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方法文章

小肠神经内分泌肿瘤类球体的建立与表征

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DOI：

10.3791/60303

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2019年10月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Iowa Carver College of Medicine, 2High Throughput Screening Facility, University of Iowa Carver College of Medicine, 3Department of Pathology, University of Iowa Carver College of Medicine

本文内容

摘要

神经内分泌肿瘤（NETs）起源于神经嵴的神经内分泌细胞。这类肿瘤生长缓慢，且培养难度较大。我们提出一种替代策略，通过将小肠来源的NETs以球状体形式进行培养来实现其体外扩增。这些球状体表达小肠神经内分泌肿瘤标志物，并可用于药物测试。

摘要

小肠神经内分泌肿瘤（SBNETs）是一类起源于肠道肠嗜铬细胞的罕见癌症。由于目前建立的源自患者的SBNET细胞系极少，该领域的研究受到严重限制。分化良好的SBNET细胞增殖缓慢，难以扩增培养。已建立的少数细胞系难以获取，且在长期培养后可能逐渐失去神经内分泌肿瘤细胞的特征。由于SBNET细胞倍增时间较长，且需要经过多次富集步骤以清除快速增殖的肿瘤相关成纤维细胞，因此新细胞系的建立可能耗时多年。为克服这些局限，我们开发了一种从手术切除的肿瘤组织中在细胞外基质（ECM）中以类球体形式培养SBNET细胞的方案。ECM形成一种三维结构，包裹SBNET细胞并模拟肿瘤微环境，从而支持SBNET细胞的生长。本文中，我们表征了SBNET类球体的生长速率，并描述了利用免疫荧光显微镜和免疫组织化学检测SBNET标志物的方法，以确认类球体确为神经内分泌肿瘤细胞。此外，我们还利用SBNET类球体检测雷帕霉素的细胞毒性作用。

引言

小肠神经内分泌肿瘤（SBNETs）起源于小肠的肠嗜铬细胞。尽管SBNETs通常生长缓慢，但常发生肝转移1。虽然在许多情况下可考虑手术切除或肿瘤消融治疗，但复发几乎不可避免，因此药物治疗在疾病管理中具有重要作用。研究人员已投入大量努力以建立可用于药物筛选的新SBNET细胞系，但进展甚微。目前仅有6种SBNET细胞系（KRJ-I、CND2、GOT1、P-STS、L-STS、H-STS）被报道2,3,4,5；遗憾的是，其中一种细胞系已不再表达神经内分泌肿瘤标志物6，另有三种SBNET细胞系（KRJ-I、L-STS、H-STS）被证实来源于转化的淋巴母细胞，而非神经内分泌肿瘤7。为了加快针对SBNETs的药物筛选进程，亟需建立替代性的体外药物测试方法。

此处，我们采用 利用可获取的切除小肠神经内分泌肿瘤（SBNETs）组织，我们已建立了一种将患者来源的SBNETs在细胞外基质（ECM）中以类球体形式进行培养的方法。本论文的总体目标是描述一种将SBNETs进行三维（3D）培养的技术，并概述通过免疫荧光染色和免疫组织化学检测来鉴定这些类球体是否保留SBNET标志物的实验流程。

此外，我们展示了这些SBNET类球体如何用于测试雷帕霉素（一种针对NETs的抗癌药物）的作用效果8。本实验方案的设计原理是建立一种在体外培养SBNET细胞的新方法，并将其用于药物测试。与传统建立SBNET细胞系的方法相比，该技术的优势在于能够在体外快速获得SBNET的三维培养物，并可在3周内完成药物测试。SBNET类球体有望作为体外药物筛选的模型，用于发现适用于SBNET患者的新药物。由于目前SBNET细胞系尚不广泛可得，SBNET类球体的三维培养可作为一种新的体外研究模型，用于SBNET的基础研究，并可在相关领域的科研人员之间共享。

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方案

所有使用人神经内分泌肿瘤样本的实验均已获得爱荷华大学医院和诊所机构审查委员会（IRB）的批准（方案编号 199911057）。所有材料和设备的清单见材料表。培养基和关键溶液的列表见表1。

1. 小肠神经内分泌肿瘤（SBNET）的采集与细胞解离

  1. 从外科病理学核心实验室获取经肿瘤组织确认的患者SBNET切除样本。
  2. 将SBNET组织切成5 mm 的立方体，并置于含有25 mL DMEM/F12培养基的锥形管中，用于运输至实验室。
  3. 将肿瘤转移至含有1% FBS、1%青霉素/链霉素（Pen/Strep）、1%谷氨酰胺的DMEM培养基（洗涤培养基）中，并在该洗涤培养基中孵育15分钟。
  4. 将肿瘤转移至新的培养皿中，使用无菌弯头剪刀将组织剪切成小于1 mm的小块。
  5. 将剪碎的组织转移至含有25 mL洗涤培养基的新50 mL离心管中。
  6. 在4 °C条件下，以500 × g 离心15分钟。
  7. 弃去上清液，并将沉淀物重悬于10 mL含有胶原酶（100 U/mL）和DNase（0.1 mg/mL）的洗涤培养基中。
  8. 将剪碎的肿瘤组织在37 °C培养箱中以缓慢振荡（50 rpm）消化1.5小时。

2. 在细胞外基质中将SBNETs作为肿瘤类球体进行培养

  1. 消化完成后（步骤 1.8），在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 15 分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于 15 mL 洗涤液中。
  2. 将一个 70 µm 细胞筛置于新的 50 mL 离心管上方，转移 10 mL 洗涤液至细胞筛上。轻轻旋转洗涤液，使其覆盖塑料管壁，防止 NET 细胞黏附在管壁上。
  3. 将细胞悬液通过细胞筛进行过滤。
  4. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 15 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于 200 µL 洗涤液中（总体积约为 250 µL），并置于冰上。
  5. 取 5 µL 细胞悬液加入 500 µL 洗涤液中（稀释倍数为 1/100）。使用血细胞计数板对稀释后的细胞进行计数，以获得每毫升的细胞数量。将计数值乘以 100 以校正稀释倍数。
  6. 将步骤 2.5 中获得的每毫升细胞数乘以步骤 2.4 中所得细胞悬液的总体积（约 250 µL）。
  7. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 15 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于液态 ECM 中（1 × 106 个细胞/mL），并保持在冰上。
  8. 将 5–20 µL 含 SBNET 类球体的 ECM 转移至 96 孔板中，并将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟，使液态 ECM 凝固。
  9. 向含有 SBNET 类球体的 ECM 的 96 孔板每孔加入 200 µL SBNET 培养基（DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素 + 1% 谷氨酰胺 + 10 mM 烟酰胺 + 10 µg/mL 胰岛素）。
  10. 或者，可使用类似于先前报道的人肝或胰腺类器官培养的干细胞培养基来培养 SBNET 类器官9，具体成分见 材料表。
  11. 每 5–7 天更换一次培养基。

3. 使用 ImageJ 对 SBNET 类球体大小进行定量分析

  1. 使用10倍物镜，在培养的第1、4、7、14、23和97天分别拍摄5-10张SBNET类球体的图像。
  2. 在ImageJ中打开保存的图像。进入分析选项卡，选择设置测量选项，并勾选面积选项。
  3. 使用工具栏中的椭圆选择工具，在一个聚焦清晰的类球体周围绘制椭球形或圆形区域。
  4. 进入分析选项卡并选择测量选项。重复步骤3.4和3.5，以获得25-50个SBNET类球体的面积测量值。测量结果以像素平方为单位提供。
  5. 通过将每个像素的尺寸除以显微图像的像素长度至微米（µm）的转换系数，将像素面积转换为µm2。
    注意：SBNET细胞主要以类球体形式生长，有时也以椭球体形式生长。

4. 通过免疫荧光法对SBNETS类球体进行表征

  1. 使用 P1000 移液器将生长在 ECM 中的类器官转移至 1.5 mL 离心管中。
  2. 在 1,500 × g 条件下离心 1 分钟，并移除上清液。
  3. 加入 1 mL PBS 洗涤类器官培养物，混匀后在 1,500 × g 条件下离心 1 分钟，并移除上清液。
  4. 加入 500 µL 4% 多聚甲醛固定类器官，室温孵育 15 分钟。
  5. 用 1 mL PBS 洗涤培养物两次。
  6. 加入 500 µL PBS + 3% BSA + 0.1% Triton X-100，室温孵育 5 分钟以进行通透处理。
  7. 随后用 1 mL PBS + 3% BSA 洗涤三次。
  8. 在抗体稀释液（2.5% 牛血清白蛋白、0.1% 叠氮化钠、25 mM Tris pH 7.4、150 mM 氯化钠）中，加入终浓度为 1/600 稀释的突触素（SYP）10 一抗，或终浓度为 1/400 稀释的嗜铬粒蛋白 A（CgA）11 和生长抑素受体 2（SSTR2）12 一抗，4°C 孵育 1 小时。
    注意：每管使用不少于 300 µL 的抗体溶液。
  9. 用 1 mL PBS + 3% BSA 洗涤三次。
  10. 在抗体稀释液中加入终浓度为 1/500 稀释的 FITC 标记二抗，每管加入不少于 300 µL，室温孵育 1 小时。
  11. 用 1 mL PBS + 3% BSA 洗涤三次，确保彻底吸除并弃去所有上清液。
  12. 加入 5 µL 含有核染料 DAPI 的封片剂。
  13. 使用 P20 移液器将步骤 4.12 中的 SBNET 类球体取 5 µL 滴加至载玻片上，加盖盖玻片封片。
  14. 使用荧光显微镜，选择 10x、20x 或 40x 物镜进行成像。

5. 通过免疫组织化学法（IHC）对SBNET类球体进行表征

  1. 使用 P1000 移液器将 SBNET 类球体从培养板转移至 1.5 mL 离心管中。
  2. 在 1,500 xg 条件下离心 1 分钟，弃去上清液。
  3. 向步骤 5.2 的离心管中加入 500 µL 10% 福尔马林固定 SBNET 类球体，室温孵育 2–5 天，随后进行石蜡包埋并切取 4 µm 厚的类球体切片。
  4. 脱蜡、水化，并在 pH 9 的抗原修复液中进行热诱导表位修复：使用多功能全自动切片处理系统，在 97 °C 下加热 20 分钟，以制备用于抗体孵育的切片。
  5. 封闭切片后，分别加入针对 SYP10（1/100 稀释，孵育 15 分钟）、CgA11（1/800 稀释，孵育 15 分钟）和 SSTR212（1/5,000 稀释，孵育 30 分钟）的一抗进行孵育。
  6. 分别使用二抗检测系统孵育 15 分钟（用于抗 SYP 和 CgA 染色）或 30 分钟（用于抗 SSTR2 染色），然后使用 400 倍物镜拍摄图像。

6. 使用雷帕霉素处理SBNET类器官

  1. 将雷帕霉素溶于DMSO中，配制成10 mM的储存液。
  2. 配制含DMSO的SBNET培养基（例如：1 mL SBNET培养基 + 1 µL DMSO）以及含10 µM雷帕霉素的SBNET培养基（例如：1 mL SBNET培养基 + 1 µL 10 mM雷帕霉素储存液）。
  3. 将200 µL含DMSO或10 µM雷帕霉素的SBNET培养基转移至SBNET类球体培养物中。
  4. 将SBNET类球体在37 °C培养箱中孵育5天。
  5. 加入1 µM的溴化乙锭同型二聚体（ethidium homodimer），孵育30分钟。移除含溴化乙锭同型二聚体的培养基，用200 µL PBS洗涤一次，然后向每孔加入200 µL PBS。
  6. 使用荧光显微镜的10x、20x或40x物镜，配合红色滤光片（红色滤光片G，参见材料表），拍摄经药物处理与未处理的SBNET类球体的显微图像。
    注意：经溴化乙锭同型二聚体染色的死亡细胞在红色滤光片下呈红色。也可使用分光光度计在535 nm激发波长和624 nm发射波长下检测该信号。

7. 分离 SBNET 类球体

注意：此步骤用于扩增样本，并便于与其他研究人员共享。

  1. 使用 P1000 移液器机械性破坏 ECM，并将含有 SBNET 类球体的 ECM 吸取至无菌的 1.5 mL 离心管中。
  2. 在 4 °C 下以 1,000 x g 离心，彻底去除上清液，并将离心管置于冰上。
  3. 向沉淀中加入 2–4 倍体积的新 ECM。通过上下吹打 10 次，将新 ECM 与原有的 ECM 及 SBNET 类球体充分混匀，注意避免产生气泡。
  4. 将 5–20 µL 的 ECM 与 SBNET 类球体混合液转移至新培养板中，静置使 ECM 凝固。
  5. 加入新鲜的 SBNET 培养基覆盖，然后将培养板放入培养箱中。回收率约为 95% 至 100%。
  6. 若需将 SBNET 类球体运送至其他实验室，应将含有 SBNET 类球体的新 ECM 转移至 T25 培养瓶中，待 ECM 凝固。
  7. 用 SBNET 类球体培养基充满 T25 培养瓶，拧紧瓶盖，并准备运输包装。
  8. 收到 SBNET 类球体培养物后，移除培养基，并执行步骤 7.1 至 7.5，使 SBNET 类球体重新进入培养状态。

8. SBNET 类球体的冷冻保存与复苏

  1. 将5-10个小型孔中的SBNET类球体转移至15 mL离心管中。在4 °C条件下以500 × g离心15分钟，弃去上清液，用冻存液（90% FBS + 10% DMSO）重悬，置于细胞冻存盒中，并放入-80 °C冰箱保存。
  2. 长期储存时转移至液氮中。
  3. 复苏SBNET类球体时，将冻存管置于冰上，待内容物完全解冻。颠倒离心管并重新放回冰上，以加快解冻过程。
  4. 样品完全解冻后，将其放入预冷的离心机中，以1,000 × g离心10分钟。
  5. 弃去上清液，用ECM重悬类球体。将离心管保持在冰上，取20 µL转移至新培养板中，并等待ECM凝固。
  6. 加入200 µL含10 µM ROCK抑制剂（Y-27632）13的SBNET培养基，然后将培养板放入培养箱中。
  7. 让SBNET类球体恢复并培养1周。移除旧的培养基，补充200 µL新鲜SBNET培养基，再放回培养箱中继续培养。
  8. 继续培养SBNET类球体。
    注意：快速生长的类球体在冻存后至少需要1周时间才能开始恢复13。SBNET类球体则至少需要2-4周才开始生长。许多SBNET细胞在前两周内会死亡，存活率低于10%。由于该过程耗时且得率低，建议与其他研究人员共享培养瓶中的SBNET类球体（如步骤7所述）。仅在发生细菌污染等意外情况时，才应使用冻存与复苏作为备用方案。

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结果

目前仅有2株SBNET细胞系被建立并发表2,3,4,5，且这些细胞系难以被多数研究人员获取。本文提出将SBNET细胞在细胞外基质（ECM）中以类球体形式进行培养，并将其作为研究SBNET药物敏感性的替代模型。本研究收集了一例转移至肝脏的SBNET患者来源的肿瘤组织，经消化释放出SBNET细胞后，与液态ECM混合，用于建立SBNET类球体培养体系（图1A）。该SBNET组织的Ki-67指数为4.3%。尽管SBNET类球体生长缓慢，但其生长情况可通过显微成像进行监测（图1A）。当培养基每周更换一次时，SBNET类球体约需14天时间实现体积翻倍（图1

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讨论

肿瘤三维培养已成为临床前药物测试的重要资源15。近年来，已从乳腺癌和前列腺癌肿瘤中建立了多种肿瘤类器官生物样本库16,17。在本研究中，我们提供了一种详细的培养小肠神经内分泌肿瘤（SBNET）为球状体的实验方案，以及一种简单快速的方法，通过免疫荧光检测验证球状体培养物中神经内分泌肿瘤标志物的表达，并评估其药物敏感性。根据我们的经验，SBNET球状体可在多种培养基中生长。在我们基于已发表方案9改良的人胰腺或肝脏干细胞培养基中，其生长速度略快。但我们选择使用添加胰岛素和烟酰胺的DMEM/F12培养基培养SBNET，因为该培养基比干细胞培养基成本更低。提高胎牛血清的比例是促进SBNET类器官培养生长的另一种策略；然而，这也会增加培养维持的整体成本。

使用10倍、20倍或40倍物镜通过荧光显微镜进行免疫荧光（IF）染色和成像，是检测SBNET标志物表达的快速且简便的方法。然而，与...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为P50 CA174521（资助J.R. Howe和A.M. Bellizzi）。P.H. Ear获得了P50 CA174521职业提升计划项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗兔 FITCJackson ImmunoResearch11-095-152与绿色荧光染料偶联的二抗
抗原修复液Agilent DakoS2367pH 9 的溶液，用于免疫组化切片的预处理
Autostainer Link 48Agilent Dako不可用用于抗体染色的自动化系统
细胞冻存容器Thermo Scientific5100-0001用于冷冻细胞的容器
CellSenceOlympus版本 1.18用于荧光显微镜的计算机软件
嗜铬粒蛋白 A 抗体Abcam-45179RB-9003-PO用于免疫荧光的抗体
嗜铬粒蛋白 A 抗体（克隆 LK2H10）Thermo ScientificMA5-13096用于免疫组化的抗体
胶原酶SigmaC0130用于消化肿瘤组织的酶
DMEMGibco11965-092组织制备用培养基
DMEM/F12Gibco11320-033类器官培养用培养基
DMSOSigmaD8418用于溶解药物的溶剂
DNA酶SigmaDN25用于消化肿瘤组织的酶
溴化乙锭同型二聚体ChemodexCDX-E0012-T1E结合 DNA 和 RNA 的染料
FBSGibco16000044培养基用试剂
荧光显微镜OlympusCKX35用于拍摄 SBENT 类球体图像的显微镜
谷氨酰胺GibcoA2916801培养基用试剂
ImageJ美国国立卫生研究院版本 1.51用于图像分析的计算机软件
胰岛素SigmaI0516培养基用试剂
MatrigelCorning356235用于包埋和固定类器官的基质
封片剂（VECTASHIELD）Vector LaboratoriesH-1200含核染色剂的标记细胞固定封片剂
烟酰胺Sigma72340培养基用试剂
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710用于固定细胞的试剂
青霉素/链霉素（PEN/STREP）Gibco15140-122培养基用试剂
PT LinkAgilent Dako不可用用于免疫组化染色前切片处理的自动化系统
雷帕霉素Alfa AesarJ62473可抑制神经内分泌肿瘤生长的药物
免疫组化二抗Agilent DakoK8000使用基于聚合物的 EnVision FLEX 系统的免疫组化二抗
SSTR2 抗体GeneScritpA01591用于免疫荧光的抗体
SSTR2 抗体（克隆 UMB1）Abcamab134152用于免疫组化的抗体
突触素抗体Abcam32127用于免疫荧光的抗体
突触素抗体（克隆 DAK-SYNAP）Agilent DakoM7315用于免疫组化的抗体
TritonXMallinckrodt3555 KBGE用于细胞通透的试剂
Y-2763 ROCK 抑制剂AdipogenAG-CR1-3564-M005用于提高 SBNET 类球体冻融后存活率

参考文献

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