小肠神经内分泌肿瘤类球体的建立与表征

摘要

神经内分泌肿瘤（NETs）起源于神经嵴的神经内分泌细胞。这类肿瘤生长缓慢，且培养难度较大。我们提出一种替代策略，通过将小肠来源的NETs以球状体形式进行培养来实现其体外扩增。这些球状体表达小肠神经内分泌肿瘤标志物，并可用于药物测试。

摘要

小肠神经内分泌肿瘤（SBNETs）是一类起源于肠道肠嗜铬细胞的罕见癌症。由于目前建立的源自患者的SBNET细胞系极少，该领域的研究受到严重限制。分化良好的SBNET细胞增殖缓慢，难以扩增培养。已建立的少数细胞系难以获取，且在长期培养后可能逐渐失去神经内分泌肿瘤细胞的特征。由于SBNET细胞倍增时间较长，且需要经过多次富集步骤以清除快速增殖的肿瘤相关成纤维细胞，因此新细胞系的建立可能耗时多年。为克服这些局限，我们开发了一种从手术切除的肿瘤组织中在细胞外基质（ECM）中以类球体形式培养SBNET细胞的方案。ECM形成一种三维结构，包裹SBNET细胞并模拟肿瘤微环境，从而支持SBNET细胞的生长。本文中，我们表征了SBNET类球体的生长速率，并描述了利用免疫荧光显微镜和免疫组织化学检测SBNET标志物的方法，以确认类球体确为神经内分泌肿瘤细胞。此外，我们还利用SBNET类球体检测雷帕霉素的细胞毒性作用。

引言

小肠神经内分泌肿瘤（SBNETs）起源于小肠的肠嗜铬细胞。尽管SBNETs通常生长缓慢，但常发生肝转移¹。虽然在许多情况下可考虑手术切除或肿瘤消融治疗，但复发几乎不可避免，因此药物治疗在疾病管理中具有重要作用。研究人员已投入大量努力以建立可用于药物筛选的新SBNET细胞系，但进展甚微。目前仅有6种SBNET细胞系（KRJ-I、CND2、GOT1、P-STS、L-STS、H-STS）被报道^2,3,4,5；遗憾的是，其中一种细胞系已不再表达神经内分泌肿瘤标志物⁶，另有三种SBNET细胞系（KRJ-I、L-STS、H-STS）被证实来源于转化的淋巴母细胞，而非神经内分泌肿瘤⁷。为了加快针对SBNETs的药物筛选进程，亟需建立替代性的体外药物测试方法。

此处，我们采用 利用可获取的切除小肠神经内分泌肿瘤（SBNETs）组织，我们已建立了一种将患者来源的SBNETs在细胞外基质（ECM）中以类球体形式进行培养的方法。本论文的总体目标是描述一种将SBNETs进行三维（3D）培养的技术....

方案

所有使用人神经内分泌肿瘤样本的实验均已获得爱荷华大学医院和诊所机构审查委员会（IRB）的批准（方案编号 199911057）。所有材料和设备的清单见材料表。培养基和关键溶液的列表见表1。

1. 小肠神经内分泌肿瘤（SBNET）的采集与细胞解离

1. 从外科病理学核心实验室获取经肿瘤组织确认的患者SBNET切除样本。
2. 将SBNET组织切成5 mm 的立方体，并置于含有25 mL DMEM/F12培养基的锥形管中，用于运输至实验室。
3. 将肿瘤转移至含有1% FBS、1%青霉素/链霉素（Pen/Strep）、1%谷氨酰胺的DMEM培养基（洗涤培养基）中，并在该洗涤培养基中孵育15分钟。
4. 将肿瘤转移至新的培养皿中，使用无菌弯头剪刀将组织剪切成小于1 mm的小块。
5. 将剪碎的组织转移至含有25 mL洗涤培养基的新50 mL离心管中。
6. 在4 °C条件下，以500 × g 离心15分钟。
7. 弃去上清液，并将沉淀物重悬于10 mL含有胶原酶（100 U/mL）和DNase（0.1 mg/mL）的洗涤培养基中。
8. 将剪碎的肿瘤组织在37 °C培养箱中以缓慢振荡（50 rpm）消化1.5小时。

结果

目前仅有2株SBNET细胞系被建立并发表^2,3,4,5，且这些细胞系难以被多数研究人员获取。本文提出将SBNET细胞在细胞外基质（ECM）中以类球体形式进行培养，并将其作为研究SBNET药物敏感性的替代模型。本研究收集了一例转移至肝脏的SBNET患者来源的肿瘤组织，经消化释放出SBNET细胞后，与液态ECM混合，用于建立SBNET类球体培养体系（图1A）。该SBNET组织的Ki-67指数为4.3%。尽管SBNET类球体生长缓慢，但其生长情况可通过显微成像进行监测（图1A）。当培养基每周更换一次时，SBNET类球体约需14天时间实现体积翻倍（图1

讨论

肿瘤三维培养已成为临床前药物测试的重要资源¹⁵。近年来，已从乳腺癌和前列腺癌肿瘤中建立了多种肿瘤类器官生物样本库^16,17。在本研究中，我们提供了一种详细的培养小肠神经内分泌肿瘤（SBNET）为球状体的实验方案，以及一种简单快速的方法，通过免疫荧光检测验证球状体培养物中神经内分泌肿瘤标志物的表达，并评估其药物敏感性。根据我们的经验，SBNET球状体可在多种培养基中生长。在我们基于已发表方案⁹改良的人胰腺或肝脏干细胞培养基中，其生长速度略快。但我们选择使用添加胰岛素和烟酰胺的DMEM/F12培养基培养SBNET，因为该培养基比干细胞培养基成本更低。提高胎牛血清的比例是促进SBNET类器官培养生长的另一种策略；然而，这也会增加培养维持的整体成本。

使用10倍、20倍或40倍物镜通过荧光显微镜进行免疫荧光（IF）染色和成像，是检测SBNET标志物表达的快速且简便的方法。然而，与.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗兔 FITC	Jackson ImmunoResearch	11-095-152	与绿色荧光染料偶联的二抗
抗原修复液	Agilent Dako	S2367	pH 9 的溶液，用于免疫组化切片的预处理
Autostainer Link 48	Agilent Dako	不可用	用于抗体染色的自动化系统
细胞冻存容器	Thermo Scientific	5100-0001	用于冷冻细胞的容器
CellSence	Olympus	版本 1.18	用于荧光显微镜的计算机软件
嗜铬粒蛋白 A 抗体	Abcam-45179	RB-9003-PO	用于免疫荧光的抗体
嗜铬粒蛋白 A 抗体（克隆 LK2H10）	Thermo Scientific	MA5-13096	用于免疫组化的抗体
胶原酶	Sigma	C0130	用于消化肿瘤组织的酶
DMEM	Gibco	11965-092	组织制备用培养基
DMEM/F12	Gibco	11320-033	类器官培养用培养基
DMSO	Sigma	D8418	用于溶解药物的溶剂
DNA酶	Sigma	DN25	用于消化肿瘤组织的酶
溴化乙锭同型二聚体	Chemodex	CDX-E0012-T1E	结合 DNA 和 RNA 的染料
FBS	Gibco	16000044	培养基用试剂
荧光显微镜	Olympus	CKX35	用于拍摄 SBENT 类球体图像的显微镜
谷氨酰胺	Gibco	A2916801	培养基用试剂
ImageJ	美国国立卫生研究院	版本 1.51	用于图像分析的计算机软件
胰岛素	Sigma	I0516	培养基用试剂
Matrigel	Corning	356235	用于包埋和固定类器官的基质
封片剂（VECTASHIELD）	Vector Laboratories	H-1200	含核染色剂的标记细胞固定封片剂
烟酰胺	Sigma	72340	培养基用试剂
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710	用于固定细胞的试剂
青霉素/链霉素（PEN/STREP）	Gibco	15140-122	培养基用试剂
PT Link	Agilent Dako	不可用	用于免疫组化染色前切片处理的自动化系统
雷帕霉素	Alfa Aesar	J62473	可抑制神经内分泌肿瘤生长的药物
免疫组化二抗	Agilent Dako	K8000	使用基于聚合物的 EnVision FLEX 系统的免疫组化二抗
SSTR2 抗体	GeneScritp	A01591	用于免疫荧光的抗体
SSTR2 抗体（克隆 UMB1）	Abcam	ab134152	用于免疫组化的抗体
突触素抗体	Abcam	32127	用于免疫荧光的抗体
突触素抗体（克隆 DAK-SYNAP）	Agilent Dako	M7315	用于免疫组化的抗体
TritonX	Mallinckrodt	3555 KBGE	用于细胞通透的试剂
Y-2763 ROCK 抑制剂	Adipogen	AG-CR1-3564-M005	用于提高 SBNET 类球体冻融后存活率