皮的四块组织全部贴附于培养皿中直径为10 mm的圆形盖玻片上，然后捏住盖玻片的一边，将其转移至四孔板中，用于免疫标记或免疫组织化学染色。图1m).
    注意： 图2 示意图显示了主要切口的位置。

5. 耳蜗突触的免疫标记

注意：本研究中用于耳蜗突触免疫标记的方案此前已有描述13。使用 CtBP2 抗体（小鼠抗羧基末端结合蛋白 2 IgG1，标记 RIBEYE 支架蛋白的 B 结构域）标记突触前带状体。使用 GluA2 抗体（小鼠抗谷氨酸受体 2 IgG2a，标记 AMPA 受体亚基）标记突触后终末。

  1. 在四孔板中用 PBS 洗涤感觉上皮组织，每次 5 分钟，共洗涤 3 次，随后加入 2 mL 2% 非离子型表面活性剂（如 Triton-X 100），在室温下于旋转仪上孵育 30 分钟。
  2. 用移液器吸除四孔板中的非离子型表面活性剂溶液，每孔加入含 10% 正常山羊血清的封闭液 100 µL，在室温下于旋转仪上轻柔振荡孵育 1 小时。
  3. 吸除各孔中的封闭液，在室温下用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，轻柔振荡。
  4. 每孔加入 100 µL 用 PBS 稀释的一抗溶液：小鼠抗 GluA2 IgG2a 抗体（1:2,000）、小鼠抗 CtBP2 IgG1 抗体（1:400）。盖上四孔板盖子，放入避光的大型湿盒中，在 37 °C 孵育 24 小时。
    注意：可选加入兔抗肌球蛋白 VIIa 抗体（1:400）用于标记感觉毛细胞。
  5. 在室温下用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，轻柔振荡。
  6. 每孔加入 100 µL 用 PBS 稀释的二抗溶液：Alexa 594 标记的山羊抗小鼠 IgG1a 抗体（1:1,000）、Alexa 488 标记的山羊抗小鼠 IgG2a 抗体（1:1,000）。盖上四孔板盖子，放入避光的大型湿盒中，在 37 °C 孵育 2 小时。
    注意：若使用肌球蛋白 VIIa 抗体，需同时加入 Alexa 350 标记的山羊抗兔抗体（1:200）。
  7. 用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。然后将带有样本的 10 mm 圆形盖玻片转移至载玻片上，样本面朝上。
  8. 小心地将 8 µL 含 Tris 缓冲液的 Fluoro-Gel 滴加至盖玻片中央。再用镊子夹住另一张 10 mm 圆形盖玻片的边缘，将其覆盖在上方，使两张盖玻片叠合并夹住样品。
  9. 用指甲油密封载玻片，放入纸板载玻片盒中，置于冰箱内保存。
    注意：若在封片过程中有部分 Fluoro-Gel 从盖玻片间渗出，应在用指甲油密封前清洁盖玻片边缘。共聚焦显微镜成像需在 7 天内完成。

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结果

耳蜗上皮的铺片制备结合免疫标记与共聚焦成像技术，已广泛应用于听觉科学研究中，用于研究耳蜗病理变化，例如对带状突触、感觉毛细胞以及感觉毛细胞中蛋白表达的定量分析5,6,7,8。尽管成年小鼠耳蜗用于铺片制备的解剖操作并不简单，但经过10–15个耳蜗的练习后，新入学的研究生即可掌握本改良方法（图1 和 图2）。结合CtBP2（突触前带状体标志物）和GluA2（突触后终端标志物）的免疫标记技术，利用共聚焦显微镜在Z轴投影下以0.25 µm的间隔成像，可根据小鼠带状突触的尺寸对内毛细胞/听觉神经突触进行计数21，该结果与已发表的研究结果一致4,

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讨论

耳蜗整体封片的显微解剖结合免疫标记技术，为研究内耳病理学和分子机制提供了基本工具。这种利用细胞和组织粘附剂改良的成年小鼠耳蜗解剖方法，简化了这一困难的操作过程。

尽管这种改良的耳蜗表面制备方法相对简单且易于操作，但仍需要经过练习才能熟练掌握。为了做出正确的切口，操作者需要高度集中注意力。由于耳蜗基底回的感觉毛细胞非常靠近螺旋韧带，因此很难完全去除韧带组织以使表面制备完全展平，但共聚焦显微镜的Z轴投影可以弥补这一问题。此外，耳蜗的钩状区域仍然是最难以解剖的部分，该区域的外毛细胞（OHCs）与内毛细胞（IHCs）之间可能发生分离。钩状区域在人类中存在较大的解剖学变异，且对骨导听力具有重要意义22,23。根据Muller1以及Viberg和Canlon2报道的耳蜗频率定位图谱，从耳蜗顶端起约4.7 mm处开始的钩状区域对应于对48 kHz及以上频率声音的敏感性（...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究项目由美国国立卫生研究院下属的耳聋与其他沟通障碍研究所资助，资助编号为 R01 DC009222。本工作在南卡罗来纳医科大学（MUSC）的 WR 大楼内开展，该空间的改建由国家研究资源中心校外研究设施项目资助，资助编号为 C06 RR014516。实验动物饲养于南卡罗来纳医科大学 CRI 动物设施，该设施由国家研究资源中心校外研究设施项目资助，资助编号为 C06 RR015455。作者感谢 Jochen Schacht 博士提出的宝贵意见，以及 Andra Talaska 对稿件的校对。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mm 圆形盖玻片用于科学与工业的显微镜产品260367
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG2Thermo Fisher ScientificA-21131
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽Thermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG1Thermo Fisher ScientificA-21125
Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA11012
纸板显微载片盒Fisher Scientific12-587-10
Cell-TakBD Biosciences354240
Corning 培养皿Fisher Scientific353004
DAPIThermo Fisher Scientific62247
Dumont #5 镊子FST fine science tools11251-20
EDTA 二钠盐Sigma-AldrichE5134
含 Tris 缓冲液的 Fluoro-gelElectron Microscopy Sciences17985-10
四孔细胞培养皿Greiner Bio-One627170
山羊抗肌球蛋白 VIIa 抗体Proteus Biosciences25-6790
显微镜载玻片Fisher Scientific12-544-7
小鼠抗 CtBP2 抗体BD Biosciences#612044
小鼠抗 Glu2R 抗体MilliporeMAB397
正常山羊血清Thermo Fisher Scientific31872
多聚甲醛Sigma-Aldrich441244
磷酸盐缓冲液Fisher ScientificBP665-1
手术刀VWR100491-038
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
Vannas 弹簧剪Fine Science Tools15001-08

参考文献

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