成年小鼠耳蜗表面制备

摘要

本文介绍了一种改良的耳蜗表面制备方法，该方法需要进行脱钙处理，并使用细胞与组织粘附剂将耳蜗上皮组织片段粘附于10 mm圆形盖玻片上，以便对成年小鼠耳蜗进行免疫组织化学分析。

摘要

耳蜗中的听觉处理依赖于机械感觉毛细胞的完整性。在人的一生中，听力损失可由多种病因引起，例如暴露于过度噪声、使用耳毒性药物、细菌或病毒感染引起的耳部感染、头部外伤以及衰老过程。感觉毛细胞的丧失是各种获得性听力损失常见的病理特征。此外，内毛细胞突触可能因轻微损伤而受损。因此，耳蜗上皮的表面铺片结合免疫标记技术和共聚焦成像，是研究耳蜗病理变化的有力工具，可用于分析听觉纤毛突触和感觉毛细胞的丢失、毛细胞和支持细胞中蛋白质水平的变化、毛细胞再生情况，以及报告基因表达（如GFP）的检测，以验证转导是否成功并鉴定被转导的细胞类型。耳蜗是内耳中一个骨性螺旋状结构，内含听觉感受器终器——柯蒂器官（OC）。OC中的感觉毛细胞及其周围的 supporting cells 位于耳蜗管内，附着于基底膜上，按音调定位方式排列，高频声音的感受发生在耳蜗基部，低频声音的感受则位于顶部。随着分子与遗传信息的不断积累，以及基因敲除和基因敲入等基因操作技术的发展，小鼠已被广泛应用于包括听觉科学在内的生物学研究中。然而，成年小鼠的耳蜗极为微小，且耳蜗上皮被包裹在骨性迷路之中，使得显微解剖操作十分困难。尽管已有多种解剖技术在许多实验室中被开发和使用，但这种采用细胞与组织粘附剂的改良显微解剖方法更为简便和实用。该方法适用于所有类型成年小鼠耳蜗组织在脱钙后的处理。

引言

耳蜗负责声音的感知，是听觉的关键器官。耳蜗管在骨迷路内呈螺旋状盘绕，其中容纳着听觉感受器——柯蒂氏器（OC）。OC位于基底膜上，共同构成耳蜗上皮，当将其在成年CBA/CaJ小鼠中展开时，长度约为5.7 mm^1,2。由于OC具有音调拓扑结构，高频声音由基部感知，低频声音由顶部感知，因此耳蜗上皮常被划分为三个部分以便进行分析比较：分别对应低、中、高频感知的顶部、中部和基部转回。除了多种支持细胞外，OC还包括一列位于内侧的内毛细胞（IHCs）和三列位于外侧的外毛细胞（OHCs），其位置关系相对于耳蜗螺旋而言。

正常的听觉处理依赖于耳蜗中感觉毛细胞的完整性。感觉毛细胞的损伤或丢失是获得性听力损失常见的病理特征，其致病原因众多，包括暴露于过度噪声、使用耳毒性药物、细菌或病毒感染引起的耳部感染、头部外伤以及衰老过程³。此外，内毛细胞与听觉神经之间的突触完整性和功能也可能因轻微损伤而受损⁴。随着分子和遗传信息的可获取性，以及通过基因敲除和敲入技术对基因进行操控，小鼠已被广泛应用于听觉科学研究。尽管成年小鼠的耳蜗极为微小，且耳蜗上皮被骨性囊包裹，导致显微解剖操作技术难度较高，但结合免疫标记或免疫组织化学染色与共聚焦成像的耳蜗上皮铺片技术已被广泛用于研究耳蜗病理变化，包括带状突触和毛....

方案

所有涉及10至12周龄雄性CBA/J小鼠和6至8周龄C57BL/6J小鼠的研究方案均经南卡罗来纳医科大学（MUSC）机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。动物照护工作由MUSC实验动物资源部监督执行。

注意：以下操作步骤中，小鼠通过腹腔注射给予氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。当小鼠对足趾夹捏等疼痛刺激不再有反应后，实施断头处死。

1. 颞骨的提取

1. 动物死亡后立即使用手术剪（17 cm长）进行断头，并将皮肤向前拉开暴露颅骨后，沿颅骨中线从后向前用剪刀剪开颅骨。
2. 用镊子取出脑组织，对于三个月龄及以上的小鼠，用手的拇指和食指手动去除颞骨；对于三个月龄以下的小鼠，使用小型手术剪（11 cm长）剪除颞骨。
3. 将颞骨放入盛有冰上预冷的新鲜4%多聚甲醛（PFA）溶液（溶于磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4）的培养皿（直径30 mm）中。
   注意：在固定颞骨前应新鲜配制4% PFA溶液，并立即调节pH至7.4，因为PFA溶液pH值不当会降低免疫标记的质量。

2. 固定与灌注

1. 用 #5 镊子从卵圆窗移除镫骨，并刺破圆窗膜。在体视解剖显微镜下，使用连接1 mL 注射器....

结果

耳蜗上皮的铺片制备结合免疫标记与共聚焦成像技术，已广泛应用于听觉科学研究中，用于研究耳蜗病理变化，例如对带状突触、感觉毛细胞以及感觉毛细胞中蛋白表达的定量分析^5,6,7,8。尽管成年小鼠耳蜗用于铺片制备的解剖操作并不简单，但经过10–15个耳蜗的练习后，新入学的研究生即可掌握本改良方法（图1 和 图2）。结合CtBP2（突触前带状体标志物）和GluA2（突触后终端标志物）的免疫标记技术，利用共聚焦显微镜在Z轴投影下以0.25 µm的间隔成像，可根据小鼠带状突触的尺寸对内毛细胞/听觉神经突触进行计数²¹，该结果与已发表的研究结果一致^4,

讨论

耳蜗整体封片的显微解剖结合免疫标记技术，为研究内耳病理学和分子机制提供了基本工具。这种利用细胞和组织粘附剂改良的成年小鼠耳蜗解剖方法，简化了这一困难的操作过程。

尽管这种改良的耳蜗表面制备方法相对简单且易于操作，但仍需要经过练习才能熟练掌握。为了做出正确的切口，操作者需要高度集中注意力。由于耳蜗基底回的感觉毛细胞非常靠近螺旋韧带，因此很难完全去除韧带组织以使表面制备完全展平，但共聚焦显微镜的Z轴投影可以弥补这一问题。此外，耳蜗的钩状区域仍然是最难以解剖的部分，该区域的外毛细胞（OHCs）与内毛细胞（IHCs）之间可能发生分离。钩状区域在人类中存在较大的解剖学变异，且对骨导听力具有重要意义^22,23。根据Muller¹以及Viberg和Canlon²报道的耳蜗频率定位图谱，从耳蜗顶端起约4.7 mm处开始的钩状区域对应于对48 kHz及以上频率声音的敏感性（.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mm 圆形盖玻片	用于科学与工业的显微镜产品	260367
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG2	Thermo Fisher Scientific	A-21131
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG1	Thermo Fisher Scientific	A-21125
Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A11012
纸板显微载片盒	Fisher Scientific	12-587-10
Cell-Tak	BD Biosciences	354240
Corning 培养皿	Fisher Scientific	353004
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
Dumont #5 镊子	FST fine science tools	11251-20
EDTA 二钠盐	Sigma-Aldrich	E5134
含 Tris 缓冲液的 Fluoro-gel	Electron Microscopy Sciences	17985-10
四孔细胞培养皿	Greiner Bio-One	627170
山羊抗肌球蛋白 VIIa 抗体	Proteus Biosciences	25-6790
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-544-7
小鼠抗 CtBP2 抗体	BD Biosciences	#612044
小鼠抗 Glu2R 抗体	Millipore	MAB397
正常山羊血清	Thermo Fisher Scientific	31872
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	441244
磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	BP665-1
手术刀	VWR	100491-038
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	15001-08