一种用于追踪小型啮齿类动物社会偏好行为动态的系统

摘要

本文介绍了一种新型的自动化实验系统，该系统为三室实验提供了一种替代方案，并解决了多个现有局限性。该系统可提供多种行为学参数，从而在社交偏好和社会新颖性偏好测试期间，实现对小型啮齿类动物行为动态的严格分析。

摘要

探索社会行为的神经生物学机制需要采用无偏且独立于观察者的动物模型行为学测试方法。自21世纪初以来，三箱实验已被广泛用作评估小型啮齿类动物社会性（社交偏好）和社会新颖性偏好的标准范式。然而，该实验存在多种局限性，包括对空间导航能力的依赖以及对行为动态变化的忽视。本文介绍并验证了一种新型实验系统，该系统可作为三箱实验的替代方案，同时解决了其部分缺陷。该系统仅需简单且成本较低的实验装置，以及公开可用的开源分析系统，能够自动测量和分析个体及群体水平上的多种行为参数。它允许对小型啮齿类动物在任何社会辨别测试过程中的行为动态进行详细分析。我们展示了该系统在分析成年雄性小鼠和大鼠进行社交偏好与社会新颖性偏好测试时社会行为动态方面的有效性。此外，我们验证了该系统在检测实验操作（如胡须修剪）后啮齿类动物社会行为动态改变方面的能力。因此，该系统支持对小型啮齿类动物模型中的社会行为及其动态进行严谨研究，并有助于在不同品系、条件和处理之间进行更精确的比较。

引言

揭示神经发育障碍（NDDs）背后的生物学机制是神经科学领域面临的主要挑战之一¹。应对这一挑战需要采用能够以标准化且无偏倚的方式表征啮齿类动物行为的行为范式和实验系统。十多年前，Moy 及其同事发表的一项具有影响力的研究²提出了三室实验。自那时起，该实验被广泛用于研究 NDDs 啮齿类动物模型中的社会行为。该实验评估啮齿类动物的两种先天倾向：1）倾向于停留在社会刺激附近而非物体附近（社会性，也称为社会偏好 [SP]）；2）倾向于停留在新异社会刺激附近而非熟悉的社会刺激附近（社会新异性偏好 [SNP]）^3,4。随后的多项研究提出了利用计算机化方法对三室实验进行自动化分析的技术^5,6。

该实验仍存在若干局限性。首先，它主要检测的是社会性位置偏好，而非受试对象与社会性刺激直接互动的动机，尽管有些研究团队也会测量嗅探（嗅觉探究）时间，可通过手动⁷或使用商业化的计算机系统^8,9,10进行。其次，三室实验主要用于测量受试对象在各个腔室中停留的总时间，而忽略了行为动态的变化过程。最后，该实验仅依赖于社会行为的一个方面，即受试对象在各腔室中停留的时间（或若进行测量时的嗅探时间）。

本文介绍了一种新颖且经济的实验系统，可作为三室装置的替代方案。该系统能够执行相同的行为学测试，同时克服了上述局限性。所介绍的行为学系统可自动且直接地测量啮齿类动物对两种刺激的探究行为，并以观察者无关的方式分析行为动态。此外，该系统可测量多种行为参数，并在个体和群体水平上进行分析，从而支持对每次测试中社会行为及其动态的严格分析。进一步地，在不同测试阶段将实验箱随机放置于场地对角位置，可消除空间记忆或空间偏好的影响。该系统也可用于其他辨别测试，例如性别辨别。该定制装置易于制作，分析系统以开源代码形式公开提供，可在任何实验室中使用。我们展示了该系统在社会偏好和社会新颖性偏好测试中，测量具有不同毛色的啮齿类品系社会行为多种参数的能力。我们还验证了该系统在诸如胡须修剪等干预操作后，揭示啮齿类动物社会行为动态改变的能力。

TrackRodent 软件：使用 MATLAB（2014a-2019a）编写了三种算法，用于追踪实验动物及其与刺激物的相互作用。所有算法均已存入 GitHub，地址为 <https://github.com/shainetser/TrackRodent>。这四种算法的主要目标均为追踪动物身体轮廓，以检测其与刺激区域之间的直接接触。

基于身体的算法：该算法包含三个版本，分别用于追踪在白色背景上的未标记黑色小鼠（BlackMouseBodyBased）、在暗色背景上的白色小鼠（WhiteMouseBodyBased），或在暗色背景上的白色大鼠（WhiteRatBodyBased）的轮廓。软件的图形用户界面（GUI）要求实验者首先选择使用小鼠或大鼠的实验，然后选择正确的代码。每个算法版本均提供两个可选代码：一个在分析过程中实时显示追踪过程，另一个则不显示（因此运行速度更快，称为"fast"）。例如，BlackMouseBodyBased算法对应的相关代码名称为："BlackMouseBodyBased23_7_14" 和 "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast"。所有以"fast"结尾的算法均不显示在线追踪过程，用户必须直接将数据保存至结果文件（.mat文件）。所有基于身体的算法均需设置单一阈值（在软件GUI中称为"low threshold"），以检测受试动物的身体区域。

基于头部方向性的算法：第二种算法仅适用于黑色小鼠，该算法在基于身体的算法基础上，进一步确定头部的方向性。该算法能够检测受试小鼠头部与"刺激物"区域的交互作用，从而避免因受试动物身体随机接触这些区域而产生的假阳性结果。在此算法中，定义了两个用于检测小鼠身体轮廓的阈值：高阈值包含黑色小鼠较明亮的尾巴部分，低阈值则仅包含身体而不包含尾巴。随后，算法利用低阈值对检测到的边界拟合一个椭球体，并确定小鼠头部和尾部的位置（此时尚未区分头与尾）。最终对尾部与头部的区分则基于高阈值所定义的边界来完成。

有线动物算法：第三种算法旨在最小化因连接到动物身上的线缆（即电线或光纤）所引起的伪影，从而允许在动物连接线缆的情况下分析其行为。该算法仅针对黑鼠和白鼠提供了代码。其中，大鼠的代码需要实验者设定低阈值和高阈值，而小鼠的代码仅需设定低阈值。

方案

所述所有方法均已获得海法大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 实验设置

1. 实验场地
   1. 通过将一个白色或黑色（根据动物毛色选择）的有机玻璃箱（37 cm × 22 cm × 35 cm）放置于声学隔离室（60 cm × 65 cm × 80 cm，由2 cm厚的木板制成，内壁覆盖2 cm厚的泡沫材料）中央，构建小鼠实验场地（图1A,D）。为提供照明，在声学室顶部下方10 cm处，沿四周（门除外）移除一圈2 cm宽的泡沫条，并安装一条带有红色或白色LED灯泡的灯带。确保光照在实验场地周围尽可能均匀，以避免产生反光。
   2. 大鼠实验场地的构建方式与上述小鼠场地类似，但尺寸需适配Sprague-Dawley（SD）大鼠的体型（图1G）。将一个黑色有机玻璃箱（50 cm × 50 cm × 40 cm）置于声学隔离室（90 cm × 60 cm × 85 cm，由2 cm厚木板制成，内壁覆盖2 cm厚泡沫材料）中央。
2. 隔间
   1. 针对小鼠，使用6 mm厚的黑色或白色（根据毛色选择）有机玻璃制作两个等腰三角形隔间（底边12 cm，高35 cm，底部封闭），并将其放置于场地中两个随机选择的对角角落（图1B,E）。使用环氧树脂胶在每个隔间下部固定一块金属网（18 mm × 6 cm，孔径1 cm × 1 cm），以便实验动物可通过网格与刺激物直接互动（图1C,F）。对每个隔间进行标记，使其在视频中可被区分，但不会向受试动物提供线索（参见 图1B,E 示例）。
      注意：每个隔间最终将分别放置一个社交刺激物（小鼠）或一个非社交物体（塑料玩具，5 cm × 5 cm × 5 cm，具有独特形状和颜色；参见 图1C,I 插图）。 使用前需让环氧树脂胶的气味至少挥发一周。
   2. 针对大鼠，制作两个黑色等腰三角形隔间（底边20.5 cm，高40 cm，由6 mm厚有机玻璃制成，底部封闭），并将其放置于场地中两个随机选择的对角角落（图1H），每个隔间下部覆盖一块金属网（25 cm × 7 cm，孔径2.5 cm × 1 cm）（图1I）。
3. 在声学隔离室顶部安装一台配备广角镜头的高质量单色摄像机，并将其连接至计算机，以便使用商业软件清晰观察和记录受试动物的行为（参见 材料表 获取推荐设备）。

2. 行为范式

注意：步骤 2.1-2.7 描述了小鼠的行为范式。有关大鼠的具体操作说明，请参见第 2.8 节。

1. 确保所有实验动物的笼子（实验对象：2-4月龄雄性小鼠；刺激物：21-30日龄幼年小鼠）在开始行为学实验前至少在实验室内放置1小时。
2. 适应期结束后，随机将两个空腔室插入开放区域的两个对角角落。将实验对象置于开放区域中央，进行15分钟的适应。在此期间，将两个社交刺激物分别放入位于开放区域外的两个不同腔室内进行适应。将一个物体（一个具有明显形状和颜色的塑料玩具，5 cm × 5 cm × 5 cm）放入另一个腔室中。
3. 进行社交偏好（SP）测试时，开始视频录制，并持续录制至测试结束。
4. 移除两个空腔室，立即插入装有物体和其中一个社交刺激物的两个腔室，每个腔室分别放置一种刺激物。将这两个腔室随机放置在适应阶段为空的开放区域的两个对角角落。允许实验对象与刺激物相互作用5分钟以完成SP测试。测试结束后，停止录制。
5. SP测试结束后，从开放区域中移除含有刺激物的腔室，让实验对象在空的开放区域内停留15分钟。 用10%乙醇湿巾清洁腔室外表面。
6. 进行社交新颖性偏好（SNP）测试时，开始视频录制，并将两个腔室插入开放区域：一个腔室中放置SP测试中使用过的同一社交刺激物（熟悉刺激物），另一个腔室中放置新的社交刺激物（新颖刺激物）。将这两个腔室随机放置在开放区域的两个对角角落，确保这些 位置 在SP测试中未被使用过。允许实验对象与刺激物相互作用5分钟以完成SNP测试。
7. SNP测试结束后，停止视频录制，将实验对象和腔室从开放区域中移出，并将实验对象放回其原居住笼。将刺激物保留在腔室内用于下一次实验（更换新的实验对象），或将其送回原居住笼。用流动水清洗开放区域和腔室，随后用10%乙醇擦拭，晾干备用。
8. 大鼠的行为学实验范式
   1. 对于大鼠，重复步骤2.1–2.7所述的行为学范式，但需进行两项修改：1）在实验前2天每天对大鼠实验对象进行抓取操作，并让社交刺激物在腔室内适应10分钟；2）将SP测试时间延长至15分钟，以使大鼠有更长的社交刺激暴露时间，但在后续数据分析中仅分析前5分钟的行为表现。
      注意：每次实验至少需要一个开放区域和五个腔室。

3. 使用 TrackRodent 图形用户界面进行行为分析

注意：参见图2A的上部面板以查看TrackRodent图形用户界面。

1. 打开 MATLAB（已测试版本为 2014a–2019a），并选择 TrackRodent 文件夹。
2. 通过右键单击每个子文件夹，选择“添加到路径”|“所选文件夹和子文件夹”，将所有子文件夹添加到工作路径中。
3. 在命令窗口中输入 TrackRodent，然后按 Enter 键。
4. 通过选择 加载会话文件（AVI），上传单个文件或多个视频文件（AVI 或 MP4 格式）。
5. 系统将立即为列表中的第一个文件打开一个视频检查器，用于逐帧查看视频片段（图 2A）。使用该工具检查视频片段，并定义待分析片段的起始帧和结束帧。记录这些帧的编号，后续步骤中将需要使用。完成后关闭窗口。
6. 如需检查其他视频文件，可随时点击 检查视频 并选择特定的视频文件，以打开视频检查器。
7. 选择测试的物种（小鼠或大鼠；默认为小鼠）。
8. 根据实验对象和实验区域的颜色（黑色或白色），排除所有可能干扰追踪的区域。
   1. 要排除某一区域，请点击 排除区域，当光标变为十字形后，标记出需要排除区域的所有角点。完成后，右键单击鼠标，然后双击左键选择所标记区域的中心。被排除的区域在屏幕上将显示为红色阴影。重复此操作以排除所需数量的区域。
9. 如需取消某个被排除的区域，请点击 移除被排除区域，然后使用十字光标点击要取消排除的区域。
10. 为实现系统自动检测实验对象对特定区域的探究行为，需将每个腔室定义为“刺激”区域。首先选择“刺激”区域的形状（多边形或椭圆形），然后点击 刺激 X（其中 "X" 代表 1、2 或 3）。标记“刺激”区域的方法与排除区域相同，标记后该区域将变为黄色。如需更改某一特定“刺激”区域的位置，再次点击 刺激 X 并标记新的区域位置（系统将自动更新位置）。
    注意：所有文件中应一致地选择不同的刺激编号（例如，在所有 SP 测试文件中将物体设为刺激 1）。
11. 如需追踪实验对象在实验区域内某一特定虚拟区域中的存在情况，请选择“区域”形状（多边形或椭圆形），然后点击 区域 X（其中 "X" 代表 1、2、3、4 或 5）。标记“区域”的方法与排除区域或刺激区域相同，标记后该区域将变为蓝色。如需更改某一特定“区域”的位置，再次点击 区域 X 并标记新的区域位置（系统将自动更新位置）。
12. 从列表中选择所需的算法（本视频使用 BlackMouseBodyBased 算法）（参见 图 2B 中的可用算法）。
13. 在图形用户界面（GUI）的相应编辑框中输入分析的起始帧和结束帧编号。
14. 选择用于检测实验对象身体的阈值。
    注意：大多数算法仅使用 "低" 阈值，而基于头部方向性的算法还会使用 "高" 阈值。对于 "低" 阈值，应选择尽可能包含小鼠/大鼠身体但不包含尾巴的阈值水平；而 "高" 阈值则应同时包含尾巴。若使用基于头部方向性的算法，软件将根据尾部位置确定头部位置。
    注意：软件后续将忽略使用所选阈值检测到的小型物体。
15. 为评估特定阈值下实验对象边界的自动检测效果，请在相应的阈值字段中输入数值，然后按键盘上的 Enter 键。
16. 当选择多个文件时，使用顶部的“下一个”按钮切换至下一个文件，并为每个文件选择适当的定义。完成后，使用 GUI 顶部的“上一个”和“下一个”按钮在各文件间切换，以核对所有文件的参数和区域位置。
    注意：所有区域定义和参数均针对特定文件而设定。
17. 要开始对所有选定文件进行行为分析，请切换至第一个文件，然后点击“开始”。
18. 分析结束后，每个视频文件所在目录中将保存一个结果文件（.mat 文件）。
    注意：如果使用的是非快速版本（即慢速版本）的算法，系统还会保存一个带有白色十字标记的视频版本，该十字标记表示身体质心位置，并在系统判定为探究行为的每一帧中改变颜色，除非 GUI 中的 保存已分析视频 切换按钮处于未选中状态。该视频版本将保存在与原始视频相同的目录中，文件名与原始视频相同，并附加后缀“analyzed movie”，可用于离线评估系统自动检测的质量。

4. 使用 TrackRodent 图形用户界面展示结果

注意：结果展示请参见图2A的下层面板。

1. 要查看每个视频文件的分析结果，请点击“加载结果文件”并选择行为分析生成的 .mat 文件。
2. 通过切换按钮查看屏幕上的以下任一分析结果：小鼠位置轨迹（图 2A）；整个实验过程中各区域的占用情况（若已定义“区域”，本图未显示）；整个实验过程中对刺激物的探索情况（图 2C）；各区域停留总时间（若已定义“区域”，本图未显示）；以及对刺激物探索的总时间（图 2D）。
   注意：“刺激物”区域是指软件用于评估受试动物互动行为的区域，而“区域”则是指软件用于追踪受试动物是否存在的区域。点击停止分析按钮将自动保存至最后一个已分析帧为止的结果。对于大多数计算机，可同时上传并分析多达 20 个视频文件（具体数量取决于计算机性能）。

5. 使用 TrackRodentPopulationSummary 图形用户界面进行种群分析（图 2E）

1. 打开 MATLAB（已测试版本为 2014a–2019a），并选择 TrackRodent 文件夹。
2. 在命令窗口中输入 TrackRodentPopulationSummary，然后按 Enter 键。
3. 通过点击 Choose results files 按钮上传多个 TrackRodent 结果文件（.mat 格式）。
4. 填写 Last frame for analysis、Test name、Stimulus 1 name 和 Stimulus 2 name 的数值。
5. 从可选分析列表中，勾选所有需要执行的分析项目。
6. 勾选相应的复选框以选择“将结果导出到电子表格”，从而将所选分析的所有结果提取为单个电子表格文件。
7. 点击“Start”并等待分析完成。
   注意：至此分析过程结束。只要视频文件已使用 TrackRodent 软件完成行为学分析，本软件即可用于分析任意数量的视频文件结果。软件默认视频录制帧率为 30 Hz；若使用了不同的帧率，请将时间乘以 30 再除以实际录制帧率，以转换为正确的时间值（s）。

结果

在C57BL/6J小鼠中使用系统进行社交偏好测试
图1展示了三种实验装置版本。第一种版本（图1A-C）适用于毛色较深的小鼠，例如C57BL/6J小鼠；第二种版本（图1D-F）适用于毛色较浅的小鼠，例如BALB/c或ICR（CD-1）小鼠；第三种版本尺寸更大（图1G-I），适用于毛色较浅的大鼠，例如SD大鼠。最初测试的实验对象为未经处理的成年雄性C57BL/6J小鼠（8–12周龄），每笼饲养2至5只。社交刺激物为幼年雄性C57BL/6J小鼠（21–30日龄），每笼饲养2至6只。物体刺激物为无味的彩色塑料玩具（见图1C,I<...

讨论

本文描述的实验系统旨在作为三室装置^2,5的替代方案，可在执行相同测试的同时克服其部分局限性。该系统采用三角形小室，置于矩形实验 arena 的两个对角位置，将受试动物与刺激物的交互区域限制在一个明确定义的平面内，从而实现对探究行为的精确自动化分析。其中一个优势是可使用分析软件（TrackRodent）计算每次测试的多种行为参数。此外，该系统还允许在实验范式的不同阶段将小室随机放置于 arena 的不同对角位置，从而消除空间导航能力对实验结果的影响。

此外，测试过程中每个阶段均保持空置的两个角落为受试动物提供了方便的休息和理毛区域，使其远离实验隔间，从而最大限度地减少假阳性结果。因此，该系统可直接评估受试动物在SP和SNP测试中探究每种刺激物的动机。更重要的是，由于视频的行为学分析由TrackRodent软件以自动化方式进行，实验人员可同时加载多个视频文件，为每个视频设定合适的参数后交由软件过夜处理，从而节省宝贵的时间。值得注意的是，该系统可用于各种类型的社会识别测试...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Flea3 1.3 MP Mono USB3 Vision	FLIR (原 PointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	单色相机
FlyCap 2.0	FLIR (原 PointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	视频录制软件
Home 5 分钟环氧树脂胶	Devocon	20845	用于将金属网粘接到亚克力刺激室上
Matlab 2014–2019	MathWorks	R2014a – R2019a	编程环境
亚克力板（6 mm 厚，黑色或白色）	Melina (1990) LTD，以色列	NaN	用于构建实验 arena 和刺激室
红色 LED 灯带（每米 60 个 LED），连接至 12 V 电源	2012topdeal eBay 供应商	NaN	用于声学室的照明