跟踪小啮齿动物社会偏好行为动态的系统

Summary

这里描述的是一种新型的自动化实验系统，它提供了三室测试的替代方案，并解决了几个注意事项。该系统提供多种行为参数，能够在社会偏好和社会新奇偏好测试中对小啮齿动物行为动态进行严格分析。

Abstract

探索社会行为的神经生物学机制需要行为测试，可以以不偏不倚和独立于观察者的方式应用于动物模型。自千年伊始，三室测试被广泛用作评估小啮齿动物的社交性（社会偏好）和社会新奇偏好的标准范例。然而，此测试受到多重限制，包括其对空间导航的依赖和行为动力学的疏忽。这里介绍和验证的是一个新的实验系统，它提供了一个替代三室测试，同时也解决了它的一些警告。该系统需要一个简单且经济实惠的实验设备和公开可用的开源分析系统，该系统可在个人和人口层面自动测量和分析多个行为参数。它允许在任何社会歧视测试中详细分析小啮齿动物的行为动态。在成年雄性小鼠和大鼠进行的社会偏好和社会新奇偏好测试中，证明了系统在分析社会行为动态方面的效率。此外，我们验证系统在诸如胡须修剪等操作后揭示啮齿动物社会行为修正动态的能力。因此，该系统允许对小型啮齿动物模型中的社会行为和动态进行严格调查，并支持对菌株、条件和治疗进行更准确的比较。

Introduction

揭示神经发育障碍（NDDs）背后的生物机制是神经科学领域的主要挑战之^一。解决这一挑战需要行为范式和实验系统，以标准和公正的方式代表啮齿动物的行为。十多年前，莫伊^{及其同事发表了}一份有影响力的研究报告，提出了三室测试。从那时起，该测试被广泛用于研究NDD的啮齿动物模型中的社会行为。此测试评估了啮齿动物的两种与生俱来的倾向:1） 保持在社会刺激的接近性上而不是对象（社交性，也称为社会偏好 [SP]），2） 更喜欢新颖的社会刺激比熟悉的（社会新奇偏好 [SNP]）^3、4。随后的几项研究提出了使用计算机化^方法5，6自动分析三室测试的方法。

此测试仍然存在几个注意事项。首先，它主要研究社会地点偏好，而不是受试者直接与社会刺激互动的动机，尽管一些群体也测量嗅觉调查（嗅探）时间，要么^手动7，要么使用商业计算机系统8，9，10。其次，三室测试主要用于测量受试者在每个腔室中花费的总时间，而忽略了行为动力学。最后，它仅依赖于社会行为的一个方面，即受试者在每个腔室中花费的时间（或嗅探时间，如果测量的话）。

在这里，我们提出了一个新颖和负担得起的实验系统，是三室装置的替代品。它还允许在解决上述警告时执行相同的行为测试。所呈现的行为系统自动直接测量啮齿动物对两种刺激的调查行为。此外，它还以独立于观察者的方式分析行为动力学。此外，该系统测量多个行为参数，并在个体和人口层面分析这些参数;因此，它支持在每次测试中对社会行为及其动态进行严格分析。此外，在各种测试阶段，在竞技场对面角落随机重新定位腔室可抵消空间记忆或偏好的任何影响。这一制度还可用于其他歧视测试，如性别歧视。定制设备易于生产，分析系统可作为开放源代码公开访问，因此允许在任何实验室中使用。在社会偏好和社会新奇偏好测试中，我们证明了该系统能够测量具有不同毛皮颜色的啮齿动物菌株的社会行为的多个参数。我们还验证了系统在操作（如胡须修剪）后揭示啮齿动物社会行为的修正动态的能力。

TrackRodent软件:在MATLAB（2014a-2019a）中编写了三种算法，以跟踪实验对象及其与刺激物的相互作用。所有算法都存入 GitHub，在 。所有四种算法的主要目的是跟踪受试者身体的轮廓，以检测与刺激区域的任何直接接触。

基于身体的算法:此算法有三个版本，用于跟踪白色背景上未连接的暗鼠标（基于 BlackMouseBody）的轮廓、黑暗背景上的白色鼠标（基于白鼠体）或深色背景上的白鼠（基于白鼠体）的轮廓).该软件的图形用户界面 （GUI） 要求实验者使用鼠标或大鼠选择实验，然后选择正确的代码。对于算法的每个版本，有两个可选代码:一个在执行分析时在屏幕上显示跟踪过程，另一个不执行（因此，它运行得更快，称为"快速"）。例如，基于 BlackMouseBody 的算法的相关代码的名称是:"BlackMouseBodyBased23_7_14"和"BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast"。以"快速"结尾的所有算法不会联机显示跟踪，用户必须将数据直接保存到结果文件 （.mat 文件）。所有基于身体的算法都需要设置单个阈值（软件 GUI 中的"低阈值"）来检测主体的身体。

基于头部方向的算法:第二种算法，仅适用于黑小鼠，基于基于身体的算法，此外还确定头部的方向性。该算法检测受试者头部与"刺激"区域的相互作用，从而避免因受试者与这些区域的随机接触而出现的误报。该算法定义了小鼠体轮廓的两个检测阈值:高阈值（包括黑鼠的较亮尾部）和低阈值，包括无尾体。此后，该算法使用较低的阈值将椭圆体拟合到检测到的边界，并定义鼠标头和尾部的位置（两者之间没有区别）。尾部和头部之间的最终区分基于较高阈值定义的边界。

有线动物算法:第三种算法旨在最大限度地减少与动物相连的电缆（即电线或光纤）产生的伪影，从而允许在连接到电缆时分析动物的行为。此算法仅对黑鼠和白鼠具有代码。大鼠的代码要求实验者定义低阈值和高阈值，而鼠标代码只需要低阈值。

Protocol

所有所述方法均已获得海法大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 实验设置

1. 竞技场
   1. 通过在声学室（60 厘米 x 65 厘米 x 80 厘米，由 2 厘米厚的木头涂层内侧 2 厘米厚泡沫）中间放置一个白色或黑色（取决于动物的颜色）有机玻璃盒（37 厘米 x 22 厘米 x 35 厘米），为小鼠建造实验竞技场（图 1A，D）。对于光线，请取下隔音室（门外）泡沫的条带（宽 2 厘米，比腔室天花板低 10 厘米），并连接带有红色或白色灯泡的 LED 条。确保舞台周围的光线尽可能均匀，以防止反射。
   2. 为大鼠建造与上述老鼠相似的竞技场，其尺寸与斯普拉格-道利（SD）大鼠大小相当（图1G）。将黑色有机玻璃盒（50 厘米 x 50 厘米 x 40 厘米）放在声学室的中间（90 厘米 x 60 厘米 x 85 厘米，由 2 厘米厚的木材制成，内侧涂有 2 厘米厚的泡沫）。
2. 室
   1. 对于小鼠，从 6 mm 厚的有机玻璃创建两个黑色或白色（取决于毛皮颜色）三角形室（12 厘米等腰，35 厘米高，地板关闭）。将它们定位在竞技场的两个随机选择的相反角落（图1B，E）。使用环氧胶在每个腔室的下部粘住金属网（18 毫米 x 6 厘米;1 厘米 x 1 厘米孔），以便通过网格与刺激直接相互作用（图 1C，F）。标记每个房间的方式，允许在视频中从其他人的歧视，而不给受试者提供线索（参见图1B，E的例子）。
      注:每个房间最终将包含一个社会刺激（鼠标）或对象（塑料玩具，5厘米x5厘米x5厘米，具有独特的形状和颜色;图 1C，I inset）。让环氧胶的气味在使用前至少蒸发一周。
   2. 对于大鼠，创建两个黑色三角形室（20.5 厘米等腰，40 厘米高，由 6 毫米厚的有机玻璃制成，地板关闭），并将其放置在竞技场的两个随机选择的对面角落（图 1H），每个房间都有金属网（25 厘米 x 7 厘米;2.5 厘米 x 1 厘米孔）覆盖其下部（图 1I）。
3. 将配备广角镜头的高品质单色摄像机放置在声室顶部，并将其连接到计算机，以便使用商业软件清晰查看和记录受试者的行为（有关建议，请参阅材料表）。

2. 行为范式

注:步骤 2.1-2.7 描述了小鼠的行为范式。有关大鼠的具体说明，请参阅第 2.8 节。

1. 在开始行为实验之前，确保所有动物（受试者:2-4个月大的雄性小鼠;刺激:21-30天幼鼠）在实验室中至少停留1小时。
2. 适应期之后，在两个相反的角落随机插入两个空腔进入竞技场。将主题放在竞技场中间15分钟。在这段时间里，把两个社会刺激，每个位于一个不同的房间，位于一个习惯的舞台。将物体（塑料玩具，5 厘米 x 5 厘米 x 5 厘米，形状和颜色不同）放在另一个房间。
3. 要执行社交首选项 （SP） 测试，请启动视频录制并保持录制，直到测试结束。
4. 取出两个空腔，并立即插入对象和一个社会刺激，每个在一个不同的腔室。在习惯期间空的竞技场的对面角落随机定位这些腔室。允许受试者在 SP 测试的 5 分钟内与刺激物相互作用。测试结束时，停止录制。
5. 在 SP 测试后，从竞技场上取下含有刺激物的腔室，并将主体留在空竞技场中 15 分钟。用 10% 乙醇湿巾从外部清洁腔室。
6. 要执行社会新奇偏好（SNP）测试，开始视频录制，并将两个房间插入竞技场:一个包含用于SP测试的相同社会刺激（熟悉的刺激），另一个包含新的社会刺激。将这些腔室随机放置在竞技场的两个相对角落，确保这些位置不用于 SP 测试。允许受试者在SNP测试的5分钟内与刺激物相互作用。
7. 在SNP测试结束时，停止录像，将主体和房间从竞技场上移开，并将主体放回其家庭笼子。将刺激物留在腔室中进行下一个实验（与另一个受试者一起），或将其送回家中的笼子。用自来水清洁竞技场和房间，然后使用10%乙醇，然后晾干。
8. 大鼠的行为范式
   1. 对于大鼠，重复步骤2.1-2.7中描述的行为范式，进行两个修改:1）在实验前处理大鼠受试者，并习惯将社会刺激性2天（每天10分钟）习惯到腔室;2） 将SP测试延长15分钟，使大鼠在社会刺激下接触的时间更长。稍后，将 SP 测试的分析限制在初始 5 分钟。
      注:至少需要一个竞技场和五个会议厅才能运行一个会话。

3. 使用跟踪 RODENT GUI 进行行为分析

注:有关跟踪控制 GUI，请参阅图 2A的上部面板。

1. 打开 MATLAB（使用 2014a-2019a 测试），然后选择 TrackRodent 文件夹。
2. 通过右键单击每个文件夹并选择"添加到路径"，将所有子文件夹添加到工作路径 |选定的文件夹和子文件夹。
3. 在命令窗口中键入 TrackRodent，然后按 Enter。
4. 通过选择加载会话文件（AVI） 上传单个文件或多个视频文件（AVI 或 MP4 格式）。
5. 允许逐帧检查视频剪辑的影片检查器将立即为列表中的第一个文件打开（图 2A）。使用它检查视频剪辑并定义要分析的段的第一帧和最后一帧。记录这些帧的数量，稍后需要这些帧。完成后关闭窗口。
6. 要检查其他视频文件，可按"检查影片"并选择特定视频文件，随时打开视频检查器。
7. 选择测试的物种（鼠标或小鼠;默认为鼠标）。
8. 根据主体和竞技场的颜色（黑色或白色），排除可能中断跟踪的所有区域。
   1. 要排除给定区域，请按"排除区域"，在光标变为交叉形状后，标记区域的所有角以进行排除。完成后，右键单击鼠标，然后双击标记区域的中心。排除的区域将在屏幕上变为红色阴影。重复此过程以根据需要排除尽可能多的区域。
9. 要从排除中删除区域，请按"删除排除区域"，然后（使用交叉光标）单击要从排除中删除的区域。
10. 要将每个腔室定义为"刺激"区域，为了由受试者自动检测其调查，请选中相应的框，然后按"刺激 X"（其中"X"表示 1、2 或 3），选择"刺激"区域的形状，即多边形或椭圆形。标记"刺激"区域与排除区域类似，然后这些区域将变为黄色。要更改特定"刺激"区域的位置，请再次按刺激 X 并标记新区域位置（这将自动更新该位置）。
    注:以一致的方式为所有文件选择不同的刺激编号（即所有 SP 测试文件作为刺激 1 的对象）。
11. 要跟踪主体在竞技场内特定虚拟隔间中的存在，请选择"隔间"区域（多边形或椭圆形）的形状，然后按"隔间 X"（其中"X"表示 1、2、3、4 或 5）。标记"隔离区"区域，类似于排除区域或刺激区域，然后这些区域将变为蓝色。要更改特定"隔离区"区域的位置，请再次按"隔离室 X"并标记新的区域位置（这将自动更新位置）。
12. 从列表中选择所需的算法（基于 BlackMouseBody 用于视频）（参见图 2B中的可用算法）。
13. 在 GUI 的相应编辑框中写入分析的起始帧和结束帧数。
14. 选择检测主体体的阈值。
    注:大多数算法仅使用"低"阈值，而基于头部方向的算法也使用"高"阈值。对于"低"阈值，选择包含没有尾巴的小鼠/大鼠体的级别（尽可能），而"高"阈值也应包括尾部。在使用基于头部方向性的算法的情况下，软件将确定头部位置与尾部位置相反。
    注:软件稍后将忽略使用所选阈值检测到的小对象。
15. 要评估给定阈值的主题边框的自动检测，请将值插入相关阈值字段，然后按键盘上的 Enter。
16. 选择多个文件时，请移动到下一个文件（使用顶部的"下一步"按钮），并为每个文件选择适当的定义。完成后，使用 GUI 顶部的"上一个"和"下一个"按钮，通过在文件之间移动来验证所有文件的参数和区域位置。
    注:所有区域和参数的定义特定于给定文件。
17. 要启动所有选定文件的行为分析，请移动到第一个文件，然后按"开始"。
18. 在分析结束时，将为每个影片在影片文件的同一目录中保存结果文件 （.mat 文件）。
    注:如果使用算法的慢速（非快速）版本，它还将保存带有身体质量中心白色十字的电影版本，该十字将更改其颜色，除非未选中 GUI的"保存分析影片切换按钮"，否则将更改其颜色。此版本的影片（保存在同一目录中，与原始影片同名，后缀为"分析影片"）可以脱机使用，以评估系统执行的自动检测的质量。

4. 使用跟踪 RODENT GUI 进行结果演示

注:有关结果演示，请参阅图 2A的下部面板。

1. 要检查每个影片文件的结果，请按 Load 结果文件并选择行为分析生成的 .mat 文件。
2. 在切换按钮之间移动以检查屏幕上的任何以下分析:鼠标位置跟踪（图 2A）;会话期间的隔间占用（如果定义了"隔间"，未显示）;随会话进行刺激性探索（图2C）;隔间总时间（如果定义了"隔间"，未显示）;和总刺激探索时间（图2D）。
   注:"刺激"区域是软件评估主体交互的区域，而"活动"区域是软件跟踪主题存在的区域。使用"停止分析"按钮停止分析将自动保存生成的结果，直到最后一个分析帧。对于大多数计算机，应该可以一次上传和分析多达 20 部电影（具体取决于计算机性能）。

5. 使用跟踪研究人口汇总 GUI 进行人口分析 （图 2E）

1. 打开 MATLAB（使用 2014a-2019a 测试），然后选择 TrackRodent 文件夹。
2. 在命令窗口中键入跟踪控制填充汇总，然后按"输入"。
3. 上传多个TrackRodent结果文件（.mat格式）按选择结果文件。
4. 填写最后一帧的数字进行分析，测试名称，刺激1名称，和刺激2名称。
5. 通过选中所有适当的框，从可选分析列表中选择所需的分析。
6. 通过选中相应的框将选中的分析的所有结果提取为单个电子表格文件，选择"导出到 speadsheet 的结果"。
7. 按"开始"并等待分析完成。
   注:分析到此结束。该软件可用于分析尽可能多的电影文件的结果，因为他们都使用TrackRodent软件的行为分析。该软件执行的分析假定视频录制帧速率为 30 Hz。在使用不同的帧速率的情况下，将时间乘以 30，再除以用于录制的帧速率，以将其转换为正确的值 （s）。

Results

在C57BL/6J小鼠中使用系统进行社会偏好测试
图 1显示了实验设置的三个版本。第一个版本（图1A-C）是为深色毛皮颜色的小鼠设计的，如C57BL/6J小鼠。第二个（图1D-F）计划用于毛皮颜色鲜艳的小鼠，如BALB/c或ICR（CD-1）小鼠。第三个较大（图1G-I），专为毛皮颜色鲜艳的大鼠（如SD大鼠）设计。第一批被检查的受试者是天真的成年人（8-12周大），组住（每个笼子2至5只动物）雄性C57BL/6J小鼠。社会刺激是青少年（21-30天），集体安置（每个笼子2至6只动物），雄性C57BL/6J小鼠。对象刺激是无味塑料玩具，颜色不同（

Discussion

这里描述的实验系统，它被设计为三室^装置2，5的替代，允许性能相同的测试，同时解决它的一些局限性。三角形室位于矩形竞技场的两个相对角落，将主体-刺激相互作用区域限制在定义良好的平面上，从而能够对调查行为进行精确的自动分析。一个优点是使用分析软件 （TrackRodent） 为每个测试计算多个行为参数。它还允许在范式的各个阶段将腔室重新定位到竞技场的随机相反的角落，从而抵消空间导航技能的任何影响。

此外，竞技场的两个角落，在每个阶段都是空的，为受试者提供了一个休息和梳理的便利场所，并将其从房间中拉开，最大限度地减少了误报结果。因此，该系统允许直接评估受试者在SP和SNP测试期间调查每种刺激的动机。此外，由于视频的行为分析由 TrackRodent 软件以自动方式完成，因此实验者可以加载多个影片进行分析，为每个影片定义正确的参数，并让软件过程一夜之间完成，从而节省宝贵的时间。值得注意的是，该系统可用于任何类型的社会歧视测试，例如男女之间的社会刺激歧视或不同菌株的刺激。此外...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1.3 MP 单色 USB3 Vision	FLIR（以前称为 PointGrey）	FL3-U3-13Y3M-C	单色相机
FlyCap 2.0	FLIR（以前称为 PointGrey）	FlyCapture 2.13.3.61X64	视频录制软件
首页 5 分钟 环氧树脂胶	Devocon	20845	用于将金属网粘合到Plexiglas刺激室
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	编程环境
Plexiglas 板（6 mm 厚黑色或白色）	Melina （1990） LTD， Israel	NaN	用于竞技场和刺激室建设
红色 LED 灯条（每米 60 个 LED）连接到 12 V 电源	2012topdeal eBay 供应商	NaN	用于声室照明