本文介绍了一种用于长时间延时共聚焦显微镜观察的脆弱斑马鱼胚胎固定方法。该低成本方法易于操作，可使用常规的玻璃底培养皿，在任何倒置显微镜上进行成像。固定过程采用不同浓度的琼脂糖分层进行。
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本文内容
摘要
摘要
通过共聚焦延时显微镜观察表达特定组织或细胞荧光的活体转基因斑马鱼胚胎，可以追踪发育过程的动态变化。对整个胚胎发育进行成像的一个难点在于斑马鱼胚胎在长度上会显著生长。当常规使用0.3–1%低熔点琼脂糖包埋时，琼脂糖会对胚胎施加生长限制，导致柔软的胚胎体发生形变。然而，进行共聚焦延时显微镜观察时又必须固定胚胎以实现 immobilization。本文介绍一种分层包埋斑马鱼胚胎的方法，该方法在限制胚胎运动的同时允许其自由生长。该包埋方法采用不同浓度的琼脂糖分层构建。为验证该方法的可用性，我们对转基因鱼中整个胚胎的血管、神经元和肌肉发育过程连续成像达55小时。该包埋方法可用于使用倒置显微镜对完整斑马鱼胚胎进行简便、低成本的成像，无需模具或特殊设备。
引言
斑马鱼长期以来一直是发育生物学研究的模式生物，显微镜技术是观察胚胎发育的主要方法。利用斑马鱼胚胎进行发育研究的优势包括个体小、组织透明、发育迅速，以及成鱼繁殖力高。通过构建在特定组织或细胞中表达荧光蛋白的转基因斑马鱼品系，研究人员能够直接观察组织发育过程，这是在体型较大的脊椎动物中难以实现的。结合延时显微成像技术，可方便地研究组织发育的细节及其动态变化过程。
对斑马鱼发育过程进行成像的一个难点在于胚胎在长度上会显著增长；在生命最初的3天内，胚胎的长度会伸长至原来的4倍1。此外，早期胚胎的身体柔软，若生长受到限制，很容易发生形变。然而，进行共聚焦显微镜观察时，必须将胚胎固定。为了在共聚焦延时成像过程中保持胚胎位置固定，通常会将胚胎麻醉后包埋于0.3–1%的低熔点琼脂糖中。这种方法的优点是在一定时间内允许胚胎适度生长，同时限制其运动，从而可高效地对胚胎的某些部分进行成像。然而，当使用该方法对整个胚胎进行长时间成像时，由于琼脂糖限制了胚胎的生长，会导致形变现象。因此，需要采用其他固定方法。Kaufmann 及其同事描述了一种用于光片显微镜（如选择性平面照明显微镜，SPIM）的斑马鱼胚胎替代固定方法，即将胚胎包埋于含低浓度琼脂糖或甲基纤维素的氟化乙烯丙烯共聚物（FEP）管中2。该技术能够实现对胚胎发育过程的高质量时序可视化。Schmid 等人描述了在FEP管中将多达六个胚胎以琼脂糖固定用于光片显微镜成像的方法3，可在一次成像过程中同时观察多个胚胎。已有研究使用模具构建胚胎阵列，以实现大量胚胎的高效固定4。Masselkink 等人设计了3D打印的塑料模具，可用于制作硅胶铸模，将不同发育阶段的斑马鱼胚胎置于其中，从而实现成像时胚胎位置的恒定，包括共聚焦成像5。3D打印技术还被用于制作可在96孔板格式中实现斑马鱼胚胎一致定位的模具6。部分模具针对特定发育阶段定制，可能无法支持长时间的自由生长，而另一些模具则更具灵活性。最近，Weijts 等人公布了一种四孔培养皿的设计与制备方法，用于斑马鱼胚胎的活体成像7。在该培养皿中，麻醉后的鱼胚胎尾部和躯干部被手动放置在盖玻片上方紧贴的一层透明硅胶顶盖下方，形成一个容纳腔。随后加入0.4%琼脂糖将胚胎固定在此位置。该固定方式可对约2 mm长的胚胎后部（躯干和尾部）进行成像，且每个孔最多可固定12个胚胎，因而支持多个样本的同时成像。类似地，Hirsinger 和 Steventon 最近提出一种方法，将鱼的头部包埋于琼脂糖中，而尾部可自由生长，该方法同样能高效实现对胚胎躯干和尾部区域的成像8。
本文介绍了一种用于斑马鱼胚胎的分层固定方法，该方法在限制胚胎运动的同时允许其自由生长。该固定方法的优点在于成本低、操作快速简便，适用于在任何倒置显微镜下对不同发育阶段的胚胎进行成像。该方法支持在胚胎发育过程中对整个身体（头部、躯干和尾部）进行长期成像。为展示该方法的实用性，本文对转基因斑马鱼中整个胚胎的血管、神经和肌肉发育过程进行了成像。通过延时显微成像技术，每轮实验对两个胚胎在两个波长下进行三维成像，连续成像55小时，从而生成组织发育的动态影像。
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方案
本研究中的动物实验已获得休斯顿大学和印第安纳大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 鱼类饲养
注意：使用脊椎动物模型的研究需遵循经 IACUC 批准的实验方案，并应根据相关的国家和国际指南进行操作。
- 按照先前已发表的文献所述方法饲养成年斑马鱼9。
- 下午将成年斑马鱼放入繁殖缸中，按1:2的雄雌比例进行配对繁殖。
2. 溶液的配制
- 在胚胎培养基（E3：5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO4，调至pH 7.0）中配制1%低熔点琼脂糖的储存液。将储存液分装至1.5 mL离心管中，于4 °C保存。
- 用蒸馏水配制4%（w/v）三卡因（Tricaine，MS-222）储存液。置于4 °C避光瓶中保存。
注意：三卡因具有毒性，称量和溶解时应在通风橱中进行。 - 用蒸馏水配制20 mM N-苯硫脲（PTU）储存液。于-20 °C保存。
3. 胚胎的制备
- 交配后，在培养皿的 E3 培养基中收集胚胎，并在 26.5 °C 下孵育约 28 小时后再进行装片。
注意：这可以减缓胚胎的发育速度，使胚胎在成像开始时大约处于 30 体节期。 - 用含 0.016–0.020% 三卡因（Tricaine）的 E3 培养基麻醉胚胎。为抑制色素形成，加入 PTU 至终浓度为 200 µM。
- 在解剖显微镜下使用镊子去除胚胎的绒毛膜。用两把镊子夹住绒毛膜并轻轻拉开，以释放胚胎。
4. 琼脂糖包埋
注意：所建立的固定方法需要在含0.02%三卡因和PTU的E3溶液中，使用两种不同浓度的低熔点琼脂糖。第一种琼脂糖溶液包含琼脂糖的最佳浓度，在该浓度下样品变形和运动性均最小。该优化过程在下文步骤5中描述。
- 将两层琼脂糖溶液（浓度见下文步骤5定义及1%）加热至65 °C。在固定胚胎前，让琼脂糖冷却至约30 °C，以避免高温损伤胚胎。固定时使用底部为玻璃的35 mm培养皿，其底部附有No. 0盖玻片。附着在皿底的盖玻片形成一个10 mm直径的浅井（深度约1.2 mm），胚胎将被放置于此浅井中。
注意：在此情况下，运动性最低且形变最小的琼脂糖浓度介于0.025%至0.040%之间。 - 使用玻璃移液管或微量移液器，将去壳的胚胎轻轻放置于培养皿底部，使其一侧朝下。若使用微量移液器，可剪去吸头外端以增大开口，便于容纳胚胎（图1A）。随后用微量移液器小心吸除残留的E3溶液。
- 将第一层琼脂糖溶液加入由皿底盖玻片形成的浅井中，使其完全覆盖胚胎（第一层）（图1B）。确保琼脂糖充满浅井但不溢出。
- 用一片盖玻片（22 mm × 22 mm）覆盖该浅井（图1C），从而在两片盖玻片之间形成一个狭窄的、充满琼脂糖的空间，胚胎即位于其中。
- 在整个培养皿底部的盖玻片上方覆盖一层1%琼脂糖溶液（第二层）（图1D）。此层凝固后可固定住上方的盖玻片。
- 向培养皿其余空间加入含0.02%三卡因（Tricaine）的E3溶液，以保持系统湿润（第三层）（图1E）。
注意：在此装置中，盖玻片和1%琼脂糖层可防止底层琼脂糖被稀释。
5. 第一层琼脂糖溶液的优化
- 为了确定第一层琼脂糖的最佳浓度，采用多尺度网格搜索方法。将胚胎以浓度范围为0.01%至1%的琼脂糖逐步封片，随后对视野中胚胎的生长受限情况和运动性进行延时成像。找出使形变和运动性均达到最小的琼脂糖浓度。
- 为进一步优化琼脂糖浓度，根据步骤5.1中确定的最佳浓度（例如0.025%、0.028%、0.031%等），使用更精细浓度梯度的琼脂糖（例如0.025%至0.040%之间）对胚胎进行封片。
注：在本实验室中，最佳琼脂糖浓度约为0.03%。
6. 时间序列成像
注意：此封片方法适用于任何具有荧光和明场成像延时功能的倒置显微镜。
- 对整个胚胎或其部分进行长达 55 小时的延时成像。若需对多个胚胎成像，使用可承载多个培养皿的载物台适配器，每个培养皿中固定一个胚胎。逐一旋转培养皿，使胚胎大致呈水平位置，通过肉眼判断确定。为获得最佳的胚胎生长与发育状态，使用设定在 28.5 °C 的显微镜载物台培养箱。
- 在显微镜软件中选择低倍物镜。通过目镜，利用明场照明观察胚胎，并通过旋转培养皿进行精细调平，使胚胎水平对齐，同时在软件中记录其位置。创建文件名以自动保存数据。
注意：本实验中使用了 Plan Apo λ 4x 0.2 NA 物镜，并在 ND 采集 窗口的 XY 选项卡中记录胚胎位置。数据以 .nd2 格式保存。通过点击 Ti Pad 选项卡中的图标选择相应物镜。 - 设置针孔大小、扫描速度、图像尺寸和缩放倍数。随后，选择更高倍率的物镜用于图像采集。
注意：本实验中使用 Plan-Apo 10x 0.45 NA 物镜对整个胚胎成像，使用 Super-Fluor 20x 0.75 NA 物镜对胚胎局部进行高倍成像。针孔设为 1.2 AU（10x 镜头对应 19.2 µm），扫描速度设为像素驻留时间为 2.4 µs，图像尺寸设为 1024 x 1024 像素，扫描缩放倍数为 1，由此得到 10x 镜头的像素尺寸为 1.24 µm，20x 镜头为 0.62 µm。 - 选择需成像的荧光通道。逐个调整各荧光通道的图像采集参数。对每个荧光通道，调节激光功率和探测器高压，确保在避免信号饱和和减少光漂白的前提下，获得最佳动态范围。
注意：本实验中，GFP 使用 488 绿色通道成像（488 nm 激光，发射波长 500–550 nm），RFP 使用 561 红色通道成像（561 nm 激光，发射波长 570–600 nm），透射光图像则使用 561 nm 激光和透射光探测器（TD 通道）采集。 - 使用 10x 物镜对整个胚胎成像时，应采集多个有重叠区域的视野，并利用显微镜软件将它们拼接成完整图像。
注意：由于胚胎在成像过程中会显著增大，需确保胚胎前后方向的视野中留有足够空间。使用 ND 采集 窗口中的 扫描大图像 选项卡，选择 4 x 1 模式并设置 10% 重叠，以采集四个相邻的视野。 - 使用显微镜软件配置 Z 轴层扫图像的采集参数。
注意：由于胚胎紧贴玻璃培养皿底部固定，随着其生长，其中心会逐渐远离底部。使用 ND 采集 窗口的 Z 选项卡，选择 非对称相对范围。该方法以当前焦平面作为 参考平面，其余层面在上下方非对称分布，以包含整个胚胎的 Z 轴体积，并预留足够空间以适应样本生长。在所有实验中，层间距设为 11 µm，总层数约为 45 层。 - 为在长期延时成像过程中维持多个胚胎的聚焦状态，使用自动对焦功能。若同时成像多个胚胎，需为每个胚胎单独调整偏移量，以确保聚焦于 参考平面。
注意：本实验中使用了基于激光的自动对焦稳定系统。 - 在显微镜软件中设置延时参数，以约 1 小时间隔进行 55 小时的成像。每个周期内依次采集两个胚胎的数据集，并在每次循环后自动保存数据。
- 使用显微镜软件的在线或离线版本处理图像。若成像了多个胚胎，应根据成像位置将数据集拆分，为每个胚胎创建独立的文件。使用最大强度投影或其他类似工具，将三维时间数据集转换为二维时间数据集。通过 另存为 菜单选项，选择 .avi 格式创建视频文件。选择 无压缩 选项，设置 200 ms 间隔，以实现每秒 5 帧的播放速度。
注意：本实验中，两个胚胎的原始数据集通过软件中的 拆分位置 功能（文件 | 导入/导出 | 拆分多点）进行拆分。三维时间数据集通过 最大强度投影 功能（图像 | ND 处理 | 在 Z 轴创建最大强度投影图像）转换为二维时间数据集。
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结果
包埋方法的开发
本研究的主要目的是建立一种低成本的包埋技术，用于长时间的斑马鱼发育过程延时成像。分层包埋法的开发旨在允许脆弱的斑马鱼胚胎身体充分生长，同时限制其运动。如果第一层琼脂糖浓度过高，胚胎将发生形变和弯曲（图2）。在0.1%和0.5%琼脂糖中培养的胚胎表现出尾部缩短、鳍部畸形以及头部弯曲。相反，如果琼脂糖浓度过低，即使使用麻醉剂，胚胎在延时显微观察过程中仍会移出视野，因为生长中的尾部会从胚胎主体摆动而出，导致整体移动。在我们的实验中，不同批次的琼脂糖所对应的最优浓度介于0.028%至0.034%之间。当琼脂糖浓度低于0.025%时，无法提供足够的阻力以保持胚胎停留在视野内。
血管、神经和肌肉发育的延时成像
在优化上述固定方法后，通过共聚焦显微镜进行了长达55小时的延时成像。我们对在不同组织中表达GFP或RFP的活体转基因斑马鱼进行了成像。使用具有内源性荧光的转基因鱼进行延时成像的一个优势在于，活胚胎能够持续产生荧光蛋白分子（如GFP...
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讨论
本文介绍了一种用于长时间延时共聚焦显微镜观察斑马鱼全胚胎的固定方法。该固定方法最关键的一步是确定最佳浓度的琼脂糖，使其既能允许斑马鱼胚胎自由生长，又能将胚胎完全固定在某一位置以进行共聚焦成像。由于最佳琼脂糖浓度范围非常狭窄，该数值对配制溶液时琼脂糖称重和E3体积测量的误差极为敏感。最佳浓度还可能受温度及胚胎发育阶段的影响。因此，对于每一批新配制的琼脂糖溶液，都需要通过重复测试不同浓度来重新确定其最佳浓度。
另一个关键步骤是在封片方法中添加第二层琼脂糖。第二层琼脂糖用于固定盖玻片的位置。必须小心地将第二层琼脂糖分次少量加入培养皿中，以避免导致盖玻片移动。第二层琼脂糖还起到对E3溶液的可渗透屏障作用。如果没有E3溶液，胚胎在成像过程中会干燥；如果没有第二层琼脂糖，盖玻片和胚胎将开始漂浮。
该固定方法的一个局限性在于，虽然它适用于倒置显微镜，但不适用于正置显微镜。曾多次尝试使用正置显微镜进行延时成像，方法是将玻璃底培养皿中加入E3培养基，用封口膜密封后倒置。然而，这种方法常常导致在成像过程中固定结构部分塌陷。这可能是由于样品在长时间...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Albert Pan和Arndt Sieakmann惠赠转基因鱼。感谢日本文部科学省日本国立遗传学研究所的Koichi Kawakami以及日本国家生物资源项目惠赠转基因斑马鱼HGn39b。同时感谢Fatima Merchant和Kathleen Gajewski在共聚焦显微镜方面的协助，以及Tracey Theriault提供照片。
本研究获得了美国国立卫生研究院国家环境卫生科学研究所的资助（资助号 P30ES023512 和合同号 HHSN273201500010C）。SU 获得了凯克计算癌症生物学项目（墨西哥湾沿岸联盟 CPRIT 资助 RP140113）和 Hugh Roy 与 Lillie Endowment 基金的支持。J-Å G 获得了罗伯特·A·韦尔奇基金会（E-0004）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 低熔点琼脂糖 | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | 将溶解后的溶液储存于 4 °C |
| 35 mm 玻璃底培养皿，带 No. 0 盖玻片，玻璃底直径为 10 mm | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| 三卡因（MS-222） | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | 将溶解后的溶液储存于 4 °C |
| N-苯硫脲（PTU） | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | 将溶解后的溶液储存于 -20 °C |
| 22x22 mm 显微盖玻片 | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 荧光显微镜 | Leica | NA | |
| LAS X 软件 | Leica | NA | 显微镜软件 |
| DMC4500 数字显微镜相机 | Leica | NA | |
| Nikon A1S 共聚焦显微镜 | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR 版本 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | 显微镜软件 |
参考文献
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