本文介绍了一种利用市售微孔培养系统可重复地生成具有睾丸特异性组织结构的猪睾丸类器官的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
类器官是由多种细胞类型组成的三维结构，能够模拟体内器官的组织结构和功能。类器官的形成开辟了基础研究和转化研究的多种途径。近年来，睾丸类器官在男性生殖生物学领域引起了广泛关注。睾丸类器官可用于研究细胞间相互作用、组织发育以及生殖细胞微环境，并有助于高通量的药物筛选和毒性检测。目前亟需一种能够稳定、可重复地生成具有睾丸特异性组织结构的类器官的方法。微孔培养系统包含密集排列的金字塔形微孔阵列。将来自青春期前睾丸的睾丸细胞离心进入这些微孔中进行培养，可形成具有睾丸特异性组织结构和细胞排列的类器官。通过该方法可生成数千个均一的类器官。本文所报道的实验方案将对从事男性生殖研究的科研人员具有广泛的应用价值。
引言
近年来，人们对三维（3D）类器官重新产生了浓厚兴趣。已有研究成功建立了肠道1、胃2、胰腺3,4、肝脏5和脑6等不同器官的三维类器官系统。这些类器官在结构和功能上均与体内真实器官具有相似性，相较于单层细胞培养系统，更适用于组织微环境的生物学研究7。因此，睾丸类器官也逐渐引起关注8,9,10,11,12。目前报道的大多数方法较为复杂，通量低10，且需要添加细胞外基质（ECM）蛋白8,10，这增加了实验的复杂性，也导致可重复性差。因此，亟需一种简单且可重复的方法，以生成细胞相互作用方式类似于体内睾丸的....
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方案
注意：1周龄仔猪的睾丸来自商业养猪场，作为商品猪去势手术的副产品获得。睾丸的获取已获得卡尔加里大学动物护理委员会的批准。
1. 组织消化用酶溶液的制备
注意：需要三种不同的酶溶液，包括两种不同的胶原酶IV溶液（溶液A、B）和一种脱氧核糖核酸酶I（DNase I）溶液。
- 配制溶液A：将20 mg胶原酶IV S（材料表）和40 mg胶原酶IV W（材料表）溶解于25 mL高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，然后用0.22 µm滤器过滤除菌。向溶液A中加入0.4 mL胎牛血清（FBS），以抑制胰蛋白酶活性。
- 配制溶液B：将80 mg胶原酶IV W（材料表）溶解于40 mL DMEM中，然后用0.22 µm滤器过滤除菌。
- 配制DNase I溶液（7 mg/mL）：将70 mg DNase I溶解于10 mL DMEM中，然后用0.22 µm滤器过滤除菌。
注意：此处所述胶原酶IV溶液的酶浓度与原始文献14中所述浓度（2 mg/mL）不同。本方案获得的细胞活力略高，但两种方案分离的细胞均可形成具有相同组织结构的类器官。
2....
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结果
来自1周龄猪睾丸的分离细胞在微孔中培养后可自组织形成球状结构（图1A、图2），具有界限清晰且分隔明显的外部（生精上皮）和内部区域（间质）（图1B、图2）。这两个区域由一层IV型胶原阳性（collagen IV+ve）的基底膜分隔。UCH-L1+ve 生殖细胞和GATA4+ve 支持细胞位于基底膜上的外部区域（图1B、图2）。α-SMA+ve 管周肌样细胞定位于基底膜内侧，而细胞色素P450+ve 间质细胞则位于.......
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讨论
我们建立了一种简单的方法，能够稳定、可重复地生成大量具有类似于体内睾丸组织结构的睾丸类器官12。尽管该方法最初是利用猪睾丸细胞开发的，但也同样适用于小鼠、非人灵长类动物和人类的睾丸组织12。已有多种不同的方法被报道用于制备睾丸类器官8,9,10,11。Baert 等人通过将成人和青春期前的人类睾丸细胞与来自成人人类睾丸脱细胞后获得的细胞外基质（ECM）共同培养，成功生成了人类睾丸类器官11。尽管该模型未形成明显的睾丸形态结构，但类器官能够分泌睾酮和细胞因子11。Pendergraft 等人报道了另一种人类类器官模型，采用悬滴培养法，利用溶解的睾丸ECM蛋白，所生成的类器官也能够产生睾酮
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披露
Ungrin 博士作为 AggreWell 技术的发明人，对该技术拥有经济利益。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院/儿童健康与人类发展研究所（NIH/NICHD）资助，项目编号 HD091068-01，授予 Ina Dobrinski 博士。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm 超低吸附组织培养皿 | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm 组织培养皿 | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| 防粘附冲洗液 | Stemcell Technologies | #07010 | |
| 来自溶组织梭菌的 IV 型胶原酶 | Sigma-Aldrich | #C5138 | 简称 Collagenase IV S |
| Worthington IV 型胶原酶 | Worthington-Biochem | #LS004189 | 简称 Collagenase IV W |
| 牛胰脱氧核糖核酸酶 I | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 - 高糖 | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| 表皮生长因子 | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon 70 µm 细胞筛 | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon 40 µm 细胞筛 | FisherScientific | #352340 | |
| 胎牛血清 | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Gibco | #41400-045 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| 猪睾丸组织 | Sunterra Farms Ltd (加拿大阿尔伯塔省) | ||
| Steriflip-GP 无菌离心管顶部滤器装置 | Millipore | #SCGP00525 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma | #T4049 |
参考文献
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the ....
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